Đang tải... (xem toàn văn)
TÓM TẮT LUẬN ÁN1. Tóm tắt mở đầu:Tên tác giả: Trần Cao SơnTên luận án:“Nghiên cứu xác định dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trongdược liệu và sản phẩm từ dược liệu bằng sắc ký khối phổ ”Chuyên ngành: Kiểm nghiệm Thuốc – Độc chất. Mã số: 62 72 04 10Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Dược Hà Nội2. Nội dung bản tóm tắt2.1. Mục tiêu của luận án:Luận án có 3 mục tiêu:1. Xác định các HCBVTV thường được dùng tại một số vùng trồng dược liệu ở phía Bắc;2. Xây dựng và thẩm định một phương pháp phân tích đa d ư lượng HCBVTV trong dượcliệu và một số sản phẩm từ dược liệu;3. Sơ bộ đánh giá dư lượng HCBVTV trong một số dược liệu và sản phẩm từ dược liệu.2.2. Phương pháp nghiên cứu2.2.1. Phương pháp khảo sát thực địa và lấy mẫuThực hiện khảo sát các HCBVTV đang được sử dụng phổ biến, nhằm xác định đối tượngnghiên cứu chứa nhiều nguy cơ nhiễm HCBVTV nhất. Công cụ: phiếu hỏi thiết kế sẵn gồm có phiếu khảo sát cơ sở cung ứng HCBVTV vàphiếu khảo sát việc sử dụng HCBVTV trong trồng cây thuốc, chè Địa phương thực hi ện khảo sát: Các địa phương được khảo sát bao gồm: Hà Nội, HưngYên, Nam Định, Thái Nguyên, Phú Thọ, Hà Giang. Việc khảo sát kết hợp với lấy mẫu tại các địa phương.2.2.2. Phương pháp xử lý mẫu Chuẩn bị mẫu sơ bộ: Toàn bộ mẫu được xay nhỏ (đối với mẫu r ắn), lắc trộn đều (đốivới mẫu lỏng). Xử lý mẫu: Sử dụng phương pháp QuEChERS dựa trên việc chiết HCBVTV bằngacetonitril đã được ổn định pH bằng đệm acetat và tách khỏi nước có trong mẫu bằng phânbố lỏng lỏng nhờ muối magnesi sulfat (MgSO4). Dịch chiết được làm sạch bằng chiết phântán pha rắn (dSPE) để loại các acid hữu cơ, nước còn dư và các thành phần khác nhờ chấthấp phụ PSA, GCB và MgSO4. Dịch chiết được tách bằng sắc ký và phân tích bằng kỹ thuậtkhối phổ hai lần.2.2.3. Phương pháp phân tích bằng sắc ký khối phổ2.2.3.1. LCMSMS Sử dụng sắc ký lỏng pha đảo với cột sắc ký XBridge BEH C18 (100 mm x 4,6 mm; 2,5μm) của Waters, nhiệt độ cột: 30oC. Pha động gồm hai kênh A (acid acetic 0,1% trongnước) và B (methanol) với chế độ gradient, tốc độ dòng: 0,7 mLphút. Thể tích tiêm mẫu:10 μL.2 Khối phổ ba tứ cực với nguồn ESI(+). Mỗi HCBVTV lựa chọn 1 ion phân tử,
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI Trần Cao Sơn NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG HOÁ CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM TỪ DƯỢC LIỆU BẰNG SẮC KÝ KHỐI PHỔ CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 62 72 04 10 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, NĂM 2015 Cơng trình hồn thành : Trường Đại học Dược Hà Nội Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia Người hướng dẫn khoa học PGS TS Thái nguyễn Hùng Thu TS Lê Thị Hồng Hảo Phản biện : ………………………………… .… Phản biện : …………………………… .……… Phản biện : …………………………… .……… Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Trường tổ chức Trường Đại học Dược Hà Nội Vào hồi ngày Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia VN Thư viện trường ĐH Dược HN tháng năm A GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Tính cấp thiết luận án Hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) đóng vai trị quan trọng để phòng trừ loại dịch bệnh cho sản phẩm nơng nghiệp nói chung dược liệu nói riêng Khi sử dụng, HCBVTV tồn lại sản phẩm Nếu lạm dụng sử dụng không cách loại HCBVTV làm cho tồn dư HCBVTV sản phẩm tăng cao, gây tác dụng không mong muốn cho người sử dụng Việc xác định mức tồn dư HCBVTV dược liệu sản phẩm từ dược liệu có ý nghĩa quan trọng để sàng lọc, loại bỏ sản phẩm không đáp ứng an tồn cho người sử dụng Hiện nay, có hàng nghìn HCBVTV sử dụng Các phương pháp phân tích hướng đến xác định đồng thời nhiều HCBVTV lúc Các phương pháp gọi phân tích đa dư lượng Các phương pháp xác định HCBVTV dược liệu quy định theo dược điển xác định nhóm HCBVTV cụ thể, chưa có phương pháp để xác định nhóm HCBVTV Phương pháp chiết QuEChERS (viết tắt Quick, Easy, Cheap, Efficient, Rugged, Safe) phối hợp với kỹ thuật sắc ký khí sắc ký lỏng khối phổ phương pháp đa dư lượng nhiều nước chấp nhận làm phương pháp chuẩn để áp dụng phân tích HCBVTV rau Nhằm nghiên cứu xác định dư lượng HCBVTV dược liệu sản phẩm dược liệu Việt Nam, luận án “Nghiên cứu xác định dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật số dược liệu sản phẩm từ dược liệu sắc ký khối phổ” thực Mục tiêu luận án Xác định HCBVTV thường dùng số vùng trồng dược liệu phía Bắc; Xây dựng thẩm định phương pháp phân tích đa dư lượng HCBVTV dược liệu số sản phẩm từ dược liệu; Sơ đánh giá dư lượng HCBVTV số dược liệu sản phẩm từ dược liệu Để đạt mục tiêu đề ra, luận án tiến hành với nội dung sau: Về khảo sát tình hình sử dụng HCBVTV Khảo sát thông qua phiếu hỏi, thực số địa phương có vùng trồng dược liệu miền Bắc: - Loại HCBVTV kinh doanh phổ biến - Loại HCBVTV sử dụng phổ biến trồng dược liệu Về xây dựng thẩm định phương pháp - Khảo sát điều kiện xử lý mẫu dược liệu sản phẩm từ dược liệu phương pháp QuEChERS - Khảo sát điều kiện phân tích HCBVTV LC-MS/MS - Khảo sát điều kiện phân tích HCBVTV GC-MS/MS - Thẩm định phương pháp tính chọn lọc, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ lặp lại, độ thu hồi Về xác định dư lượng HCBVTV số loại dược liệu sản phẩm -1- Ứng dụng phương pháp để xác định HCBVTV loại dược liệu tươi, dược liệu khô, sản phẩm từ dược liệu gồm thực phẩm chức (TPCN) dạng viên, dạng trà hay dạng nước ép chè xanh (khơ) Những đóng góp luận án 3.1 Về tình hình sử dụng HCBVTV trồng thuốc Luận án xác định 75 loại HCBVTV với 39 hoạt chất tiêu thụ vùng trồng dược liệu tỉnh phía Bắc Nhiều nhóm lân hữu có hoạt chất Có 23 hoạt chất sử dụng trồng thuốc Một số địa phương người dân sử dụng HCBVTV không rõ nguồn gốc 3.2 Về phương pháp xác định dư lượng HCBVTV Về xử lý mẫu phân tích: - Đã nghiên cứu đưa quy trình chiết QuEChERS đồng thời với HCBVTV nghiên cứu mẫu khác bao gồm dược liệu tươi, dược liệu khơ, TPCN có thành phần thảo dược chè xanh (khơ) Quy trình chiết theo QuEChERS có nhiều ưu điểm quy trình truyền thống trước quy trình theo dược điển Việt Nam: sử dụng lượng dung mơi nên giảm chi phí giảm ảnh hưởng đến môi trường sức khoẻ kiểm nghiệm viên, trình chiết nhanh mà đảm bảo độ xác theo yêu cầu - Kết nghiên cứu cho thấy mẫu dược liệu khô, cần bổ sung thêm nước thực xử lý mẫu khoảng 15 phút kéo dài thời gian hàm lượng HCBVTV có xu hướng giảm mẫu nghiên cứu - Sử dụng chất hấp phụ PSA GCB xử lý mẫu cần thiết GCB thêm vào có vai trị loại tạp chất chlorophill với lượng phù hợp 7,5 mg, nhiều làm giảm độ thu hồi số HCBVTV Lượng PSA sử dụng phù hợp 40mg, không cần thiết phải dùng lượng lớn - Việc chiết sử dụng hệ dung môi không dùng đệm, có dùng đệm acetat có dùng đệm citrat cho thấy hệ dung môi dùng đệm acetat cho độ thu hồi tốt nhiều HCBVTV Đệm acetat phù hợp với thiết bị LC-MS/MS - Lần chì acetat sử dụng trình chiết QuEChERS nhằm loại tannin mẫu chè Lượng muối chì acetat cho hiệu 1,5g - Sử dụng việc xây dựng đường chuẩn mẫu dùng nội chuẩn giúp giảm ảnh hưởng mẫu 20% Điều kiện phân tích: - Đã xác định điều kiện để phân tích đồng thời 25 HCBVTV LC-MS/MS Tổng thời gian phân tích thiết bị 15 phút Mỗi HCBVTV xác định ion phân tử ion sản phẩm đặc trưng nên phương pháp có tính đặc hiệu cao HCBVTV Trong số 25 HCBVTV phân tích LC-MS/MS, có nhiều HCBVTV chưa báo cáo trước Việt Nam - Đã xác định điều kiện để phân tích đồng thời HCBVTV GC-MS/MS Phương pháp sử dụng chế độ MS/MS nên đặc hiệu HCBVTV nghiên cứu Về kết thẩm định phương pháp: -2- - Phương pháp thẩm định mẫu dược liệu tươi, dược liệu khơ, TPCN có thành phần thảo dược chè tiêu chí độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ lặp lại độ thu hồi Phương pháp có độ nhạy tốt với giới hạn định lượng tất HCBVTV nghiên cứu mẫu nghiên cứu thấp mức tồn dư tối đa (MRL=0,01 mg/kg) 3.3 Về dư lượng HCBVTV dược liệu sản phẩm dược liệu - Đã xác định dư lượng 32 HCBVTV nhiều loại dược liệu sản phẩm từ dược liệu khác Trong đó, lần dư lượng nhóm HCBVTV neonicotinoid macrocyclic lacton triển khai xác định Việt Nam - Các mẫu chè xanh (khô) chè túi lọc (thảo dược) có tỷ lệ nhiễm HCBVTV cao; chiếm 50% 40% số lượng mẫu phân tích Ý nghĩa luận án - Phương pháp xác định đa dư lượng HCBVTV dược liệu sản phẩm dược liệu áp dụng nhằm góp phần giám sát, kiểm tra mức độ tồn dư HCBVTV sản phẩm Các kết kiểm nghiệm góp phần quan trọng để loại bỏ sản phẩm khơng đảm bảo an tồn cho sức khỏe người sử dụng - Phương pháp xây dựng thẩm định chặt chẽ điều kiện trang thiết bị Việt Nam sử dụng tài liệu tham khảo quan trọng PTN nước quốc tế Phương pháp áp dụng phịng thí nghiệm trang bị hệ thống sắc ký khí khối phổ sắc ký lỏng khối phổ Năm 2012, phương pháp đào tạo chuyển giao cho 20 học viên từ trung tâm kiểm nghiệm an toàn thực phẩm nhằm kiểm nghiệm dư lượng HCBVTV sản phẩm nông nghiệp sản phẩm thực phẩm chức - Dư lượng HCBVTV số đối tượng dược liệu sản phẩm từ dược liệu xác định Các kết cho thấy tỷ lệ lớn dược liệu sản phẩm dược liệu có chứa dư lượng HCBVTV Đây sở để tăng cường quản lý sát nữa, tăng cường biện pháp giám sát, hậu kiểm để nâng cao chất lượng sản phẩm Việc tồn hàm lượng lớn HCBVTV sản phẩm cho thấy cần có nhiều quy định giới hạn tồn dư tối đa HCBVTV dược liệu sản phẩm từ dược liệu Bố cục luận án Luận án gồm chương, 43 bảng, 40 hình, 140 tài liệu tham khảo với 27 tài liệu tiếng Việt 113 tài liệu tiếng Anh, phụ lục Luận án có 142 trang gồm phần chính: Đặt vấn đề (2 trang); Chương 1: Tổng quan (46 trang); Chương 2: Đối tượng, phương tiện phương pháp nghiên cứu (14 trang); Chương 3: Kết nghiên cứu (58 trang); Chương 4: Bàn luận (22 trang); Kết luận kiến nghị (2 trang) -3- B NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN CHƯƠNG TỔNG QUAN Đã tập hợp trình bày có hệ thống kết nghiên cứu từ trước đến Việt Nam giới xác định đa dư lượng HCBVTV dược liệu sản phẩm từ dược liệu, sâu giới thiệu phương pháp chiết QuEChERS kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ hai lần sắc ký khí khối phổ hai lần CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu gồm 32 HCBVTV thuộc nhóm khác Đối tượng phân tích dược liệu sản phẩm dược liệu sau: Dược liệu tươi: mã đề (Plantago major) bồ công anh Việt Nam (Pterocypsela indica) sử dụng để xây dựng thẩm định phương pháp Ứng dụng phương pháp để phân tích HCBTVTV 22 dược liệu tươi Dược liệu khơ: dây thìa canh (Gymnema sylvestre) giang (Aganonerion polymorphum) sử dụng để xây dựng thẩm định phương pháp Ứng dụng phương pháp để phân tích HCBVTV 30 dược liệu khơ TPCN có thành phần thảo dược: Mẫu trà túi lọc (trà mướp đắng) sử dụng để khảo sát xây dựng phương pháp Áp dụng phương pháp 140 mẫu bao gồm nhóm mẫu: dạng viên, dạng trà dạng nước ép Chè xanh (khô): Mẫu chè xanh khô (Camellia sinensis) sử dụng để khảo sát xây dựng phương pháp Áp dụng để phân tích 20 mẫu chè 2.2 Phương tiện nghiên cứu 2.2.1 Hóa chất, thuốc thử, chất chuẩn - Hóa chất thuốc thử: Các hoá chất sử dụng nghiên cứu thuộc loại tinh khiết phân tích, bao gồm methanol, acetonitril, acid acetic, magnesi sulfat, natri acetat, PSA, GCB - Chất chuẩn 32 HCBVTV Sigma-aldrich Dr Erhenstorsfer có độ tinh khiết 95% - Chất chuẩn nội TPP (triphenyl phosphat) 2.2.2 Thiết bị, dụng cụ Các thiết bị, máy phân tích Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia hiệu chuẩn theo qui định ISO/IEC 17025 gồm: Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) ABSciex, hệ thống sắc ký khí khối phổ hai lần (GC-MS/MS) Agilent, cân phân tích XT22A (độ xác 0,1 mg) Precisa, máy ly tâm Z383K Hermle trang thiết bị, dụng cụ khác phịng thí nghiệm 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp khảo sát thực địa lấy mẫu Thực khảo sát HCBVTV sử dụng phổ biến, nhằm xác định đối tượng nghiên cứu chứa nhiều nguy nhiễm HCBVTV -4- - Công cụ: phiếu hỏi thiết kế sẵn gồm có phiếu khảo sát sở cung ứng HCBVTV phiếu khảo sát việc sử dụng HCBVTV trồng thuốc, chè - Địa phương thực khảo sát: Các địa phương khảo sát bao gồm: Hà Nội, Hưng Yên, Nam Định, Thái Nguyên, Phú Thọ, Hà Giang - Việc khảo sát kết hợp với lấy mẫu địa phương 2.3.2 Phương pháp xử lý mẫu - Chuẩn bị mẫu sơ bộ: Toàn mẫu xay nhỏ (đối với mẫu rắn), lắc trộn (đối với mẫu lỏng) - Xử lý mẫu: Sử dụng phương pháp QuEChERS dựa việc chiết HCBVTV acetonitril ổn định pH đệm acetat tách khỏi nước có mẫu phân bố lỏng lỏng nhờ muối magnesi sulfat (MgSO4) Dịch chiết làm chiết phân tán pha rắn (d-SPE) để loại acid hữu cơ, nước dư thành phần khác nhờ chất hấp phụ PSA, GCB MgSO4 Dịch chiết tách sắc ký phân tích kỹ thuật khối phổ hai lần 2.3.3 Phương pháp phân tích sắc ký khối phổ 2.3.3.1 LC-MS/MS - Sử dụng sắc ký lỏng pha đảo với cột sắc ký XBridge BEH C18 (100 mm x 4,6 mm; 2,5 µm) Waters, nhiệt độ cột: 30oC Pha động gồm hai kênh A (acid acetic 0,1% nước) B (methanol) với chế độ gradient, tốc độ dịng: 0,7 mL/phút Thể tích tiêm mẫu: 10 µL - Khối phổ ba tứ cực với nguồn ESI(+) Mỗi HCBVTV lựa chọn ion phân tử, bán phá lựa chọn ion sản phẩm để định lượng xác nhận 2.3.3.2 GC-MS/MS - Sử dụng cột sắc ký DB5-MS (30 m x 0,25 mm; 0,25 μm) với nhiệt độ buồng bơm mẫu: 250oC, chế độ tiêm mẫu không chia dịng Khí mang heli, tốc độ dịng 0,8 mL/phút Chương trình nhiệt độ: 60oC (giữ phút), tăng 20oC /phút lên 180oC (0 phút), sau tăng 4oC /phút lên 260oC (giữ phút) Nhiệt độ phận kết nối sắc ký khí khối phổ: 280oC - Bộ tiêm mẫu tự động CTC-Pal với thể tích tiêm mẫu µL - Khối phổ ba tứ cực với nguồn ion hoá: EI 70 eV, nhiệt độ nguồn Ion: 230oC, cắt dung mơi phút Phân tích chế độ MRM với ion phân tử ion sản phẩm cho HCBVTV 2.3.4 Phương pháp thẩm định Thẩm định thông số phương pháp bao gồm 2.3.4.1 Độ chọn lọc Đánh giá tính chọn lọc theo hai phương pháp: - Phân tích mẫu trắng, mẫu chuẩn mẫu thêm chuẩn Mẫu trắng không cho tín hiệu, mẫu thêm chuẩn phải có tín hiệu tương đồng với mẫu chuẩn - Đánh giá điểm xác nhận tỷ lệ ion theo tiêu chuẩn châu Âu EC 657/2002 2.3.4.2 Giới hạn phát (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) LOD LOQ xác định dựa tỷ lệ tín hiệu nhiễu (S/N): Phân tích mẫu thêm chuẩn nồng độ thấp cịn xuất tín hiệu chất phân tích Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio) dựa vào phần mềm thiết bị - LOD nồng độ mà tín hiệu lớn gấp lần nhiễu (S/N = 3) -5- - LOQ nồng độ mà tín hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu (S/N = 10) 2.3.4.3 Khoảng tuyến tính xây dựng đường chuẩn Để xác định khoảng tuyến tính, thực đo dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi khảo sát phụ thuộc tín hiệu vào nồng độ Xác định phụ thuộc diện tích pic thu vào nồng độ khơng cịn tuyến tính Xây dựng đường chuẩn mẫu thực, nhằm mục đích loại trừ ảnh hưởng mẫu đến kết phân tích 2.3.4.4 Độ lặp lại độ thu hồi Để xác định độ lặp lại độ thu hồi phương pháp phân tích, tiến hành thí nghiệm lặp lại mẫu trắng thêm chuẩn mức nồng độ khác nhau, nồng độ thực lần Độ thu hồi xác định mẫu thực cách thêm chuẩn mẫu xác định có HCBVTV xác định độ thu hồi 2.3.5 Phân tích mẫu thực Sử dụng đường chuẩn mẫu thực với mẫu phù hợp với đối tượng cần phân tích để tính kết 2.3.6 Xử lý kết Các kết tích phân diện tích định lượng xử lý theo phần mềm thiết bị phân tích: Phần mềm Analyst thiết bị LC-MS/MS phần mềm Mass Hunter thiết bị GCMS/MS Các số liệu xử lý phần mềm Microsolf Excel Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Khảo sát tình hình sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật trồng thuốc 3.1.1 Nguồn cung hóa chất bảo vệ thực vật 3.1.1.1 Kiến thức thực hành kinh doanh HCBVTV Trong số 19 sở, có 15 sở có giấy đăng ký bn bán thuốc bảo vệ thực vật sở giấy phép kinh doanh 63% số nhân viên kinh doanh sở buôn bán HCBVTV không đào tạo chuyên ngành HCBVTV hay có chứng đào tạo ngắn hạn HCBVTV Có khoảng 50% sở nhân viên kinh doanh chưa tiếp cận danh mục HCBVTV phép sử dụng, cấm sử dụng hạn chế sử dụng danh mục khơng sẵn có nơi bán 3.1.1.2 Các HCBVTV buôn bán phổ biến Hầu hết HCBVTV bán sở nằm danh mục cho phép sử dụng Việt Nam, có HCBVTV nằm danh mục HCBVTV hạn chế sử dụng Việt Nam (hoạt chất carbofuran kẽm phosphid) Trong số 75 HCBVTV kinh doanh, có HCBVTV gồm hai thành phần HCBVTV gồm thành phần Đa số HCBVTV sử dụng để trừ sâu hại, HCBVTV khác sử dụng để trừ cỏ trừ nấm Ngồi ra, có số HCBVTV không rõ nguồn gốc người dẫn sử dụng Tổng số hoạt chất 39 hoạt chất nhóm phosphor hữu nhóm HCBVTV có nhiều hoạt chất tên thương mại sử dụng (9 hoạt chất chiếm 23% 20 tên thương mại chiếm 51%) Nhóm pyrethroid có hoạt chất sử dụng có thành phần cypermethrin sử dụng phổ biến (9 tên thương mại) Bên cạnh đó, nhóm -6- neonicotinoid nhóm HCBVTV kinh doanh phổ biến với hoạt chất imidacloprid acetamiprid 3.1.2 Sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật trồng thuốc Hà Nội số vùng lân cận Tại thời điểm khảo sát, xã Tân Quang (Văn Lâm, Hưng Yên) có 17 loại thuốc; xã Bình Minh (Khối Châu, Hưng Yên) có 15 loại thuốc trồng Trong đó, sở bán bn bán lẻ dược liệu Ninh Hiệp Lãn Ông (Hà Nội), mua loại dược liệu khác Ở Hải Hậu (Nam Định) số địa phương áp dụng mơ hình GACP theo hợp tác với công ty Dược để trồng thuốc dây thìa canh, đinh lăng Ngồi ra, vùng trồng chè xanh Tân Cương (Thái Nguyên) khảo sát Qua khảo sát địa phương nói trên, đa số loại thuốc trồng thuộc loại thân thảo dây leo, giống ngắn ngày phận sử dụng phần mặt đất Có nhiều loại HCBVTV sử dụng trồng thuốc, tuỳ thuộc vào loại thuốc mục đích Có 21/28 loại thuốc (75%) loại HCBVTV thuốc dùng để diệt trừ sâu, số hoạt chất thường sử dụng cypermethrin, chlorpyrifos, abamectin, emamectin, imidacloprid, acetamiprid… 3.2 Xây dựng phương pháp phân tích đồng thời hóa chất bảo vệ thực vật dược liệu 3.2.1 Xây dựng điều kiện sắc ký khối phổ 3.2.1.1 Điều kiện sắc ký lỏng khối phổ Trong nghiên cứu này, cột pha đảo XBridge BEH C18 (100 mm x 4,6 mm; 2,5µm) (Waters, Mỹ) sử dụng để tách HCBVTV Tiền cột XBridge C18 (20mm x 3,9 mm; 3,5 µm) (Waters, Mỹ) sử dụng để bảo vệ cột Khảo sát tối ưu chế độ gradient phù hợp để tách HCBVTV với pha động gồm kênh: A (acid acetic 0,1% nước) B (methanol): Ban đầu 25% B đến phút, tăng lên 90% từ 1-8 phút; giữ 90% B phút đưa điều kiện ban đầu Tổng thời gian 15 phút Sử dụng khối phổ ba tứ cực với nguồn ESI(+), tiêm dung dịch chuẩn HCBVTV để tối ưu hóa điều kiện Lựa chọn ion phân tử hai ion sản phẩm cho HCBVTV Đã lựa chọn điều kiện tối ưu để phân tích 25 HCBVTV bao gồm: acetochlor, aldicarb, atrazin, azoxystrobin, abamectin, acetamiprid, carbaryl, carbofuran, carbendazim, carboxin, dichlorvos, dimethoat, edifenphos, emamectin, fenobucarb, imidacloprid, indoxacarb, isoprocarb, methiocarb, methomyl, profenofos, propoxur, tebuconazol, thiamethoxam trichlorfon Qua đánh giá độ lặp lại thiết bị cho thấy hệ số biến thiên diện tích píc dao động từ 1,9 đến 5,0% đáp ứng yêu cầu để ứng dụng phương pháp khối phổ (≤ 5%), hệ số biến thiên thời gian lưu thấp (< 1%) cho thấy thiết bị có độ ổn định đáp ứng yêu cầu 3.2.1.2 Điều kiện sắc ký khí khối phổ Các điều kiện cột tách, pha động, điều kiện gradient nhiệt độ, thể tích tiêm mẫu lựa chọn để phân tích đồng thời HCBVTV Pha tĩnh với tính phân cực trung bình yếu ((5%Phenyl)-methylpolysiloxan) sử dụng: Cột DB5-MS (30 m x 0,25 mm; 0,25 μm) Thời -7- gian lưu HCBVTV khóa theo chương trình phụ thuộc áp suất Mỗi HCBVTV lựa chọn ion phân tử ion sản phẩm để định lượng xác nhận Các HCBVTV phân tích GC-MS/MS bao gồm Acephat, aldrin, chlorothalonil, chlorpyrifos, cypermethrin, endosulfan sulfat permethrin Qua đánh giá độ lặp lại thiết bị cho thấy hệ số biến thiên diện tích píc dao động từ 1,6 đến 4,5% đáp ứng yêu cầu để ứng dụng phương pháp khối phổ (≤ 5%), hệ số biến thiên thời gian lưu thấp (< 1%) cho thấy thiết bị có độ ổn định đáp ứng yêu cầu 3.2.2 Xây dựng quy trình chiết hóa chất bảo vệ thực vật từ số dược liệu sản phẩm dược liệu 3.2.2.1 Nền mẫu dược liệu tươi - Lựa chọn dung môi chiết: So sánh quy trình phân tích sử dụng dung mơi acetonitril (quy trình 1), acetonitril với đệm citrat (quy trình 2) acetonitril với đệm citrat (quy trình 3) Các kết cho thấy hầu hết HCBVTV cho hiệu suất cao xử lý quy trình 2, có azoxystrobin edifenphos cho hiệu suất cao với quy trình có chất cho hiệu suất cao với quy trình (imidachloprid, aldicarb, abamectin) Đa số chất cho hiệu suất cao 60% phân tích quy trình Do đó, quy trình lựa chọn để thực khảo sát - Ảnh hưởng GCB: GCB thêm vào d-SPE để tăng khả loại tạp GCB có khả hấp phụ hợp chất hữu có cấu trúc phẳng, chất diệp lục Mẫu mã đề bồ công anh cho thêm chuẩn nồng độ 0,1 mg/kg (n = 2) phân tích hai quy trình Một quy trình khơng sử dụng GCB quy trình có thêm 7,5 mg GCB d-SPE Kết cho thấy sử dụng GCB dịch chiết loại chất diệp lục, độ thu hồi chất tương đương với không sử dụng GCB, số chất có độ thu hồi cao hẳn imidachloprid, aldicarb, carboxin Do đó, việc sử dụng GCB bước chiết d-SPE với lượng 7,5 mg cần thiết phù hợp 3.2.2.2 Nền mẫu dược liệu khô - Độ ẩm mẫu khoảng 80% cho hiệu suất chiết cao xử lý phương pháp QuEChERS Do đó, mẫu khơ bổ sung thêm nước với tỷ lệ mẫu:nước (1:5) khảo sát thời gian ngâm mẫu nước Qua khảo sát cho thấy khoảng từ đến 15 phút, thu nồng độ HCBVTV khảo sát cao Do nhằm tiết kiệm thời gian, không cần thiết phải thực ngâm mẫu nước trước chiết - Lựa chọn loại đệm chiết: Thực so sánh quy trình tương tự mẫu dược liệu tươi Kết cho thấy mẫu dây thìa canh, pH dịch chiết ổn định phương pháp; phương pháp không sử dụng đệm cho độ thu hồi tốt Tuy nhiên, mẫu giang (pH acid), phương pháp không dùng đệm cho hiệu thấp, 20/25 HCBVTV phân tích có độ thu hồi 70% Phương pháp dùng đệm citrat có độ thu hồi tốt chưa đáp ứng yêu cầu (14/25 HCBVTV có độ thu hồi 70%) Phương pháp dùng đệm acetat cho pH ổn định độ thu hồi HCBVTV đáp ứng yêu cầu Mặt khác mẫu dược liệu đa dạng tính acid base, việc sử dụng đệm acetat cần thiết -8- Ngoài ra, để đánh giá độ thu hồi, thực thêm chuẩn mẫu thực (mẫu phát có HCBVTV) gồm trinh nữ hồng cung, cỏ ngọt, mã đề Thêm chuẩn HCBVTV phát vào mẫu, phân tích lặp lại lần mẫu trắng mẫu thêm Độ thu hồi đạt mẫu thực tốt, tất kết 70% với khoảng nồng độ thêm chuẩn khác từ 0,05 đến 0,5 mg/kg 3.3 Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật số dược liệu sản phẩm từ dược liệu 3.3.1 Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật dược liệu tươi Dược liệu tươi lấy vườn số vùng trồng dược liệu Hà Nội Hưng Yên Thời điểm lấy mẫu giai đoạn thu hoạch sau vừa thu hoạch xong Số lượng mẫu lấy gồm 22 loại dược liệu, chủ yếu loại dược liệu lấy Các kết cho thấy có 8/22 mẫu (khoảng 36%) phát có HCBVTV vượt MRL (0,01 mg/kg) Carbendazim azoxystrobin HCBVTV phát nhiều mẫu carbendazim hợp chất có hàm lượng cao (0,39 mg/kg) 3.3.2 Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật dược liệu khô Các mẫu liệu khô lấy địa điểm, với tổng số mẫu 30 mẫu Đa số mẫu dược liệu khơng có nguồn gốc, bày bán chợ thuốc Ninh Hiệp (Hà Nội) quầy thuốc đông y Lãn Ông (Hà Nội) Một số mẫu lấy Hải Hậu (Nam Định) gồm mẫu cơng ty dược đặt hàng sản xuất (dây thìa canh, đinh lăng) Trong số 30 mẫu dược liệu phân tích có mẫu (khoảng 23%) có chứa HCBVTV, tần suất xuất lớn HCBVTV nhóm neonicotinoid với 4/7 mẫu Các mẫu dược liệu sản xuất theo tiêu chuẩn GACP không phát thấy HCBVTV 3.3.3 Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật thực phẩm chức có thành phần thảo dược - Tổng số mẫu phân tích: 140 mẫu số mẫu phát HCBVTV (nồng độ 0,01 mg/kg): 41 mẫu chiếm 29,3% - Các HCBVTV phát số lượng sau: chlorpyrifos: 12 mẫu, imidacloprid: mẫu, cypermethrin: mẫu, permethrin: mẫu, acetamiprid: mẫu, carbofuran: mẫu, fenobucarb: mẫu, azoxystrobin: mẫu, dimethoat: mẫu, abamectin: mẫu, endosulfan sulfat: mẫu trichlorfon: mẫu Trong đó, riêng hợp chất endosulfan sulfat HCBVTV nhóm clor hữu bị cấm sử dụng nhiều năm có mặt mẫu với hàm lượng 0,033 0,10 mg/kg - Các mẫu TPCN thống kê theo nhóm sản phẩm, ba nhóm sản phẩm đánh giá gồm: nhóm sản phẩm dạng viên; nhóm sản phẩm dạng túi, trà; nhóm sản phẩm dạng nước ép Tỷ lệ HCBVTV phát thấy mẫu tương đối cao đặc biệt mẫu trà thảo dược với tỷ lệ lên đến 40% tổng số mẫu Nguyên nhân mẫu trà hàm lượng thảo dược cao mẫu viên nước ép; đồng thời trình xử lý (ảnh hưởng nhiệt, ẩm, ánh sáng) sản phẩm trà thảo dược nên HCBVTV bị phân huỷ trình chế biến so với sản phẩm dạng viên (trải qua q trình đóng nang dập viên với có mặt tá dược khác) dạng nước ép (qua q trình chiết với dung mơi nước) -11- - Các mẫu TPCN đánh giá theo nguồn gốc mẫu: nhập nước Kết cho thấy, tỷ lệ phát nhiễm HCBVTV mẫu nội địa cao mẫu nhập đặc biệt nhóm trà thảo dược Tỷ lệ phát cao mẫu nhập (25-30%) cho thấy TPCN trà thảo dược nhập chứa đựng nguy cao Tỷ lệ phát mẫu sản xuất nước cao chưa khẳng định nguyên nhân từ dược liệu nước, nhiều loại TPCN chế biến từ dược liệu nhập khẩu, đa số từ Trung Quốc 3.3.4 Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trà xanh Các mẫu trà xanh lấy cửa hàng Hà Nội, tổng số mẫu 20 mẫu Có 10/20 mẫu có phát HCBVTV, nhiên hàm lượng thấp, dao động từ 0,004-0,15 mg/kg Các HCBVTV nhóm neonicotinoid phát nhiều bao gồm imidacloprid, acetamiprid thiamethoxam Chương BÀN LUẬN 4.1 Về việc sử dụng hoá chất bảo vệ thực vật trồng thuốc chế biến dược liệu Qua nghiên cứu số vùng dược liệu phía Bắc cho thấy có thay đổi loại HCBVTV thường sử dụng so với nghiên cứu trước Các HCBVTV nhóm neonicotinoid, macrocyclic lacton sử dụng bên cạnh HCBVTV nhóm lân hữu cơ, pyrethroid carbamat 4.1.1 Về loại hoá chất bảo vệ thực vật kinh doanh 4.1.1.1 Địa điểm khảo sát Địa điểm lựa chọn để khảo sát địa phương có vùng trồng thuốc kinh doanh dược liệu phổ biến phía Bắc Một số địa phương có vùng trồng dược liệu lớn Hưng Yên, Hải Dương, Nam Định Một số địa phương có vùng trồng chè xanh lớn gồm Phú Thọ, Thái Nguyên Ngoài ra, số cửa hàng Hà Giang khảo sát thêm với mục đích tìm hiểu HCBVTV nhập theo đường tiểu ngạch từ Trung Quốc Hà Nội địa điểm lựa chọn có nhiều địa điểm trồng thuốc kinh doanh dược liệu tươi khô 4.1.1.2 Hoá chất bảo vệ thực vật kinh doanh - Có 75 loại HCBVTV kinh doanh địa khảo sát, có loại có thành phần gồm hoạt chất, loại có thành phần gồm hoạt chất Các loại HCBVTV nhiều cửa hàng kinh doanh có thành phần chủ yếu thuộc nhóm neonicotinoid (imidacloprid, acetamiprid), nhóm macrocyclic lacton (abamectin, emamectin), nhóm phosphor hữu (chlorpyrifos) nhóm pyrethroid (cypermethrin) Kết cho thấy xu hướng sử dụng HCBVTV nay, sử dụng HCBVTV độc phối hợp nhiều thành phần loại thuốc Trong số này, hợp chất nhóm phosphor hữu nhóm pyrethroid quan tâm từ lâu, hợp chất nhóm neonicotinoid nhóm macrocyclic lacton chưa quan tâm Hiện nay, yêu cầu công bố sản phẩm Bộ Y tế xác định nhóm nhóm clor hữu cơ, phosphor hữu cơ, carbamat pyrethroid -12- - Về số lượng hoạt chất sử dụng, tổng số 39 hoạt chất có hoạt chất (20 tên thương mại) nhóm phosphor hữu cho thấy nhóm sử dụng phổ biến Ngồi ra, nhóm carbamat, neonicotinoid, pyrethroid, macrocyclic lacton nhóm phổ biến (từ 10-12 tên thương mại) Khơng có hoạt chất nhóm clor hữu kinh doanh Kết với số lượng sở kinh doanh, lần khẳng định xu hướng sử dụng HCBVTV Các loại HCBVTV có độc tính cao thuộc nhóm clor hữu loại bỏ hoàn toàn - Trong 75 loại HCBVTV, có 56 loại thuốc trừ sâu (74,7%), loại thuốc trừ nấm (12,0%) loại thuốc trừ cỏ (10,7%), có loại thuốc tăng trưởng (acid giberellic) loại thuốc trừ chuột (kẽm phosphid) Như vậy, mục đích việc sử dụng HCBVTV nơng nghiệp nói chung trồng thuốc nói riêng nhằm trừ sâu hại - Việc khảo sát dựa sở phiếu hỏi danh sách HCBVTV cửa hàng kinh doanh Tuy nhiên, có số loại HCBVTV không bán cửa hàng vật tư nông nghiệp mà mua bán truyền tay Việc tìm hiểu loại HCBVTV phải thơng qua người dân địa phương Các loại HCBVTV thu thập khơng có thơng tin hoạt chất hàm lượng tiếng Việt hay tiếng Anh Các hoạt chất xác định sau phân tích PTN Các sản phẩm thuộc nhóm phosphor hữu cơ, nhiên cịn nhiều sản phẩm tương tự sử dụng Điều cho thấy, việc quản lý sử dụng HCBVTV cịn gặp nhiều khó khăn 4.1.2 Về loại HCBVTV sử dụng trồng thuốc - Theo kết khảo sát sơ có 28 loại HCBVTV với 23 hoạt chất sử dụng, loại HCBVTV có thành phần loại HCBVTV có thành phần Tất hoạt chất phù hợp với hoạt chất khảo sát cửa hàng kinh doanh HCBVTV Những hoạt chất (trừ acid giberellic chất tăng trưởng) ưu tiên lựa chọn để đưa vào nghiên cứu phân tích - Trong số HCBVTV sử dụng, nhóm phosphor hữu dùng nhiều (25% số thuốc 18% số hoạt chất) Kết phù hợp với kết khảo sát cửa hàng kinh doanh HCBVTV thấp so với nghiên cứu trước Trần Việt Hùng (36% số thuốc 37% số hoạt chất) Sự khác biệt xu hướng sử dụng HCBVTV thuộc nhóm neonicotinoid (14% số thuốc 13% số hoạt chất) macrocyclic lacton (18% số thuốc 9% số hoạt chất) Các nhóm khác bao gồm nhóm pyrethroid, nhóm carbamat, nhóm strobin… - Trong số hoạt chất sử dụng, khơng có hoạt chất nằm danh mục cấm sử dụng hay danh mục hạn chế sử dụng Việt Nam So với kết phân tích HCBVTV, có mẫu phát HCBVTV danh mục cấm sử dụng (endosulfan sulfat) mẫu phát HCBVTV danh mục hạn chế sử dụng (carbofuran) Có thể thấy rằng, bên cạnh việc sử dụng HCBVTV có nguồn gốc rõ ràng, tồn loại HCBVTV truyền tay chưa kiểm soát - Các HCBVTV sử dụng cho 24 loại dược liệu khác nhau, đa số thân thảo với phận dùng hoa Có 21/28 loại HCBVTV sử dụng để trừ sâu hại Điều phù hợp với nguy bị sâu hại phận dùng nói -13- 4.2 Về phương pháp phân tích dư lượng hố chất bảo vệ thực vật dược liệu sản phẩm dược liệu Luận án đóng góp phương pháp phân tích áp dụng để phân tích HCBVTV dược liệu sản phẩm từ dược liệu Phương pháp dựa kỹ thuật chiết QuEChERS phân tích sắc ký lỏng sắc ký khí khối phổ hai lần áp dụng để phân tích đồng thời nhiều HCBVTV phương pháp thông thường Hơn nữa, phương pháp có nhiều ưu điểm phương pháp theo Dược điển nước, giảm thời gian phân tích, quy trình đơn giản dễ thực hiện, giảm chi phí phân tích, giảm ảnh hưởng đến môi trường sức khoẻ kiểm nghiệm viên, đồng thời đạt độ xác theo yêu cầu 4.2.1 Lựa chọn đối tượng nguyên liệu nghiên cứu 4.2.1.1 Lựa chọn HCBVTV cho nghiên cứu phân tích Trên sở khảo sát tình hình kinh danh HCBVTV sử dụng HVBVTV trồng thuốc bảo quản dược liệu, HCBVTV có chứa nguy lớn lựa chọn để phân tích bao gồm: - Các hoạt chất sử dụng nhiều trồng thuốc gồm có abamectin, acetamiprid, acetochlor, atrazin, azoxystrobin, carbaryl, carbendazim, chlorpyrifos, cypermethrin, dimethoat, emamectin, fenobucarb, imidacloprid, indoxacarb, isoprocarb, permethrin, tebuconazol, thiamethoxam, trichlorfon - Một số hoạt chất thường gặp có thành phần thuốc kinh doanh phổ biến (trừ hoạt chất trên): aldicarb, chlorothalonil, edifenphos, methiocarb, methomyl, profenofos, propoxur - Một số hoạt chất có thành phần thuốc khơng nguồn gốc: acephat, dichlorvos, carboxin - Một số hợp chất cấm sử dụng hạn chế sử dụng: aldrin, endosulfan sulfat carbofuran Các HCBVTV lựa chọn để nghiên cứu có khác biệt rõ so với nghiên cứu trước Các HCBVTV nhóm clor hữu khơng lựa chọn kết khảo sát cho thấy khơng sử dụng Trong 32 hợp chất nghiên cứu, có HCBVTV nhóm phosphor hữu cơ, HCBVTV nhóm carbamat, HCBVTV nhóm neonicotinoid, HCBVTV nhóm pyrethroid, HCBVTV nhóm macrocyclic lacton, HCBVTV nhóm clor hữu số HCBVTV thuộc nhóm khác Trong danh mục cấm sử dụng cịn nhiều HCBVTV nhóm clor hữu cơ, nhiên nguy nhiễm nhóm thấp nên có aldrin endosulfan sulfat lựa chọn nhằm đánh giá khả áp dụng phương pháp nhóm HCBVTV Ngồi ra, số HCBVTV khác sử dụng, nhiên thiếu chất chuẩn nên chưa thực phân tích Các chất bao gồm: buprofezin, fenitrothion, cyhalothrin acid gibberellic Trong số 32 HCBVTV lựa chọn, có HCBVTV cho hiệu phân tích tốt với GC, số HCBVTV phân tích đồng thời GC LC, đa số hợp chất cần sử dụng LC để phân tích 4.2.1.2 Lựa chọn nguyên liệu nghiên cứu -14- Dược liệu đa dạng chủng loại, nhiên để phù hợp với đối tượng có nguy nhiễm HCBVTV nhất, loại dược liệu có phận dùng lá, thân thảo lựa chọn Hai loại dược liệu tươi sử dụng để thẩm định phương pháp mã đề bồ cơng anh Hơn nữa, quy trình chiết HCBVTV mẫu dược liệu tươi mẫu khơ có khác biệt, dược liệu khô khảo sát riêng Để đánh giá ảnh hưởng pH mẫu đến quy trình chiết, hai loại dược liệu khơ dây thìa canh (mơi trường trung tính) giang (mơi trường acid) lựa chọn để khảo sát Sản phẩm từ dược liệu nghiên cứu thực phẩm chức có thành phần thảo dược Trong loại TPCN, sản phẩm dạng trà thảo dược chứa nguy nhiễm HCBVTV lớn có quy trình sản xuất đơn giản (chủ yếu xay nhỏ đóng gói) Trà mướp đắng sử dụng để thẩm định phương pháp Ngoài ra, để đánh giá khả áp dụng phương pháp mẫu dược liệu chứa nhiều tannin hay polyphenol, chè xanh (khô) sử dụng Việc lựa chọn đối tượng mẫu đa dạng cho thấy khả áp dụng rộng phương pháp QuEChERS nghiên cứu dược liệu 4.2.2 Về phương pháp xử lý mẫu Trong nghiên cứu này, khảo sát lựa chọn điều kiện tối ưu phương pháp xử lý mẫu theo QuEChERS áp dụng mẫu dược liệu sản phẩm dược liệu Đây lần Việt Nam, phương pháp QuEChERS nghiên cứu để xác định dư lượng HCBVTC mẫu dược liệu Các kết cho thấy phương pháp có nhiều ưu điểm so với phương pháp quy định Dược điển Việt Nam: - Phương pháp áp dụng dải rộng nhiều loại HCBVTV nhiều loại mẫu dược liệu có chất khác Theo kết thu chương 3, độ thu hồi hầu hết HCBVTV nghiên cứu nằm khoảng từ 80-110%; độ thu hồi tất HCBVTV nghiên cứu khoảng 70-120% Do đó, phương pháp ứng dụng để sàng lọc nhiều HCBVTV lần phân tích - Bên cạnh việc sàng lọc, phương pháp ứng dụng để định lượng HCBVTV dược liệu sản phẩm từ dược liệu Các kết thẩm định cho thấy phương pháp có độ xác tốt độ nhạy đáp ứng yêu cầu - Phương pháp sử dụng dung môi (15 mL acetonitril), không sử dụng dung môi có tính độc hại cao mặt giảm ảnh hưởng đến sức khỏe kiểm nghiệm viên, giảm ảnh hưởng đến môi trường, mặt khác tiết kiệm chi phí phân tích - Sử dụng kỹ thuật làm với chiết phân tán pha rắn, không cần thực làm sắc ký cột quy định theo Dược điển Việt Nam Quy trình chiết nhanh, tổng thời gian xử lý lô mẫu chưa đến 30 phút mà đảm bảo hiệu làm mẫu độ xác phương pháp - Phương pháp QuEChERS hướng đến khả chiết xuất đồng thời nhiều HCBVTV thuộc nhiều nhóm khác nhiều nồng độ khác lần xử lý mẫu Phương pháp QuEChERS nghiên cứu tối ưu mẫu rau quả, nhiên áp -15- dụng mẫu dược liệu cần phải có điều chỉnh thích hợp để đạt hiệu suất chiết tốt 4.2.2.1 Lượng mẫu ban đầu Nhằm mục đích giảm thiểu dung mơi, giảm bước chiết phương pháp QuEChERS hướng đến giảm lượng mẫu ban đầu Các phương pháp trước thường sử dụng khoảng 2050 g mẫu (đối với mẫu tươi) Phương pháp QuEChERS sử dụng ≤ 15 g mẫu Việc giảm lượng mẫu giúp trình chiết thực dễ dàng hơn, giảm lượng dung mơi, hố chất sử dụng Tuy nhiên, giảm lượng mẫu, địi hỏi q trình đồng phải tốt để phần mẫu đem phân tích đủ đại diện cho mẫu Để đảm bảo độ đồng nhất, lượng mẫu đủ lớn (khoảng kg trở lên) cần cắt nghiền nhỏ dụng cụ xay nghiền thích hợp Đối với loại dược liệu tươi, lượng mẫu sử dụng 15 g ống ly tâm 50 mL để đảm bảo đủ khơng gian cịn lại cho q trình lắc thêm dung mơi muối chiết Đối với mẫu dược liệu khô, cần phải bổ sung nước để đảm bảo độ ẩm mẫu vòng khoảng 70-90% Việc thêm nước cho phép dung môi tiếp xúc tốt với mẫu đảm bảo trình tách lớp dịch nước dung môi hữu cho thêm muối Lượng mẫu lựa chọn mẫu khô g tiến hành thêm nước với tỷ lệ mẫu : nước : (v/v) So với số nghiên cứu tương tự mẫu khô, tác giả bổ sung thêm nước vào lượng mẫu định (từ 2-3 g) với tỷ lệ mẫu : nước thông thường : (v/v) Về thời gian ngâm mẫu khô nước, kết cho thấy sau 15 phút từ lắc mẫu với nước, hàm lượng HCBVTV có xu hướng giảm dần Nguyên nhân tượng có lẽ số HCBVTV bị chuyển hố mơi trường nước nước làm hoà tan nhiều hợp chất khác từ mẫu gây ảnh hưởng đến khả chiết HCBVTV 4.2.2.2 Dung môi chiết loại dung dịch đệm Acetonitril dung môi cho hiệu tốt QuEChERS có nhiều ưu điểm số dung môi khác aceton ethyl acetat Thứ nhất, acetonitril trộn lẫn với nước tách lớp với nước thêm muối Thứ hai, acetonitril không kéo theo nhiều tạp chất lipid protein, muối nên dịch chiết mẫu Hơn nữa, acetonitril dung môi phù hợp với sắc ký lỏng sắc ký khí Nói chung, đa số HCBVTV chiết acetonitril theo phương pháp QuEChERS Tuy nhiên, HCBVTV phụ thuộc pH bền môi trường kiềm acid lại cho độ thu hồi thấp không sử dụng đệm Có thể dùng đệm acetat citrat Các kết nghiên cứu cho thấy, cần phải sử dụng đệm để đảm bảo có hiệu suất chiết cao mẫu có tính acid Kết phù hợp với nghiên cứu trước đây, điển hình kết Lehotay cộng nghiên cứu rau 4.2.2.3 Nội chuẩn Các nghiên cứu cho thấy, phương pháp QuEChERS cho kết tốt mà không cần sử dụng nội chuẩn Tuy nhiên, để tránh ảnh hưởng chưa biết trình chiết, nội chuẩn sử dụng nghiên cứu Trong kỹ thuật sắc ký khối phổ, nội chuẩn tốt nội chuẩn đồng vị HCBVTV Trong thực tế, dùng đồng vị cho tất các HCBVTV -16- Triphenylphosphat (TPP) qua khảo sát dùng để làm nội chuẩn chất có tính chất tương tự phần lớn HCBVTV Với kết thu được, TPP sử dụng làm nội chuẩn phương pháp QuEChERS 4.2.2.4 Muối chiết Cả ba phiên phương pháp QuEChERS sử dụng muối MgSO4 khan với lượng 0,4 g cho mililit dịch chiết acetonitril (6 g cho 15 mL dịch chiết) MgSO4 đóng vai trị quan trọng tách lớp acetonitril nước Thực tế sau ly tâm, lượng nước lớp dung môi acetonitril (khoảng 8% xác định NMR), lượng nước có vai trị hồ tan HCBVTV phân cực chiết HCBVTV không phân cực không tan hỗn hợp dung môi ban đầu (acetontril-nước khoảng 1:1) Các nghiên cứu Anastassiades cộng nhiều loại muối khác gồm LiCl, MgCl2, NaCl, NaNO3, Na2SO4, MgSO4 cho thấy MgSO4 cho hiệu tốt Các nghiên cứu cho thấy, việc sử dụng đồng thời MgSO4 NaCl với tỷ lệ 4:1 cho hiệu chiết tốt Trong nghiên cứu này, tỷ lệ MgSO4 NaCl giữ cố định 4:1 Natri acetat thêm vào muối chiết, nhiên vai trò thực tạo hệ đệm với acid acetic có thành phần dung mơi acetonitril Hệ đệm acetat có vai trị đảm bảo pH dịch chiết ban đầu (dịch chiết acetonitril) khoảng từ 4,5-5,0 pH tối ưu để chiết phần lớn HCBVTV 4.2.2.5 Làm chiết phân tán pha rắn Chiết phân tán pha rắn (d-SPE) bước làm tạo nên hiệu phương pháp QuEChERS Trong đó, chất hấp phụ PSA đóng vai trị quan trọng q trình làm PSA chất hấp phụ trao đổi anion yếu silica dùng để hấp phụ acid béo, acid hữu Vì có chứa nhóm amin bậc hai, PSA có tác dụng tốt aminopropyl việc làm Theo kết thu được, lượng PSA sử dụng 40 mg cho mẫu dược liệu sản phẩm dược liệu Khi tăng PSA làm tăng hiệu chiết để tiết kiệm chi phí, lượng PSA 40 mg chọn Kết khơng có nhiều khác biệt so với nghiên cứu trước Lượng PSA sử dụng phương pháp QuEChERS ban đầu 25 mg với mililit dịch chiết Sau đó, Lehotay tăng PSA lên 50 mg mililit dịch chiết Đối với mẫu chứa nhiều acid béo ngũ cốc, Mastovska sử dụng lượng PSA đến 150 mg cho mililit dịch chiết Trong bước d-SPE, MgSO4 khan có vai trị loại lượng nước dư dịch chiết acetonitril Lượng MgSO4 sử dụng 150 mg cho mililit dịch chiết Theo nghiên cứu Lehotay, lượng nước có chứa dịch chiết acetonitril khoảng 8% Nếu sử dụng 150 mg MgSO4 khan, lượng nước dịch chiết cuối khoảng 1-2% Đây tỷ lệ chấp nhận phân tích GC Việc sử dụng thêm GCB có tác dụng làm sterol, clorophyl chất có cấu trúc phẳng GCB lưu giữ thuốc trừ sâu có cấu trúc phẳng Sử dụng 7,5 mg GCB với mililit dịch chiết cho độ thu hồi khoảng 70% với thuốc trừ sâu dạng phẳng loại khoảng 90% clorophyl Thực tế, tăng GCB cao hơn, hiệu làm thu -17- tốt hiệu suất đa số HCBVTV lại giảm Do đó, sử dụng 7,5 mg GCB cho mililit dịch chiết phù hợp 4.2.2.6 Sử dụng muối chì acetat xử lý mẫu chè Một đóng góp quan trọng nghiên cứu việc sử dụng muối chì acetat để kết tủa tannin mẫu chè, giúp giảm ảnh hưởng nhờ tăng hiệu suất chiết HCBVTV Việc sử dụng chì acetat mở rộng loại dược liệu có chứa nhiều tannin khác Đây là kết chưa thấy báo cáo nghiên cứu trước Nguyên lý quy trình xử lý ion Pb2+ tạo phức với tannin tạo thành chì (II) tannat, phức kết tủa loại khỏi pha lỏng nhờ trình ly tâm Pb2+ dư hòa tan vào pha nước tách khỏi dung môi chiết (acetonitril) nhờ phân bố lỏng lỏng với muối MgSO4 NaCl Do đó, lượng dư Pb2+ khơng ảnh hưởng đến phân tích thiết bị Để đánh giá hiệu việc xử lý mẫu với chì acetat, sử dụng giá trị ảnh hưởng (%ME) Kết so sánh ảnh hưởng theo phương pháp nghiên cứu với ảnh hưởng theo nghiên cứu Raski mẫu chè cho thấy có nhiều HCBVTV cho ảnh hưởng thấp theo phương pháp nghiên cứu, có HCBVTV cho ảnh hưởng thấp theo phương pháp Raski Do đó, thấy việc sử dụng chì acetat góp phần làm mẫu tốt mẫu chè 4.2.3 Về phương pháp phân tích sắc ký khối phổ Các phương pháp xác định HCBVTV theo quy định Dược điển Việt Nam chủ yếu sử dụng phương pháp sắc ký khí với detector NPD ECD Việc sử dụng đồng thời hai kỹ thuật sắc ký khí sắc ký lỏng khối phổ mở rộng đáng kể phạm vi áp dụng nhiều loại HCBVTV 4.2.3.1 Sắc ký lỏng khối phổ Q trình phân tích LC-MS/MS gồm hai giai đoạn: tách LC xác định MS/MS Trong nghiên cứu này, kỹ thuật sắc ký lỏng pha đảo sử dụng với pha tĩnh cột C18 pha động hỗn hợp methanol acid acetic 1% nước Đây điều kiện phân tích sắc ký lỏng dễ dàng áp dụng Chế độ gradient nghiên cứu nhằm tách chất phân tích khỏi mẫu đồng thời đưa điều kiện pha động trạng thái ban đầu để phân tích mẫu Với điều kiện này, có nhiều HCBVTV chưa tách khỏi hoàn toàn Tuy nhiên, việc sử dụng detector MS/MS có tính chọn lọc cao giúp tách HCBVTV tín hiệu Trong MS/MS, HCBVTV ion hố, tạo thành nhiều loại ion khác tuỳ thuộc vào kỹ thuật ion hoá chế độ ion dương hay âm Phương pháp nghiên cứu sử dụng kỹ thuật ion hoá ESI, chế độ ion dương thông thường tạo ion phân tử [M+H]+ ngồi ra, tạo thành số ion khác [M+CH3OH]+, [M+Na]+… Mỗi ion phân tử qua tứ cực thứ hai lại bắn phá để tạo thành ion sản phẩm, hai ion lựa chọn hai ion có cường độ cao Khi sử dụng detector thông thường UV-VIS, FL hiệu tách sắc ký lỏng đóng vai trị quan trọng Tuy nhiên, sử dụng detector khối phổ đặc biệt khối phổ hai lần hiệu tách sắc ký lỏng ảnh hưởng đến kết tính chọn lọc cao -18- detector MS Mỗi HCBVTV đặc trưng ion phân tử, ion sản phẩm khác đó, sắc ký lỏng khơng hồn tồn tách khỏi nhau, qua khối phổ tín hiệu chất tách khỏi hồn toàn Trong phương pháp xây dựng, số HCBVTV rửa giải gần trichlorfon dichlorvos; carboxin carbaryl; isoprocarb atrazin; edifenphos, tebuconazol TPP, nhiên hiệu tách khối phổ đảm bảo Chế độ gradient phương pháp có vai trị tách HCBVTV khỏi thành phần mẫu, thành phần có tính phân cực cao thường rửa giải giai đoạn đầu (0-3 phút) thành phần phân cực rửa giải giai đoạn cuối Việc tách khỏi thành phần giúp giảm ảnh hưởng mẫu trình ion hố kéo theo độ xác khối phổ Trong phương pháp xây dựng, thời gian lưu HCBVTV dao động từ 4-14 phút, đa số hợp chất rửa giải từ 7-11 phút; điều giúp phần giảm ảnh hưởng Mặc dù lý thuyết, sắc ký lỏng khối phổ ứng dụng để phân tích hầu hết HCBVTV Tuy nhiên số hợp chất phân cực khó lưu giữ sử dụng sắc ký pha đảo Ngược lại hợp chất khơng phân cực, q trình ion hố khơng thực Có thể sử dụng kỹ thuật ion hoá khác APCI, APPI … nhiên việc áp dụng khó khăn cần q trình chuyển nguồn dung môi Đối với HCBVTV, theo nghiên cứu Alder cộng cho thấy có 49 HCBVTV số 500 HCBVTV khơng cho tín hiệu LC-MS/MS sử dụng nguồn ion hoá ESI hai chế độ ion dương âm Do đó, để phân tích HCBVTV này, cần phối hợp thêm kỹ thuật phân tích khác GC-MS/MS lựa chọn tốt 4.2.3.2 Sắc ký khí khối phổ Trong vài thập kỷ gần đây, sắc ký khí với detector ECD, NPD hay MS nhiều tác giả nghiên cứu để phân tích HCBVTV cho thấy khả ứng dụng tốt HCBVTV nhóm clor hữu cơ, phosphor hữu pyrethroid Tuy nhiên, thân sắc ký khí khơng thể phân tích trực tiếp tất HCBVTV Đối với chất khó bay hơi, chất bền nhiệt hay hợp chất có độ phân cực cao khó để thực phân tích GC Trong nghiên cứu này, kỹ thuật GC-MS/MS với nguồn ion hoá EI, phân tích khối ba tứ cực sử dụng cho thấy phân tích nhiều HCBVTV Nhiều HCBVTV phân tích đồng thời LC-MS/MS GC-MS/MS So với GC-MS/MS, kỹ thuật LC-MS/MS cho độ nhạy tốt lần Nếu áp dụng mẫu khô, cần phải làm giàu mẫu trước phân tích GC-MS/MS để đáp ứng mức MRL 0,01 mg/kg (10 µg/kg) Trong nghiên cứu HCBVTV phân tích đồng thời hai kỹ thuật, LC-MS/MS ưu tiên lựa chọn ưu điểm độ nhạy Tuy nhiên, phịng thí nghiệm khơng trang bị thiết bị LCMS/MS sử dụng GC-MS GC-MS/MS HCBVTV 4.2.4 Về kết thẩm định phương pháp 4.2.4.1 Tính đặc hiệu, chọn lọc Cả hai kỹ thuật LC-MS/MS GC-MS/MS có tính đặc hiệu cao, có mặt HCBVTV khẳng định chắn thông qua ion phân tử hai ion sản phẩm -19- Theo định 657/2002 Uỷ ban Châu Âu, tính đặc hiệu đánh giá thơng qua số điểm nhận dạng (IP) tỷ lệ ion định tính định lượng Số điểm IP cần phải đạt điểm Trong đó, ion mẹ tính điểm, ion tính 1,5 điểm Như vậy, theo kết thu số điểm IP đạt phương pháp từ 4-5 điểm, đáp ứng yêu cầu đề Tỷ lệ ion định tính định lượng sử dụng để đánh giá tính đặc hiệu Tỷ lệ ion mẫu thử so với tỷ lệ ion chuẩn sử dụng đánh giá phương pháp theo phần mềm kèm thiết bị Do đó, tính đặc hiệu phương pháp phân tích đảm bảo tốt 4.2.4.2 Khoảng tuyến tính đường chuẩn Trong khoảng nồng độ từ đến 200 ng/mL (tương đương mẫu tươi từ 2-200 µg/kg mẫu khơ từ 10-1000 µg/kg), tất các chất phân tích nghiên cứu cho thấy độ tuyến tính đạt yêu cầu Khoảng nồng độ bao trùm giá trị MRL HCBVTV đáp ứng yêu cầu ứng dụng thực tế Trong nghiên cứu này, mẫu có nồng độ cao 200 ng/mL, tiến hành pha loãng dịch chiết mẫu trước phân tích Đường chuẩn phân tích HCBVTV xây dựng mẫu nhằm loại trừ ảnh hưởng Tuy nhiên, xây dựng đường chuẩn tất mẫu nghiên cứu Do đó, mẫu đại diện cho nhóm sản phẩm xây dựng Khi ứng dụng đường chuẩn cho sản phẩm khác nhóm, sai số có giảm thiểu thơng qua việc sử dụng nội chuẩn 4.2.4.3 Giới hạn phát giới hạn định lượng Giới hạn phát giới hạn định lượng thu nghiên cứu tương đồng với kết nghiên cứu giới Các tác giả cố gắng, cách hay cách khác, đạt khả phân tích nồng độ 0,01 mg/kg Trong nghiên cứu này, tất chất phân tích định lượng nồng độ thấp mức 0,01 mg/kg Các kết cho thấy LC-MS/MS cho thấy có nhiều thuận lợi so với GC-MS/MS có độ nhạy tốt thời gian phân tích ngắn Đối với GC-MS/MS để đảm bảo khả phân tích tốt nồng độ 0,01 mg/kg cần trải qua trình làm giàu Mẫu làm giàu lần trước tiêm vào GC-MS/MS mL dịch chiết sử dụng bước làm dSPE (600 mg MgSO4 khan, 160 mg PSA 30 mg GCB), sau 2,5 mL dịch chiết lấy ra, thổi khơ dịng khí N2 40 oC hoà cặn 0,5 mL acetonitril chứa 1% acid acetic sau tiêm vào GC-MS/MS Một số nghiên cứu trước sử dụng kỹ thuật cô mẫu để đảm bảo độ nhạy cần thiết Ngoài ra, số tác giả sử dụng tiêm mẫu thể lớn tiêm mẫu PTV, tiêm đến µL mẫu 4.2.4.4 Độ lặp lại độ thu hồi Các kết độ lặp lại độ thu hồi mẫu khác nhau, nồng độ thấp (0,01 mg/kg), trung bình (0,1 mg/kg) cao (1 mg/kg) cho thấy phương pháp có độ lặp lại tốt độ thu hồi đáp ứng yêu cầu Kết tương đồng so với nghiên cứu trước Kết so sánh độ lặp lại (thông qua RSD%) độ thu hồi (R%) phương pháp -20- nghiên cứu so với số nghiên cứu gần sử dụng kỹ thuật phân tích phương pháp xử lý mẫu theo QuEChERS cho thấy độ lặp lại độ thu hồi phương pháp QuEChERS nghiên cứu tốt Tuy nhiên phương pháp phân tích đa dư lượng, số HCBVTV cho độ thu hồi chưa đạt yêu cầu Độ lặp lại độ thu hồi phương pháp nghiên cứu tương đồng so với kết số nghiên cứu trước giới 4.3 Về dư lượng hoá chất bảo vệ thực vật dược liệu sản phẩm từ dược liệu Tỷ lệ phát HCBVTV mẫu dược liệu tươi lấy số vùng trồng lân cận Hà Nội vượt giới hạn MRL 0,01 mg/kg 36% (8/22 mẫu), tỷ lệ phát HCBVTV mẫu dược liệu khô lấy chợ dược liệu Hà Nội 30% (8/27 mẫu) Dược liệu tươi có tỷ lệ phát cao chưa trải qua trình chế biến gồm việc phơi, sấy… Tuy nhiên, nguồn gốc mẫu dược liệu khô bao gồm dược liệu nhập từ nước (phần lớn Trung Quốc), nên chưa đủ sở để đánh giá liên hệ dư lượng HCBVTV dược liệu tươi dược liệu khơ Tỷ lệ phát trung bình khoảng 30% cho thấy tỷ lệ lớn dược liệu có chứa HCBVTV Tuy nhiên, cỡ mẫu phân tích cịn nhỏ chưa thể đánh giá tồn diện chất lượng dược liệu thị trường Đây lần số nhóm HCBVTV nghiên cứu phân tích dược liệu sản phẩm dược liệu Các nghiên cứu trước xác định HCBVTV nhóm clor hữu cơ, lân hữu pyrethroid Nghiên cứu cho thấy HCBVTV phát chủ yếu thuộc nhóm neonicotinoid (imidacloprid acetamiprid) Ngoài cypermethrin, chlorpyrifos, carbendazim carbofuran phát nhiều mẫu Kết có khác biệt so với nghiên cứu trước Trần Việt Hùng năm 2005, HCBVTV phát DDT, cypermethrin trichlorfon Điều cho thấy xu hướng sử dụng HCBVTV có thay đổi, địi hỏi việc phân tích u cầu quản lý phải thay đổi để kiểm sốt tốt dư lượng HCBVTV dược liệu nói riêng nơng nghiệp nói chung So với số nghiên cứu dược liệu Trung Quốc, tỷ lệ mẫu phát HCBVTV lớn Nghiên cứu Chen cộng phát dư lượng HCBVTV 95/138 mẫu phân tích, chiếm 69% Các HCBVTV phát với tần suất nhiều bao gồm carbendazim, carbofuran, propoxur, triazophos acetamiprid Như vậy, ngoại trừ triazophos, thành phần lại phát tương đồng với kết thu nghiên cứu Một nghiên cứu khác Nguyen cộng dược liệu Hàn Quốc, cho thấy có 4,9% (11/224) mẫu dược liệu có dư lượng HCBVTV Tuy nhiên, nghiên cứu sử dụng GC-MS/MS nên không phát số HCBVTV phân tích LC-MS/MS, điển hình HCBVTV nhóm neonicotinoid (imidacloprid, acetamiprid) Đối với sản phẩm dược liệu, nghiên cứu xác định HCBVTV số loại TPCN dạng viên, dạng trà dạng nước ép Đây sản phẩm sử dụng khơng qua qua trình chế biến đun nấu nên nguy sức khoẻ cao Tỷ lệ phát cao (29,3%), đặc biệt sản phẩm trà thảo dược (40%) cho thấy thực mối lo ngại người sử dụng -21- Trong mẫu TPCN, phát thấy HCBVTV bị cấm (endosulfan sulfat) hay HCBVTV hạn chế sử dụng (carbofuran) Một số mẫu phát thấy hàm lượng cao chlorpyrifos cypermethrin, permethrin Đây HCBVTV truyền thống sử dụng phổ biến từ trước đến Những HCBVTV BYT kiểm soát (Bộ Y tế quy định kiểm soát HCBVTV thuộc nhóm: clor hữu cơ, phosphor hữu cơ, carbamat pyrethroid) Tuy nhiên, ngồi HCBVTV truyền thống này, cịn phát thấy số HCBVTV điển hình nhóm neonicotinoid (acetamiprid, imidacloprid) Các HCBVTV chưa kiểm sốt mức, cần có chế tài phù hợp để kiểm soát loại HCBVTV Chè xanh loại nông sản phổ biến Việt Nam loại dược liệu đặc biệt Tỷ lệ mẫu chè xanh phát thấy HCBVTV cao (chiếm đến 50%) Hiện nay, chè Việt Nam khơng khó xuất vào thị trường khó tính châu Âu, Nhật Bản Mỹ chưa kiểm soát dư lượng HCBVTV Nhiều lô chè Việt Nam bị nước trả lại nhiễm HCBVTV, nhiễm hai HCBVTV imidacloprid acetamiprid Điều phù hợp với kết nghiên cứu này, phần lớn HCBVTV phát chè thuộc nhóm neonicotinoid gồm có imidacloprid, acetamiprid thiamethoxam Các HCBVTV người trồng chè sử dụng để diệt rầy xanh bọ cánh đỏ chè Như vậy, nhà quản lý cần có định hướng để điều chỉnh thói quen sử dụng HCBVTV chè Về giá trị MRL dược liệu sản phẩm dược liệu, theo Dược điển Việt Nam quy định cho 32 hợp chất, chủ yếu HCBVTV nhóm clor hữu, phosphor hữu pyrethroid Phần lớn HCBVTV khơng cịn sử dụng Còn quy định 46/2007 Bộ Y tế áp dụng sản phẩm rau quả, thực phẩm Trong nghiên cứu này, giá trị MRL mặc định (0,01 mg/kg) sử dụng với mục tiêu hướng đến hài hoà với quy định giới Khi tham gia vào tổ chức thương mại giới, Việt Nam cần đáp ứng yêu cầu nước Do đó, việc áp dụng giá trị MRL mặc định theo quy định nhiều nước giới cần thiết phù hợp Mức MRL mặc định thấp, tỷ lệ phát HCBVTV vượt MRL sản phẩm nghiên cứu cao Qua nghiên cứu hàm lượng HCBVTV dược liệu sản phẩm dược liệu, luận án có đóng góp khiêm tốn hảm lượng HCBVTV dược liệu sản phẩm từ dược liệu Trong nghiên cứu này, lần số nhóm HCBVTV neonicotinoid, macrocyclic lacton phát định lượng Việc phát nhiều HCBVTV dược liệu cho thấy cần tăng cường công tác hậu kiểm HCBVTV bên cạnh việc thiết lập mức MRL mặc định cho dược liệu sản phẩm dược liệu -22- KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Luận án hoàn thành mục tiêu đề thu kết sau: Qua khảo sát tình hình sử dụng HCBVTV trồng thuốc bảo quản dược liệu số địa phương miền Bắc nước ta, nhận thấy: - Các HCBVTV buôn bán phổ biến gồm 39 hoạt chất với 75 tên thương mại nhóm phosphor hữu cơ, nhóm neonicotinoid nhóm pyrethroid sẵn có - Có 23 hoạt chất với 28 tên thương mại sử dụng vùng trồng dược liệu nhóm phosphor hữu cơ, nhóm neonicotinoid, nhóm pyrethroid sử dụng phổ biến Đã nghiên cứu xây dựng thẩm định phương pháp phân tích đa dư lượng HCBVTV dược liệu số sản phẩm dược liệu - Đã xác định điều kiện LC-MS/MS phù hợp để phân tích đồng thời 25 HCBVTV Các HCBVTV tách sắc ký lỏng pha đảo với pha tĩnh C18 theo gradient pha động; phát định lượng MS/MS với nguồn ion hoá ESI, chế độ ion dương, chất phân tích lựa chọn ion phân tử để tiếp tục phân mảnh tạo hai ion sản phẩm cần thiết - Đã tối ưu điều kiện GC-MS/MS để phân tích HCBVTV Các HCBVTV tách GC; phát định lượng MS/MS với nguồn ion hoá EI, chất phân tích lựa chọn ion phân tử để tiếp tục phân mảnh tạo hai ion sản phẩm cần thiết - Đã khảo sát điều kiện chiết HCBVTV mẫu khác theo nguyên lý phương pháp chiết QuEChERS Hệ đệm acetat với pH từ 4,5-5,0 sử dụng nhằm đảm bảo hiệu suất chiết mẫu khó GCB sử dụng với PSA MgSO4 bước d-SPE để tăng khả làm mẫu Lượng chất hấp phụ phù hợp GCB 7,5 mg, PSA 40 mg cho mililit dịch chiết Đối với dạng mẫu khô, cần bổ sung thêm nước với tỷ lệ nước : mẫu (5:1) - Đối với mẫu có nhiều tanin, chì acetat sử dụng để tăng khả loại tạp thu dịch chiết mẫu hơn, giúp giảm ảnh hưởng - Đã đánh giá ảnh hưởng tất mẫu kết quả, việc sử dụng nội chuẩn đóng vai trò quan trọng để giảm ảnh hưởng mẫu 20% - Đã thẩm định phương pháp cho thấy phương pháp có tính đặc hiệu cao, có khả định lượng HCBVTV nồng độ thấp MRL 0,01 mg/kg; có độ xác đạt u cầu với độ lặp lại < 20% độ thu hồi từ 70-120% cho tất chất; phần lớn chất có độ lặp lại < 15% độ thu hồi từ 80-110% Đã sơ đánh giá dư lượng 32 HCBVTV mẫu gồm dược liệu tươi, dược liệu khơ, TPCN có thành phần thảo dược chè Có khoảng 30% số mẫu phát thấy HCBVTV với hàm lượng vượt MRL 0,01 mg/kg Các mẫu chè mẫu TPCN dạng trà túi lọc phát thấy tỷ lệ nhiễm cao hơn, 50% 40% -23- KIẾN NGHỊ - Các quan ban ngành cần có biện pháp nâng cao nhận thức người dân HCBVTV cách sử dụng chúng trồng nông sản dược liệu - Cần bổ sung, hoàn thiện quy định mức MRL dược liệu sản phẩm dược liệu, đặc biệt TPCN Quy định mức MRL cần hướng đến xu hướng hội nhập quốc tế, quy định mức MRL mặc định cần thiết - Cần thiết phải quy định kiểm soát số HCBVTV chưa ý, điển hình số HCBVTV nhóm neonicotinoid Song song, cần phải tăng cường giám sát, hậu kiểm dư lượng HCBVTV dược liệu sản phẩm dược liệu - Tiếp tục nghiên cứu phân tích dư lượng HCBVTV khác loại dược liệu sản phẩm dược liệu khác -24- DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ Trần Cao Sơn, Lê Thị Hồng Hảo, Nguyễn Văn Hùng, Trần Thị Thúy, Thái Nguyễn Hùng Thu (2013), "Xác định đa dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật thực phẩm chức có nguồn gốc thảo dược sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ", Tạp chí Phân tích hóa, lý sinh học, tập 18, 3/2013, 69-77 Trần Cao Sơn, Lê Thị Hồng Hảo, Hoàng Thị Thúy Hằng, Thái Nguyễn Hùng Thu (2013), “Xác định đa dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật dược liệu tươi phương pháp QuEChERS sắc ký lỏng khối phổ”, Tạp chí Dược học, 11/2013 (451), 15-20 Trần Cao Sơn, Lê Thị Hồng Hảo, Thái Nguyễn Hùng Thu (2014),"Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật số thực phẩm chức dạng trà thảo dược tỉnh miền Bắc Việt Nam năm 2013", Tạp chí Dược học, 5/2014 (457), 37-41 Trần Cao Sơn, Đoàn Hạnh Dung, Lê Thị Hồng Hảo, Thái Nguyễn Hùng Thu (2014), "Xác định dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật dược liệu khô QuEChERS sắc ký lỏng ghép nối khối phổ", Tạp chí Dược học, 8/2014 (460), 13-18 Son Cao Tran, Hao Hong Thi Le, Thu Hung Thai-Nguyen (2014), “Determination of Pesticide Multi-residues in Green Tea using a Modified QuEChERS Extraction and Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry Technique”, Acta Alimentaria, Accepted 4/4/2014, ISSN 0139-3006 ... HCBVTV dư? ??c liệu sản phẩm dư? ??c liệu Việt Nam, luận án ? ?Nghiên cứu xác định dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật số dư? ??c liệu sản phẩm từ dư? ??c liệu sắc ký khối phổ? ?? thực Mục tiêu luận án Xác định HCBVTV... vùng trồng dư? ??c liệu phía Bắc; Xây dựng thẩm định phương pháp phân tích đa dư lượng HCBVTV dư? ??c liệu số sản phẩm từ dư? ??c liệu; Sơ đánh giá dư lượng HCBVTV số dư? ??c liệu sản phẩm từ dư? ??c liệu Để đạt... viên từ trung tâm kiểm nghiệm an toàn thực phẩm nhằm kiểm nghiệm dư lượng HCBVTV sản phẩm nông nghiệp sản phẩm thực phẩm chức - Dư lượng HCBVTV số đối tượng dư? ??c liệu sản phẩm từ dư? ??c liệu xác định