Bài 1: ĐỊNH TÍNH ACID AMIN BẰNG SẮC KÍ GIẤY I.Mục đích Nắm được cách xác định acid amin bằng sắc kí giấy, từ đó xác định phân biệt, định danh acid amin. II.Nguyên tắc: Dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất tan giữa 2 pha lỏng (pha tĩnh được phun lên giấy và pha động được cuốn từ dưới lên hay từ trên xuống tùy theo cách tiến hành ) không trộn lẫn vào nhau. Dung môi hữu cơ dưới tác dụng của mao quản khi chạy qua phần giấy có chứa dung dịch các acid amin muốn khảo sát thì các aciamin sẽ bị lôi cuốn theo và chuyển theo pha động. Do mỗi một acidamin có một độ phân bố khác nhau giữa hai pha tĩnh và pha động dẫn tới sự di chuyển của chúng theo pha động cũng khác nhau. Vì vậy, kết thúc qua trình sắc kí mỗi loại acidamin sẽ nằm ở vị trí khác nhau, cách nhau khoảng nhất định trên giấy sắc kí. Nếu ta có một acidamin chuẩn, để khảo sát trong mẫu có acidamin đó hay không, ta chỉ việc chấm mẫu và chuẩn trên 2 điểm xuất phát trên tờ giấy sắc kí. Sau một thời gian nếu trên tờ giấy sắc kí có 2 vệt chấm của cấu tử trong mẫu và chuẩn tương đồng nhau. Nếu ta nhuộm màu chúng bằng cách cho phản ứng với 1 phức màu nào đó thì lập tức trên tờ giấy sắc khi xuất hiện 2 vệt màu giống nhau. Các acid amin có tính chất chung là có thể tác dụng ninhydin tạo ra một phức có màu xanh chỉ riêng imnoacid như prolin thì có phức màu vàng và phản ứng này rất nhạy cảm có thể phát hiện ở mức microgam. Quá trình phản ứng tạo ra hợp chất diceto oxihindriden và NH 3 sau đó hai hợp chất này tiếp tục phản ứng tạo ra hợp chất có màu xanh tím. III.Dụng cụ và thiết bị: 1 máy quang phổ soi màu 3 giấy sắc kí 1,2x17cm 1 tủ hút 1 máy sấy tay 1 cân phân tích 1 bình tia 1 1 bóp cao su 1 beacher 50ml 1 pipet 1ml 1 pipet 10ml 3 ống mao quản 5 ống nghiệm có nút cao su gắn móc 1 bình xịt thuốc hiện màu 1 giá để ống nghiệm IV.Hóa chất Ninhydrin 0.5% trong aceton Dung dịch CuSO4 0.05% pha trong cồn 80% Mẫu chuẩn (hòa tan một acid amin mẫu trong 10ml nước.Nếu khó tan có thể đun nóng nhẹ),mẫu khảo sát Dung môi:butanol-acid acetic-nước theo tỉ lệ 4:5:1 V. Tiến hành: 1.Chuẩn bị sắc kí giấy: - Chuẩn bị 3 tờ sắc kí giấy: 1,2x17cm - Ở một đầu sắc kí giấy cách mép 1,5cm kẻ một đừng bút chì theo bề rộng giấy (đường xuất phát). Chấm một điểm giữa đoạn vẽ chì. Cố gắng giữ đầu này thẳng và sạch. - Vẽ một đường bút chì song song và cách vạch xuất phát 10cm. - Dùng ống mao quản chấm một giọt vào vòng tròn. Sấy ngay để giọt vào vòng tròn. Sấy ngay để giọt nước không loang ra khỏi vòng tròn. Chấm khoảng 5 lần, làm như vậy với hai mẫu chuẩn và một mẫu khảo sát. 2.Chạy sắc kí - Dùng pipet cho 1ml dung môi vào ống nghiệm khô. - Móc băng giấy vào nút cao su rồi đậy ống nghiệm sao cho mép dưới của băng giấy nhúm vào dung môi và giữ băng giấy thẳng, không được chạm vào thành ống nghiệm. - Để yên cho dung môi từ từ thấm ngược lên đến vạch 10cm. Sau đó lấy băng giấy ra khỏi ống nghiệm, cho vào tủ hotte chừng 10-12 phút (hoặc sấy trực tiếp) để đuổi dung môi. 2 - Phun đều dung dich ninhydrin 0.5% pha trong aceton lên giấy đã chạy sắc kí. Sấy khô, các vết màu sẽ xuất hiện. Xác định các acid amin có trong mẫu bằng cách so sánh vị trí các vết màu trên sắc kí đồ của dung dịch chuẩn với sắc kí đồ dung dịch mẫu. VI. Kết quả R 1 = 4,5 ; R 2 = 4,8 ; R 3 =4,6 *Nhận xét - Mẫu 1 dịch chuyển nhanh nhất theo tuyến dung môi - Mẫu 2 dịch chuyển chậm nhất theo tuyến dung môi Thu được các vết acid amin khác nhau, bao gồm các vết riêng lẻ và các vết hỗn hợp. Kết quả chỉ mang tính tương đối vì trong quá trình làm thí nghiệm có thể có nhiều sai sót. Mẫu 1: tâm cách điểm xuất phát 4,5cm (màu tím) Mẫu 2: tâm cách điểm xuất phát 4,8cm (màu tím ) Mẫu 3: tâm cách điểm xuất phát 4,6 cm (màu tím) VII. Bàn luận 1.Một số điểm lưu ý khi thực hành: 3 - Cầm mép trên của giấy, dung bút chì vẽ để khi chạy sắc kí khỏi lem màu. - Không cho giấy chạm vào thành ống nghiệm vì nước trong thành làm đường acid amin bị cong. - Dùng giấy sắc kí lớn lợi hơn 3 sắc kí giấy nhỏ vì nó cùng thời gian, dễ dàng hơn. 2. Câu hỏi 2.1. Các acid amin dạng amino acid thường gặp trong thực phẩm gồm 20 acid amin căn bản, đều có cấu tạo chung giống nhau: có nhóm (-COOH), nhóm(-NH 2 ), mạch bên R. 2.2. Phương pháp trên sẽ chính xác khi sử dụng để xác định amino acid vì:các amino acid có tính chất chung là có thể tác dụng ninhydrin tạo phức màu xanh tím chỉ riêng prolin thì có phức màu vàng 2.3. Phương trình phản ứng xảy ra: Acid amin 1 + ninhydrin → diceto oxi-hindriden + NH3 → phức xanh tím Acid amin 2+ ninhhydrin → diceto oxi-hindriden + NH3 → phức xanh tím Acid amin hỗn hợp + ninhhydrin → diceto oxi-hindriden + NH3 → phức xanh tím 2.4. Ý nghĩa thực tiễn của thí nghiệm: Qua thí nghiệm ta thấy được hàm lượng acid amin của mỗi loại trong hỗn hợp khác nhau là khác nhau. Đồng thời, thí nghiệm giúp sinh viên nắm vững được kiến thức cơ bản cách định lượng acid amin bằng phương pháp sắc kí giấy. 4 Bài 2: XÁC ĐỊNH PROTEIN THÔ TRONG THỰC PHẨM I.Mục đích Nắm được cách xác định được hàm lượng nitơ toàn phần, từ đó tính được protein thô có trong mẫu thực phẩm. II.Nguyên tắc 1. Vô cơ hóa mẫu: Mẫu được vô cơ hóa bằng H 2 SO 4 đậm đặc ở nhiệt độ cao với chất xúc tác. Các chất chứa nitơ → (NH 4 ) 2 SO 4 2. Cất đạm: Dùng dung dịch NaOH đuổi NH 3 ra khỏi dung dịch: (NH 4 ) 2 SO 4 + 2NaOH → Na 2 SO 4 + 2NH 3 + H 2 O NH 3 bay sang bình hứng có chứa dung dịch H 2 SO 4 đã biết trước nồng độ, thể tích: NH 3 + H 2 O → NH 4 OH 2NH 4 OH + H 2 SO 4 → (NH 4 ) 2 SO 4 +H 2 O 3. Định phân lượng H 2 SO 4 dư bằng dung dịch NaOH, từ đó ta xác định được lượng H 2 SO 4 đã phản ứng và tính được hàm lượng nitơ tổng có trong mẫu: H 2 SO 4 + 2NaOH → Na 2 SO 4 + 2H 2 O III. Dụng cụ và thiết bị 1 bộ Microkjeldahl 1 bình kjeldahl,giá đỡ bình 1 bếp điện,1 lưới amiang 1 bếp đun bình cầu 1 burette 25ml 1 giá đỡ burette 5 1 pipet 10ml 3 erlen 250ml 1 erlen 100ml 1 bình định mức 100ml 1 becher 250ml 1 bóp cao su 1 phễu thủy tinh nhỏ VI. Hóa chất Mẫu thực phẩm dung dịch H 2 SO 4 đậm đặc,K 2 SO 4 ,CuSO 4 Dung dịch phenolphtalein 1% trong etanol 90% Chỉ thị MR 1% Dung dịch H 2 SO 4 0.01N Dung dịch NaOH 30% 6 Kiểm tra các van 1,4 Mở van 1 Châm nước 2/3 bình đun (2) Đun bình Lắp bình (8) chứa 25ml H 2 SO 4 0,1N + 3 giọt MR 1% vào ống sinh hàn Mở van (4) Đổ 10ml mẫu + 5 giọt pp + NaOH 30% (+2ml) vào (9) Khóa van và đổ nước vào phễu Sau 20ph, đem bình huẩn độ bằng NaOH 0,1N dung dịch chuyển sang màu vàng V. Tiến hành: VI. Kết luận: Định lượng dung dịch H2SO4 dư hết 38,4 ml NaOH 0,1N - Mẫu trắng : 47,6 ml 7 *Tính kết quả Ta có: N tr =0,1N V tr =47,6 ml N th = 0,1N V th = 38,4 ml m = 3g Nitơ toàn phần (%) =(0.014 ×(N tr× V tr -N th× V th )×100)/(V×d) = (0,014×(N tr× V tr -N th× V th )×100)/m = (0,014×(0,1×47,6-38,4×0,1)×100)/3 = 0,4293% Hàm lượng protein thô (%) =(nitơ toàn phần) × k = 0,4293 × 6,25= 2,6831% Trong đó: • Ntr: nồng độ đương lượng của dung dịch H 2 SO 4 cho vào bình hứng. • Vtr: số ml H 2 SO 4 0.1N cho vào bình hứng để kết hợp với NH 3 . • Nth: nồng độ đương lượng của dung dịch NaOH dùng để chuẩn độ (=0.1N). • Vth: số ml NaOH 0.1N dùng để chuẩn độ H 2 SO 4 thừa. • V: thể tích mẫu thử tính bằng ml. • d: khối lượng riêng của 1 ml dung dịch cần xác định (nếu mẫu là chất rắn thì thay V.d= m bđ khối lượng ban đầu). VII. Bàn luận: 1. Một số điểm lưu ý: - Rửa kĩ các van trước và sau khi làm vì sút dễ tác dụng với thủy tinh làm cứng van - Luôn để NaOH trong bình cất dư vì NaOH dư sẽ chuyển tất cả (NH 4 ) 2 SO 4 thành NH 3 . 2. Các yếu tố sai số: - Hút không chính xác mẫu. 8 - Chuẩn độ không chính xác. - Sai số của máy chưng cất. 3. Câu hỏi 3.1 Vô cơ hóa mẫu là quá trình chuyển từ mẫu hữu cơ sang mẫu vô cơ. Phương trình phản ứng xảy ra: 2H 2 SO 4 → 2H 2 O +2SO 2 ↑ + O 2 2NH 3 + H 2 SO 4 → (NH 4 ) 2 SO 4 3.2 Phương trình phản ứng xảy ra trong quá trình: *Chưng cất (NH 4 ) 2 SO 4 + 2NaOH → Na 2 SO 4 + H 2 O +2NH 3 2NH 3 + 2H 2 O → 2NH 4 OH 2NH 4 OH + H 2 SO 4 → (NH 4 ) 2 SO 4 + 2H 2 O *Chuẩn độ H 2 SO 4 + 2NaOH → Na 2 SO 4 + 2H 2 O 3.3 Protein thô là ước tính về tổng số protein; protein thô bao gồm protein và nitơ khác có chứa các chất như ammonia, amino axit và nitrat. Protein thô hoạt động như một nguồn năng lượng và xây dựng mô. Nếu năng lượng protein tỉ lệ quá thấp, protein sẽ được dùng để đáp ứng yêu cầu năng lượng đầu tiên, còn lại sẽ được sử dụng cho tăng trưởng. Hàm lượng Protein thô ít có ý nghĩa vì nó không phải là hàm lượng protein nguyên chất, nó chỉ nói lên hàm lượng nitơ tổng để chúng ta quy ra hàm lượng protein. 9 Bài 3: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ACID HỮU CƠ TRONG SỮA TƯƠI I.Mục đích Trong quá trình vắt sữa, thu hồi, vận chyển… có nhiều loại vi sinh vật xâm nhập vào sữa sẽ tạo ra các acid làm giảm pH của sữa. việc xác định hàm lương acid hữu cơ có sẵn trong sữa sẽ giúp điều chỉnh pH của sữa khi bổ sung thêm vi sinh vật lên men lactic để bảo quản và chế biến sản phẩm từ sữa. 10 [...]... strong 100g chất béo; được tính bằng mili đương lượng của oxy hoạt tính làm oxy hóa KI trên 1kg mẫu dưới các điều kiện thao tác đã được quy định 2.5 Trình bày ý nghĩa thực tiễn thí nghiệm? Xác định được lượng chất có trong mẫu có được Bộ y tế cho phép lưu thông không 26 Bài 8: ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN C I.Nguyên tắc: Iốt tương đối không tan trong nước, nhưng điều này có thể cải thiện bằng cách pha trộn iốt với... như nước mắm, dường, bánh ngọt, mặn… cũng được bổ sung vitamin Với các loại sữa thì có các vitamin C, B1, B6, canxi… Bánh mặn thì có vitamin A, riêng các loại kẹo thì có vitamin C II.3 Trình bày nguyên lý của các phương pháp định lượng trên? Nhằm khảo sát về L-acid ascorbic, acid này có thể thấy dạng khử hay oxy hóa Định lượng C dựa trên tính khử bằng thuốc thử 2,6 dichlorophenol indophenol Dạng oxy hóa... tạo hình Các loại vitamin này được lưu trong cơ thể, chủ yếu trong mỡ và gan • 2.1. 2Tính chất - Vitamin A: + Còn các tên gọi retion,axerophthol…tồn tại 2 dạng trong tự nhiên: o o Retinol: dạng hoạt động của vitamin A, nó được đồng hóa trực tiếp bởi cơ thể Tiền vitamin A: betacaroten được chuyển hóa bởi ruột thành vitamin A để cơ thể có thể sử dụng + Bị phá hủy môi trường trung tính và kiềm + Bảo tồn... tránh những yếu tố làm biến tính protein enzyme Các thông số nhiệt độ, pH nông đọ ion và thành phần đệm ảnh hưởng lên hoạt tính enzyme Thử hoạt tính enzyme phải được tiến hành trong điều kiện thích hợp như điều kiện sinh lý, tồn trữ thực phẩm Thời gian xác định hoạt tính thường 5-30ph 2.Câu hỏi 2. 1Tính chất chung của enzyme : - Enzym có bản chất là protein nên có tất cả thuộc tính lý hóa của protein Đa... 0C, là sản phẩm của vi sinh vật gây thối Hoạt tính của K2 thấp hơn 60% K1 + Vitamin K bị phân hủy nhanh dưới tác dụng của tia tử ngoại; có tính oxy hóa khử - Vitamin B1 + Còn gọi thiamine, tinh thể màu trắng, tan trong nước, nhạy với nhiệt, dễ bị phân hủy khi đun nóng, chú ý đến thời gian và độ pH + Có thể nhận năng lượng từ ATP để chuyển hóa thành TPP - Vitamin B2 còn gọi riboflavin, màu vàng cam, tan... Vitamin D + Còn gọi là Calcipherol, có hoạt tính chống còi xương + Vitamin D2 là dẫn xuất của ergosterol, chiết xuất trong phòng thí nghiệm dùng để chữa bệnh + Vitamin D3 là dẫn xuất của cholesterol, chiết xuất trong tự nhiên từ dầu gan cá + Trong quá trình c và thế biến vitamin D không bị biến mất Calcipherol tăng khả năng hấp thụ Ca, P của xương; tăng nồng độ Ca, P trong máu và trong xương Vitamin... quyết định tính đặc hiệu) 15 • Coenzym: phần không phải protein (trực tiếp tham gia vào phản ứng enzym), bản chất là những hợp chất hữu cơ phức tạp 2.2 Một số enzyme phân giải protein thường gặp : 2.2.1 Protease : - - Trong công nghệ sản xuất các loại dịch thủy phân giàu protein được áp dụng một cách có hiệu quả tính năng của proteasa : nước tương là dung dịch acid amin từ đậu nành, nước mắm là acid amin. .. potassium tartate,đun cách thủy cho tan rồi định mức tới 100ml Dung dịch glucose (500ppm): cân 0.5g d-glucose pha trong nước cất thành 1 lít Dung dịch glucose mẫu (50ppm):hút 10ml dung dịch chuẩn glucose 500ppm cho vào bình định mức,thêm nước cất ,định mức đúng 100ml,lắc đều 18 IV Tiến hành Cân 4-6g táo o o Trích ly bằng 40ml cồn 90 , 2 lần 40ml cồn 80 Cô cạn về 30ml Định mức 100ml Pha loãng 10 lần Dịch chiết... cận giáp, loãng xương sau mãn kinh - Vitamin E + Còn gọi là Tocophero; là một vitamin tan trong dầu + Là dẫn xuất benzopyran; là một chất dầu lỏng, không màu, bền với nhiệt + Là chất chống oxy hóa - Vitamin K + Là dẫn xuất naphtoquinon Đã tách được các loại K1, K2, K3 + Vitamin K1 là chất dầu màu vàng nhạt, kết tinh ở -20 0C, hình thành chủ yếu trong thực vật +Vitamin K2 là tinh thể màu vàng, nong chảy... có giá trị Bài 4: XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYM ALPHA-AMYLASE I.Nguyên lý: 12 Hoạt tính α-amylase hiển thị khả năng của enzym amylase xúc tác phản ứng thủy phân tinh bột đến dextrin trong 1 phút ở 50°C và được biểu hiện bằng số đơn vị của enzym trong 1g mẫu Khi phản ứng thủy phân tinh bột xảy ra, lượng tinh bột còn lại chưa được phân hủy sẽ tạo phản ứng màu với iode và được so màu bằng máy so màu quang . Bài 1: ĐỊNH TÍNH ACID AMIN BẰNG SẮC KÍ GIẤY I.Mục đích Nắm được cách xác định acid amin bằng sắc kí giấy, từ đó xác định phân biệt, định danh acid amin. II.Nguyên tắc: Dựa. kết thúc qua trình sắc kí mỗi loại acidamin sẽ nằm ở vị trí khác nhau, cách nhau khoảng nhất định trên giấy sắc kí. Nếu ta có một acidamin chuẩn, để khảo sát trong mẫu có acidamin đó hay không,. của giấy, dung bút chì vẽ để khi chạy sắc kí khỏi lem màu. - Không cho giấy chạm vào thành ống nghiệm vì nước trong thành làm đường acid amin bị cong. - Dùng giấy sắc kí lớn lợi hơn 3 sắc kí giấy