CHƯƠNG 3: SẮC KÝ LỚP MỎNG I. NGUYÊN TẮC Sắc ký lớp mỏng (SKLM) còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography) là kỹ thuật phân bố rắn-lỏng: trong đó pha động là chất lỏng được cho đi ngang qua một chất hấp phụ trơ như silicagel hoặc oxyd alumin. Chất hấp phụ này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic. Do chất hấp phụ được tráng thành lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là SKLM. Muốn thực hiện sắc ký, người ta cho mẫu phân tích hòa tan vào trong một dung môi dễ bay hơi, dùng vi quản để chấm một ít dung dịch mẫu, chấm 1 vết nhỏ gọn lên lớp mỏng. Sấy nhẹ để đuổi phần dung môi hòa tan mẩu, như vậy mẫu chỉ còn là dạng bột khô bám trên lớp mỏng. Đặt lớp mỏng theo chiều thẳng đứng vào trong một bình có dung môi thích hợp, dung môi sẽ bị lực mao quản hút lên phía trên, mẫu chất sẽ được phân chia thành những vết riêng biệt. Các vết sẽ được phát hiện bằng phương pháp vật lý như nhìn bằng mắt, soi dưới đèn tử ngoại hoặc bằng phương pháp hóa học (phun lên bảng mỏng các loại dung môi hay thuốc thử ). Một chất tinh khiết chỉ cho một vết tròn, có giá trị R f không đổi trong một hệ dung môi xác định. Trị số R f được tính như sau: y x R f = x: khoảng cách từ vị trí điểm chấm đến trung tâm vết y: chiều dài triển khai của bảng mỏng Cách tính giá trị R f R f luôn có giá trị nhỏ hơn 1 và thay đổi tùy thuộc vào quá trình triển khai bảng mỏng như: - Tính chất của chất hấp phụ. - Thành phần của dung môi triển khai. - Chiều dày của bảng mỏng. - Lượng mẫu chất chấm. - Nhiệt độ. - Điều kiện bão hòa khí quyển. o Nếu khí quyển được bão hòa thì vết tách tốt. o Nếu khí quyển không bão hòa, các vết dồn lại hay có hiện tượng bờ. Hiện tượng bờ trong SKLM Sắc ký lớp mỏng có một số ưu điểm sau: - Hiệu ứng tách tốt, nhạy hơn các phương pháp khác (hơn 20 lần so với sắc ký giấy). - Thời gian tiến hành nhanh. - Lượng mẫu phân tích nhanh. - Có thể phân tích đồng thời mẫu chất và chất chuẩn trong cùng một điều kiện. - Dụng cụ đơn giản. II. CHẤT HẤP PHỤ DÙNG TRONG SẮC KÝ LỚP MỎNG Trong SKLM, thường dùng các chất hấp phụ như silicagel, Al 2 O 3 , Kieselguhr, celluloz….Ngoài ra người ta còn trộn thêm chất kết dính hoặc chất chỉ thị phát hùynh quang. Chất kết dính giúp chất hấp phụ bám tốt vào tấm kính hoặc plastic, làm cho lớp mỏng bền, không bị trầy xước. Bảng 4: Các chất hấp phụ dùng trong SKLM (sắp xếp theo Stahl) Chất hấp phụ Độ acid Hoạt năng Cơ chế Công dụng Silicagel Acid Có hoạt năng Hấp phụ và phân bố Cho tất cả các hợp chất Alumin oxyd Kiềm Có hoạt năng Phân bố Baz và Steroid Kieselguhr Trung tính Có hoạt năng Hấp phụ Đường , triglycerid, mỡ bậc cao Magiephosphat Trung tính Có hoạt năng Hấp phụ Calci hydroxyd Trung tính Không Hấp phụ Carotenoid, tocopherol Calci sulfat Kiềm Yếu Hấp phụ Tocopherol Silicagel Yếu Phân bố Tocopherol, acid béo Al 2 O 3 ACID Yếu Hấp phụ Triglycerid Fe(OH) 3 Có hoạt năng Hấp phụ cid barbituric Than Phân bố Chấ Bột Cellulose Trung tính Có hoạt năng Trao đổi Chất không phân cực Polyamid Trung tính Có hoạt năng Trao đổi Chất màu, acid nucleic Polyacrylnitryl Trung tính Có hoạt năng Phân bố & trao đổi Flavon Nhựa trao đổi ion Trung tính Không Anthocyanin Acid, baz Không Acid nuceic Bảng 5: Các loại Silicagel dùng trong SKLM Loại Hãng % Bột bó Cách sử dụng Ghi chú Silicagel G Merck 13 1 phần si. + 2V H 2 O TLC Serva 10 10g si. + 25 ml H 2 O DSF-5 Fluka 5 40g si. +45 ml H 2 O DS-S Thụy sĩ 5 Chỉ thị hùynh quang Silicagel là chất hấp phụ được sử dụng thông dụng nhất, silicagel có cấu trúc hóa học như sau: O Si O Si O Si O O O H O H O O H Trong silicagel thương phẩm, nếu có tiếp vĩ ngữ “G” nghĩa là silicagel đó có trộn thêm chất kết dính calci sulfat ngậm nước CaSO 4 (0,5H 2 O). Sự hiện diện của ion calci hầu như không ảnh hưởng đến quá trình sắc ký. III. DUNG MÔI TRIỂN KHAI Dung môi triển khai trong SKLM thường là một hỗn hợp có 2, 3 hoặc 4 loại dung môi khác nhau với tỉ lệ thích hợp. Ứng với mỗi loại hợp chất phân tích khác nhau sẽ có một số hệ dung môi thích hợp. Bảng 6: Một số hệ dung môi và thuốc thử trong SKLM các hợp chất thiên nhiên Hợp chất Chất hấp phụ Hệ dung môi Thuốc thử Alcaloid SiO 2 G CHCl 3 -MeOH (9:1) CHCl 3 -Aceton-MeOH-NH 3 (20:20:3:1) Benzen-EtOAc-diethylamin (7:2:1) Dragendorff Hơi I 2 Saponin SiO 2 G n-buthanol-AcOH-H 2 O (4:1:5) n-buthanol-EtOH-NH 4 OH (7:2:5) EtOAc-MeOH-H 2 O (100:17:13) CHCl 3 -MeOH-H 2 O (61:32:7) CHCl 3 -MeOH (9:1) →Genin Vanillin/H 3 PO 4 SbCl 3 /CHCl 3 bão hòa H 2 SO 4 Liebermann Flavonoid SiO 2 G EtOAc-a.formic-H 2 O (8:1:1) Toluen-EtOAc-MeOH (4:3:1) EtOAc-MeOH-H 2 O (100:17:13) Toluen-ethylformiat-a.formic (5:4:1) Hơi NH 3 KOH 10% FeCl 3 /MeOH 2% (hoặc/H 2 O) Antrglycoside SiO 2 G EtOAc-MeOH-H 2 O (100:17:13) Benzen-EtOAc-a.formic (75:25:1) Dd NaOH, KOH p-nitranilin+natri nitrit Coumarin SiO 2 G Toluen-EtOAc-MeOH(4:3:1) CHCl 3 -MeOH (9:1) Benzen-Aceton(9:1) EtOAc-MeOH-H 2 O (100:17:13) p-dinitro benzen Glycosid tim SiO 2 G CHCl 3 -MeOH (9:1) Ceton-Toluen-H 2 O-MeOH-AcOH (40:5:3:2,5:1) EtOAc-pyridin-H 2 O (50:5:45) EtOAc-MeOH-H 2 O (80:5:5) Cyclohexan-aceton-AcOH (49:49:2) Dinitro benzen Xanthydrol Tanin SiO 2 G EtOAc-MeOH-H 2 O (100:17:13) Toluen-EtOAc-MeOH (4:3:1) FeCl 3 Tinh dầu SiO 2 G Benzen-EtOAc(95:5) Benzen-MeOH(95:5) I 2 , H 2 SO 4 , H 3 PO 4 Dầu béo SiO 2 G Ether dầu – ether ethylic-AcOH (80:20:1) Ether dầu-Benzen(95:5) Hexan-EtOAc(95:5) Ether dầu-Ether (95:5) CHCl 3 -MeOH-H 2 O(80:20:1) (65:25:4) Hơi I 2 Benzidin→Xanh Rhodamin B → hồng H 2 SO 4 KaliBicromat/H 2 SO 4 đđ Amino acid SiO 2 G n-buthanol-AcOH-H 2 O (60:20:20) n-propanol-H 2 O (64:36) Cồn 96%-H 2 O (63:37) Phenol-H 2 O (75:25) n-propanol-EtOAc-H 2 O (4:3:2) Đường SiO 2 G EtOAc-MeOH-AcOH-H 2 O (70:30:5:5) n-buthanol-AcOH-H 2 O (4:1:1) n-propanol-EtOAc-H 2 O (4:3:2) Vanillin/ H 2 SO 4 Anilin phtalat Naphtorecorcin Nên chọn dung môi có độ tinh khiết cao, hòa tan được mẫu phân tích. Tuy nhiên không khuyến khích dùng dung môi có thể hòa tan tuyệt đối mẫu. Mẫu chất cần phân tích có thể chứa nhiều chất khác nhau, khả năng tách riêng các chất trong mẫu tùy thuộc vào tỷ lệ phân bố của các chất giữa chất hấp phụ và dung môi triển khai. Muốn thay đổi khả năng tách, người ta thay đổi thành phần dung môi hoặc thay đổi tỉ lệ giữa các dung môi trong hỗn hợp dung môi triển khai. Với mẫu chất mà chưa biết thành phần hợp chất, chưa có tài liệu tham khảo thì phải làm một loạt thí nghiệm với các hệ dung môi khác nhau, quan sát các vết. một hệ dung môi triển khai phù hợp khi các vết R f rõ, cách xa và trong giới hạn 0,3 → 0,7. Nếu R f < 0,3 thì hệ dung môi quá thấp, R f > 0,7 thì hệ dung môi quá phân cực. IV. CÁC KỸ THUẬT SKLM IV.1. Kỹ thuật SKLM một chiều Dung môi chạy theo một chiều từ đầu dưới bảng mỏng lên đầu trên bảng mỏng. Lưu ý vết chấm ban đầu trên bảng mỏng không được ngập trong dung môi khi triển khai, vì mẫu chất bị khuyếch tán ngay ra dung môi làm cho các vết bị lem. IV.2. Kỹ thuật sắc ký 2 chiều Trong trường hợp mẫu phân tích có nhiều cấu tử, kỹ thuật sắc ký 1 chiều không đủ tin cậy thì tiến hành thêm kỹ thuật sắc ký 2 chiều để kết quả tách được rõ ràng hơn. Kỹ thuật SKLM 2 chiều được minh họa trong hình dưới đây: Dùng loại bảng 20 x 20, chấm chất phân tích ở góc bảng cho vào bình sắc ký chạy hệ dung môi I, quay góc 90 o , cho vào bình sắc ký chạy hệ dung môi II. Kỹ thuật sắc ký 2 chiều IV.3. Kỹ thuật sắc ký điều chế (Preparative Chromatography) SKLM điều chế còn được gọi là kỹ thuật sắc ký chế hóa, thường để tách các chất với lượng nhỏ, có R f xa nhau. Dùng kỹ thuật SKLM 1 chiều, bảng mỏng có kích thước 20 x 20 cm, độ dày chất hấp phụ từ 0,5-1 mm. Hỗn hợp cần tách được chấm thành 1 đường liên tục trên bảng mỏng. Sau đó triển khai bằng hệ dung môi thích hợp. Trường hợp R f các chất trong hỗn hợp rất gần nhau, có thể tiến hành triển khai nhiều lần, mỗi lần làm phải sấy khô bảng mỏng. Phát hiện các vết bằng cách soi dưới đèn tử ngoại hoặc phun thuốc thử lên mé của bảng mỏng, tránh phun 1 vùng quá rộng vì thuốc thử có thể làm biến đổi cấu trúc của cấu tử cần tách để tạo phản ứng màu. Đánh dấu vùng muốn tách mẫu, cạo riêng từng vùng. Dùng dung môi thích hợp (có thể dùng dung môi triển khai) để lấy riêng mẫu chất ra khỏi chất hấp phụ, quá trình này gọi là phản hấp phụ. Kỹ thuật SKLM điều chế V. CÁC ỨNG DỤNG CỦA SKLM Kỹ thuật SKLM hiện nay vẫn là công cụ đắc lực trong ngành hóa hữu cơ, đặc biệt trong hóa hợp chất thiên nhiên như : - Cho biết đặc điểm của hợp chất vừa trích ly, cô lập được (một chất tinh khiết sẽ có giá trị R f không đổi trong một hệ dung môi xác định). - Có thể đưa ra kết luận sơ bộ về hỗn hợp chiết xuất ban đầu có bao nhiêu hợp chất và tính phân cực của hỗn hợp mẫu chiết. - Để định hướng loại dung môi phù hợp cho sắc ký cột. Trước khi dùng sắc ký cột để tách một lượng lớn mẫu chất, các nhà nghiên cứu thường hay dùng SKLM để thăm dò tìm hệ dung môi thích hợp cho quá trình saa81c ký cột. - SKLM là công cụ rất đắc lực để theo dõi quá trình sắc ký cột, để nhận định các phân đoạn thu được từ sắc ký cột. Kết quả quan sát các vết trên bảng mỏng rất quan trọng để có thể nhận định rằng phân đoạn đó là hỗn hợp hay tinh khiết hoặc gộp các phân đoạn có R f giống nhau. - Để theo dõi diễn tiến của một phản ứng. . G n-buthanol-AcOH-H 2 O (60:20:20) n-propanol-H 2 O (64 :36 ) Cồn 96%-H 2 O ( 63: 37) Phenol-H 2 O (75:25) n-propanol-EtOAc-H 2 O (4 :3: 2) Đường SiO 2 G EtOAc-MeOH-AcOH-H 2 O (70 :30 :5:5) n-buthanol-AcOH-H 2 O. SiO 2 G n-buthanol-AcOH-H 2 O (4:1:5) n-buthanol-EtOH-NH 4 OH (7:2:5) EtOAc-MeOH-H 2 O (100:17: 13) CHCl 3 -MeOH-H 2 O (61 :32 :7) CHCl 3 -MeOH (9:1) →Genin Vanillin/H 3 PO 4 SbCl 3 /CHCl 3 bão hòa H 2 SO 4 Liebermann Flavonoid. thuốc thử trong SKLM các hợp chất thiên nhiên Hợp chất Chất hấp phụ Hệ dung môi Thuốc thử Alcaloid SiO 2 G CHCl 3 -MeOH (9:1) CHCl 3 -Aceton-MeOH-NH 3 (20:20 :3: 1) Benzen-EtOAc-diethylamin (7:2:1) Dragendorff Hơi