Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được luận văn tốt nghiệp này, trước hết em xin bầy tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Xuân Sâm, TS. Lê Quang Hòa người đã tận tình giảng dạy và hướng dẫn em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành bản luận văn này. Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến đã toàn bộ cán bộ Viện CNSH và CNTP trường ĐHBK HN đã giúp đỡ và hướng dẫn em tận tình trong quá trình nghiên cứu tại phòng thí nghiệm :”công nghệ Protein enzyme và kỹ thuật gen“. Qua đây, em cũng xin chân thành cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những người thân đã đọng viên, giúp đỡ và tạo điều kiện cho em hoàn thành bản luận văn này. Hà Nội, ngày 28 tháng 5 năm 2007 Sinh viên Trương Thị Thu Hiền Trang 1 Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền MỘT SỐ TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt: Nghĩa tương ứng: VSV Vi sinh vật UHT(Ultra heat treatment) Xử lý tiệt trùng sữa PCR(Polymerase Chain Reaction) Phản ứng chuỗi trùng hợp dNTP Deoxynucleotide-triphosphate DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylendiamin etetraacetic acid TE TRIS-EDTA CFU( colony forming units) Đơn vị hình thành khuẩn lạc Trang 2 Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH VẼ Bảng 1. Tiêu chuẩn vi sinh vật cho một số sản phẩm sữa Bảng 2. Kết quả ly tâm với E.Coli Bảng 3. Kết quả ly tâm với Bacillus Bảng 4. Kết quả lựa chọn môi trường tăng sinh Bảng 5. Kết quả lựa chọn thời gian tăng sinh với E.coli. Bảng 6. Kết quả lựa chọn thời gian tăng sinh với Bacillus. Hình 1 Hình thái Escherichia coli Hình 2. Hình thái Bacillus cereus. Hình 3. Sơ đồ một số phương pháp của kỹ thuật Real Time PCR Hình 4. Đồ thị chuẩn hóa của phản ứng Real-time PCR Hình 5. Quy trình phát hiện Bacillus và E.coli trên sữa tiệt trùng không đường ở mật độ nhiễm ban đầu 1CFU/1ml Hình 6. Quy trình phát hiện Bacillus trên sữa tiệt trùng không đường ở mật độ nhiễm ban đầu 1CFU/25ml Hình 7. Đường quan hệ tuyến tính giữa giá trị mật độ quang và mật độ tế bào của Bacillus Hình 8. Đường quan hệ tuyến tính giữa giá trị mật độ quang và mật độ tế bào của E.coli Hình 9. Kết quả lựa chọn thời gian ly tâm thích hợp thu sinh khối tế bào vi sinh vật. Trang 3 Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền MỞ ĐẦU Sản lượng sữa và nhu cầu tiêu thụ sữa trên thị trường Việt Nam đang tăng một cách đáng kể, trong 10 năm qua mức độ tiêu thụ là 15 lần. Ước tính đến năm 2010, nhu cầu về các sản phẩm sữa ở nước ta sẽ gia tăng khoảng 10-15% mỗi năm để đạt mức khoảng 10kg/đầu người /năm. Vốn là một thực phẩm bổ dưỡng, sữa cũng là môi trường thích hợp cho các vi sinh vật gây bệnh. Do vậy, công tác kiểm tra, và đảm bảo vệ sinh cho sản phẩm sữa là mối quan tâm hàng đầu của các nhà sản xuất sữa và người tiêu dùng. Tuy nhiên với các phương pháp phân tích hiện nay, một số hiện tượng nhiễm tạp vi sinh vật gây bệnh thường được phát hiện muộn, kết quả là các biện pháp xử lý kỹ thuật ít có hiệu quả và ảnh hưởng nhiều đến quá trình sản xuất Việc xác định các vi sinh vật có khả năng nhiễm tạp trong các sản phẩm sữa bằng các phương pháp truyền thống thường ít chính xác, độ nhạy không cao và thời gian dài. Các kết quả phân tích hầu như không có tính ngăn ngừa chỉ là căn cứ để giải quyết hậu quả của sự nhiễm tạp. Sự chậm trễ của phương pháp này sẽ làm tổn thất lớn cho các nhà máy khi có sự cố nhiễm VSV Đề tài ”Hoàn thiện quy trình phát hiện nhanh Bacillus cereus và Escherichia coli, trong sữa tiệt trùng với sự hỗ trợ của kỹ thuật Real Time PCR” được lựa chọn cũng nhằm góp phần giảm bớt những hạn chế trên của việc phát hiện những vi sinh vật nhiễm tạp. Để đạt mục tiêu trên, nội dung nghiên cứu của đề tài gồm các phần sau: • Lựa chon thời gian ly tâm thu sinh khối tế bào vi sinh vật • Lựa chọn một môi trường tăng sinh cho vi sinh vật. • Lựa chọn thời gian tăng sinh thích hợp cho vi sinh vật • Ứng dụng kỹ thuật Real time PCR để phát hiện nhanh các vi sinh vật B.cereus và E.Coli Trang 4 Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền PHẦN I: TỔNG QUAN I. Hiện trạng ngành công nghiệp sữa Việt nam: Ngành công nghiệp Sữa Việt Nam là một ngành công nghiệp có nhiều triển vọng vì hiện giờ các nhà sản xuất trong nước mới chỉ đáp ứng được 11% nhu cầu tiêu thụ. Nhu cầu sữa trên thị trường cũng tăng không ngừng, năm 1990 tính bình quân trên đầu người mới chỉ ở mức 0,47kg/năm, đến năm 2000 con số nằy đã tăng đến 6,5 kg/năm và đến năm 2005 đạt tới 9kg/ năm. Cùng với sự gia tăng về nhu cầu tiêu thụ thì sản lượng sản xuất sữa đã tăng lên đáng kể. Theo số liệu thống kê năm 2000, sản lượng sữa trong nước đạt 54.000 tấn, năm 2003 tăng hơn gấp hai lần(112000 tấn) và đến năm 2004 con số này đã tăng lên thành xấp xỉ 198000 tấn. Sản lượng sữa được dự báo còn tăng nhanh hơn nữa trong giai đoạn tới. mặc dù có sựu tăng trưởng tốt và sản lượng tiêu thụ và sản xuất nhưng ngành sữa Việt Nam vẫn còn rất nhiều vấn đề cần giải quyết trong bản thân các nhà máy cũng như cơ chế quản lý sao cho đảm bảo chất lượng sản phẩm và quyền lợi người tiêu dùng. Hiện nay, đã có nhiều chương trình chăn nuôi bò sữa ở các vùng miền tuy nhiên vẫn chưa đem lại lợi nhuận kinh tế đáng kể vì những nguyên nhân như mức đầu tư chưa lớn, kỹ thuật chưa đủ đáp ứng và quản lý chưa hiệu quả.Chính vì nguyên nhân trên mà ngành chăn nuôi bò sữa còn vấp phải vòng luẩn quẩn đó là nguồn thu từ bán sữa tươi chưa đủ để đầu tư cơ sở vật chất kỹ thuật tốt. II. Các vi sinh vật nhiễm tạp trong quá trình chế biến sữa 1. Các nhóm vi sinh vật thường gặp Trang 5 Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền Trong sữa luôn chứa một lượng vi sinh vật nhất định ngay cả khi sữa được thu hoạch trong điều kiện vệ sinh tốt. Hệ vi sinh vật trong sữa cũng rất đa dạng bao gồm nấm men, mấn mốc, vi khuẩn và xạ khuẩn. Trong các đối tượng trên thì vi khuẩn được quan tâm hơn cả vì trong sữa chúng thường phát triển vượt trội hơn. Vi khuẩn trong sữa hay gặp nhất đó là nhóm vi khuẩn lactic như Streptococcus lactic, S.diaxetylactic, S. Paracitrovous, Lactobacillus bulgaricum, L.acidophilum, L. Lactic, L.helveticum. [4] Nhóm vi khuẩn này dóng vai trò quan trọng trong sản xuất các sản phẩm lên men từ sữa như sữa chua, phomát. Tuy nhiên nếu chúng có xuất hiện trong các sản phẩm sữa tươi tiệt trùng hoặc sữa tươi thanh trùng thì sẽ là tác nhân làm hỏng sản phẩm dưới dạng tạo kết tụ protein. Dựa vào khả năng chịu nhiệt người ta chia các vi sinh vật thường nhiễm trong sữa thành các nhóm chính sau: 1.1 Vi sinh vật chịu lạnh (Psychrotrophs) Là những vi sinh vật có khả năng phát triển được ở nhiệt độ dưới 7 o C. Trong công nghệ sản xuất sữa nhóm vi sinh vật chịu lạnh hay gặp trong mẫu sữa hỏng là nhóm trực khuẩn Gram (-), thường được xác định thuộc loài Pseudomonas. hầu hết những vi sinh vật chịu lạnh này sẽ nhanh chóng làm hỏng sữa khi được bảo quản ở khoảng nhiệt độ từ 0 đến 10 o C. Tuy nhiên nó lại bị tiêu diệt dễ dàng trong các quá trinh gia nhiệt vì vậy ở sản phẩm đã qua gia nhiệt thì thường hay bị tái nhiễm sau gia nhiệt do điều kiện vệ sinh không đảm bảo. 1.2 Vi sinh vật ưa ấm (Meso philic) Trang 6 Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền Những vi khuẩn ưa ấm quan trọng nhất là Streptococci, Lactobacilli và Coliforms, những vi khuẩn này sản sinh axit, sinh khí và làm mất mùi sữa. Tuy nhiên chúng lại dễ dàng bị tiêu diệt trong quá trình gia nhiệt Pasteur. 1.3 Vi sinh vật chịu nhiệt (Thermoduric) Là nhóm có thể không bị tiêu diệt trong quá trình gia nhiệt pasteur hoặc các xử lý nhiệt khác. Tuy nhiên nhóm này không phát triển ở nhiệt độ gia nhiệt Pasteur. Giống chịu nhiệt hay gặp nhất là Mcrobacterium, Corynebacterrium, Micrococos, Streptococcus và Bacillus 1.4 Nhóm ưa nhiệt (Thermophilic) Là nhóm vi khuẩn phát triển tốt trong điều kiện nhiệt độ xử lý Pasteur. Loài ưa nhiệt thường thấy nhất trong 2 nhóm Bacillus và Clostridium. 1.5 Nhóm ưa nhiệt có thể phát triển trong điều kiện lạnh (Thermoduric Psychrotrophs) là một số ít các vi sinh vật chịu nhiệt hoặc tạo bào tử chịu nhiệt nên vẫn có thể sống sót sau khi gia nhiệt nhưng chúng cũng có khả năng phát triển được trong điều kiện lạnh. Nhóm này thường phát triển chậm sau đó gây hỏng sản phẩm trong quá trình lưu thông sản phẩm. thường hay gặp nhất trong nhóm này là Bacillus.[16] 2.Tổng quan về Bacillus và E.coli E.coli và Bacillus là hai vi sinh vật gây bệnh thường gặp và phát triển tốt trong môi trường sữa, ngoài ra Bacillus còn là vi sinh vật dễ ràng sinh bào tử và bào tử rất dễ nảy mầm vì thế gây khó khăn trong quá trình bảo quản. 2.1 Escherichia coli Trang 7 Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền E.coli là vi sinh vật hiếu khí tuỳ ý hiện diện trong đường ruột của người và các loài động vật máu nóng. Hầu hết các dòng E.coli không gây hại và đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định sinh lý đường ruột. Tuy nhiên có 4 dòng có thể gây bệnh cho người và một số loài động vật là Enteropathogenic E.coli (EPEC), Enterotoxigenic E.coli (ETEC), Enteroinvasive E.coli (EIEC) và Enterohaemorrhagic E.coli (EHEC) hay E.coli O157:H7.[2] Hình 1 Hình thái Escherichia coli Các loài E.coli hiện diện rộng rãi trong môi trường bị ô nhiễm hay phân chất thải hữu cơ, phát triển và tồn tại rất lâu trong môi trường. Gần đây người ta còn chứng minh được rằng E.coli cũng hiện diện trong những vùng nước ấm, không bị ô nhiễm chất hữu cơ. Do sự phân bố rộng rãi trong tự nhiên nên E.coli dễ dàng nhiễm vào thực phẩm từ nguyên liệu hay thông qua nguồn nước trong quá trình sản xuất, chế biến. Các dòng E.coli gây bệnh gây ra các triệu chứng Trang 8 Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền rối lọan đường tiêu hoá. Các triệu chứng lâm sàng thay đổi từ nhẹ đến rất nặng, có thể gây chết người phụ thuộc vào mức độ nhiễm, dòng gây nhiễm và khả năng đáp ứng của từng người. 2.2 Bacillus cereus Bacillus cereus là trực khuẩn Gram dương, sinh bào tử, kỵ khí tuỳ tiện, tăng trưởng được trong khoảng nhiệt độ 5-50 o C, tối ưu ở 35-40 o C, pH dao động từ 4,5-9,3, dễ tạo bào tử và bào tửu nảy mầm rất dễ dàng. Vi khuẩn này hiện diện trong đất, bụi, các loại thực phẩm (Sữa, thịt, rau quả, các loại sản phẩm khô )[2] Trang 9 Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền Hình 2 Hình thái Bacillus cereus Vi khuẩn này sinh ra hai loại độc tố chính là diarrhoeal toxin gây tiêu chảy và emetic toxin gây nôn mửa. Ngộ độc thực phẩm gây ra bởi B.cereus khi thực phẩm được chuẩn bị mà không được giữ trong điều kiện lạnh trong vài giờ trước khi sử dụng. Thực phẩm chứa vi khuẩn ở mật độ 10 6 tế bào/g đủ gây ngộ độc. Triệu chứng ngộ độc gây ra bởi B.cereus chủ yếu là đau bụng, tiêu chảy, không sốt, bắt đầu 4 đến 16 giờ sau khi ăn thực phẩm bị nhiễm và kéo dài trong 12-24 giờ. Một dạng triệu chứng ngộ độc khác là buồn nôn và nôn sau 1-5 giờ ăn phải thực phẩm nhiễm khuẩn, không bị tiêu chảy, kéo dài khoảng 24 giờ III. Tiêu chuẩn vi sinh vật cho một số sản phẩm sữa Giới hạn tối đa về vi sinh vật cho phép có mặt trong các sản phẩm sữa khác nhau là khác nhau. Trong cùng một sản phẩm nhưng ở mỗi quốc gia khác nhau thì giới hạn này cũng khác nhau Tiêu chuẩn Việt Nam Hiện nay Việt Nam đang áp dụng tiêu chuẩn về giới hạn vi sinh vật trong các sản phẩm sữa theo quyết định số 3742/2001/QĐ-BYT ngày 31 tháng 08 năm 2001 của Bộ trưởng Bộ Y tế (Bảng 1)[8] Nhóm sữa a. Sữa khô, sữa bột TSVKHK 5.10 4 Coliforms 10 E.coli 0 Trang 10 [...]... và dễ bị nhiễm • Không thể tiến hành phân tích đồng thời cả hai vi sinh vật E.coli và Bacillus trong một phản ứng PCR • Cần phải chạy điện di và việc phân biệt kết quả dựa vào độ lớn của vạch thu được sau điện di • Các bước tiến hành chưa được tối ưu 3 Đề xuất phương án nghiên cứu hoàn thiện quy trình Với mục tiêu của đề tài là hoàn thiện quy trình phát hiện E.coli và Bacillus nhiễm tạp trong sữa tiệt. .. Để vào tủ lạnh -20 oC trong 15 phút Lấy ra, phá vỡ tế bào trên máy lắc gia nhiệt 96 oC trong 15 phút, 5 phút voltex 1 lần Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút Thu dịch nổi cho phản ứng PCR Hình 6 Quy trình phát hiện Bacillus trên sữa tiệt trùng không đường ở mật độ nhiễm ban đầu 1CFU/25ml 2 Hạn chế của quy trình Đề tài trên đã đưa ra hai quy trình phát hiện Bacillus và E.coli [4] Đối với quy trình phát. .. ứng Real Time RCR - Tiến hành phản ứng Real time PCR theo đúng quy trình đã xây dựng với các mẫu có nồng độ khác nhau như trên - Xác định nồng độ nhỏ nhất các vi sinh vật lựa chọn cho kết quả phản ứng Real time PCR rõ nét Trang 28 Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN I Đề xuất phương án hoàn thiện quy trình phát hiện B .cereus và E.coli trong sữa tiệt trùng 1 Quy trình. .. và Bacillus nhằm giảm tối đa thời gian tăng sinh cho cho quy trình • Lựa chọn thời gian tăng sinh thích hợp cho vi sinh vật để cho kết quả dương tính • Ứng dụng kỹ thuật Real time PCR để phát hiện nhanh các vi sinh vật B .cereus và E.Coli nhằm tăng độ nhạy, độ đặc hiệu của phản ứng và giảm thời gian cho quy trình • Đề xuất một quy trình phát hiện nhanh E.coli và Bacillus đơn giản hơn, hiệu quả hơn và. .. cặp của AND có trình tự tương Trang 13 Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền đồng mà sự có mặt của một đoan gen của một vi sinh vật đích nào đó có thể được phát hiện và số copy có thể xác định chính xác Với kỹ thuật này có thể xác định được nhiều gen đích ( vi sinh vật) trong cùng một thời điểm với mức độ chính xác cao và thời gian nhanh và chính xác 3 Phương pháp phát hiện vi sinh vật bằng kỹ thuật Real. .. Kỹ thuật này cho phép phát hiện được nhiều loài vi sinh vật với thời gian tương đối nhanh và độ nhạy khá cao Phương pháp này có thể áp dụng trong các nhà máy trong công tác phòng ngừa và phát hiện 2.4 Kỹ thuật Microarray, Macroarray: Kỹ thuật này thực chất là dựa trên kỹ thuật lai phân tử, trên các phiến kính hoặc các màng cellulose có gắn hang chục nghìn mẫu do AND theo một trình tự xác định Nhờ vào... trình phát hiện ở mật độ nhiễm chủ động 1 CFU/1ml (Hình 5) đã thành công với cả Bacillus và E.coli Độ nhạy của quy trình là 1CFU/1ml, thời gian tăng sinh cho phản ứng PCR dương tính là 4 giờ với Bacillus và 3 Trang 32 Đồ án tốt nghiệp Trương Thị Thu Hiền giờ với E.coli Độ nhạy của quy trình này thấp (1CFU/1ml ), đối với một số tiêu chuẩn thì độ nhạy này yêu cầu cao hơn nữa Đối với quy trình phát hiện ở... Real Time PCR Nguyên tắc Kỹ thuật Real Time PCR hay còn gọi là PCR động về cơ bản dựa trên nguyên tắc của kỹ thuật PCR Tuy nhiên nó cho phép hiển thị và theo dõi trực tiếp qúa trình nhân bản DNA đang diễn ra theo từng chu trình nhiệt qua sử dụng kỹ thuật phát huỳnh quang Dựa vào độ phát huỳnh quang ta có thể định lượng các đoạn DAN hình thành Do mồi có tính phát quang cho nên có thể đánh dấu chúng với. .. công với cả Bacillus mà chưa đưa ra được kết quả với E.coli Độ nhạy của quy trình là 1CFU/25ml, thời gian tăng sinh cho phản ứng PCR dương tính là 5 giờ Quy trình này tồn tại nhữung hạn chế sau: • Quy trình tiến hành cồng kềnh, phức tạp qua nhiều bước, thời gian tăng sinh cho phản ứng PCR dài • Quy trình thực hiện với một lượng mẫu lớn (200ml) nên rất khó khăn và phức tạp trong quá trình ly tâm và tách... này có rất nhiều kĩ thuật đã phát triển thành phương pháp phát hiện nhanh vi sinh vật • Kĩ thuật ELISA, khi trong mẫu xuất hiện vi sinh vật mục tiêu sẽ xảy ra phản ứng kháng nguyên kháng thể và phản ứng này sẽ được phát hiện nhờ một kháng thể cộng hợp gắn enzym thứ hai làm biến màu cơ chất Ngưỡng phát hiện của kĩ thuật này giao động từ 10 4106 cfu/ml, do vậy trong phân tích phát hiện vi sinh vật thường . giải quy t hậu quả của sự nhiễm tạp. Sự chậm trễ của phương pháp này sẽ làm tổn thất lớn cho các nhà máy khi có sự cố nhiễm VSV Đề tài Hoàn thiện quy trình phát hiện nhanh Bacillus cereus và Escherichia. cereus và Escherichia coli, trong sữa tiệt trùng với sự hỗ trợ của kỹ thuật Real Time PCR được lựa chọn cũng nhằm góp phần giảm bớt những hạn chế trên của việc phát hiện những vi sinh vật. pháp phát hiện vi sinh vật bằng kỹ thuật Real Time PCR Nguyên tắc Kỹ thuật Real Time PCR hay còn gọi là PCR động về cơ bản dựa trên nguyên tắc của kỹ thuật PCR. Tuy nhiên nó cho phép hiển thị và