Đang tải... (xem toàn văn)
Sắc ký là một phương pháp vật lý để tách riêng các thành phần trong một hỗn hợp bằng cách phân chia chúng thành 2 pha: pha động và pha tĩnh. Sắc ký hấp phụ được thực hiện trên một ống thủy tinh thẳng đứng gọi là “cột” với chất hấp phụ đóng vai trò pha tĩnh, dung môi rửa cột đóng vai trò pha động chảy qua chất hấp phụ.
SẮC KÝ CỘT I. NGUYÊN TẮC II. KỸ THUẬT TRIỂN KHAI III. RỬA CỘT IV. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ CỘT NGUYÊN TẮC Sắc ký là một phương pháp vật lý để tách riêng các thành phần trong một hỗn hợp bằng cách phân chia chúng thành 2 pha: pha động và pha tĩnh. Sắc ký hấp phụ được thực hiện trên một ống thủy tinh thẳng đứng gọi là “cột” với chất hấp phụ đóng vai trò pha tĩnh, dung môi rửa cột đóng vai trò pha động chảy qua chất hấp phụ. Đối với các chất riêng biệt trong hỗn hợp, tùy theo khả năng hấp phụ và khả năng hòa tan của nó đối với dung môi rửa cột để được lấy ra lần lượt trước hoặc sau. Chất hấp phụ trong sắc ký cột thừơng dùng là oxid nhôm, silicagel, CaCO 3 , than hoạt tính, polyamid, …Các chất này phải được tiêu chuẩn hóa. Dung môi dùng có thể là 1 hoặc hỗn hợp 2, 3 loại dung môi có tỉ lệ thích hợp. Với các chất hấp phụ cổ điển, dung môi sử dụng có độ phân cực tăng dần. Cột là những ống làm bằng thủy tinh, đầu dưới có khóa, đầu trên có nút mài để nối với một phễu chứa dung môi, loại này thường được bán sẵn trên thị trường với nhiều loại kích cỡ lớn nhỏ. Việc lựa chọn kích thước cột rất quan trọng. Thông thường cột có đường kính nhỏ và chiều dài càng dài thì sự tách càng tốt. NGUYÊN TẮC KỸ THUẬT TRIỂN KHAI a. Chuẩn bị cột Rửa cột thật sạch, tráng với nước cất và sấy khô. Cho bông gòn vào đáy cột (có thể cho thêm một lớp cát mịn sạch). Kẹp cột thẳng đứng trên giá. Cho chất hấp phụ vào cột thường được gọi là nhồi cột. Có 2 cách nhồi cột: nhồi cột ướt và nhồi cột khô. - Nhồi cột ướt: Dùng các chất hấp phụ có khả năng trương phình như Silicagel, Sephadex … - Nhồi cột khô: Dùng các chất hấp phụ không có khả năng trương nở như Al 2 O 3 , CaCO 3 . b. Đưa chất phân tích vào cột Khi đưa chất phân tích vào cột là phải phân tán thành một lớp mỏng đồng đều trên mặt thoáng phẳng. Có nhiều phương pháp để đưa chất phân tích vào cột: - Phương pháp dùng đĩa giấy - Cho thẳng dung dịch thử lên cột - Trộn chất thử với một lượng chất hấp phụ: Trộn dung dịch cần phân tích với một lượng nhỏ chất hấp phụ, trộn đều, sấy khô dung môi rồi cho vào cột bằng cách trải thành một lớp đều trên mặt cột. Trong 3 cách trên, cách cho thẳng dung dịch vào cột là gọn và nhanh hơn cả, nhưng phải đảm bảo các yếu tố sau: • Chất thử hoà tan hoàn toàn. • Dung dịch chất thử phải nạp vào cột đều. • Khi toàn bộ chất thử đã ngấm hết vào cột mới cho tiếp dung môi mới. • Cho dung môi nhẹ nhàng, không làm xáo trộn mặt cột. Nếu chất thử ngấm vào cột tạo thành những lớp có bề dày đều nhau là chứng tỏ kỹ thuật đảm bảo. [...]... thành cột Rót dung môi đầy cột, mở van điều chỉnh áp và bắt đầu hứng các phân đoạn Lượng dung môi rửa cột và thể tích các phân đoạn hứng tùy thuộc vào lượng mẫu tương ứng SẮC KÝ CỘT NHANH KHÔ (Dry-column flash chromatography) Sắc ký cột nhanh khô là một cải biên của sắc ký cột nhanh, dùng áp suất kém để gia tăng tốc độ giải ly của pha động Kỹ thuật này khác với FC là cột sắc ký được rút khô sau mỗi phân... 1978 và được đăng ký bằng phát minh vào năm 1981 (US Patent 4293422) Sắc ký nhanh là kỹ thuật sắc ký lỏng có sự tác dụng của áp suất không khí, thực hiện trên một cột thủy tinh ngắn Nguyên tắc của phương pháp sắc ký nhanh (FC) rất đơn giản, dụng cụ rẻ tiền, sự tách được thực hiện nhanh chóng và có hiệu quả cao Trong phương pháp sắc ký cột nhanh, người ta sử dụng cột thủy tinh ngắn với các đường kính... 1:1:1 5 H2O/ CH3CN/AcOH 7:2:1 Theo dõi quá trình giải ly cột: Với các chất cần phân tích có màu, quá trình giải ly bằng sắc ký cột có thể được theo dõi bằng mắt thường Tuy nhiên, phần lớn các hợp chất thiên nhiên không màu nên việc hứng và kiểm tra các phân đoạn giải ly ra khỏi cột thường bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng Trước khi tiến hành sắc ký cột, người ta dựa vào tài liệu tham khảo để chọn chất... dung môi giải ly cột tùy thuộc vào thực nghiệm và kinh nghiệm của người thực hành SẮC KÝ CỘT NHANH (Flash chromatography) Xuất phát từ yêu cầu thực tế là cần phải có một phương pháp tách và tinh chế các hợp chất thiên nhiên với một lượng mẫu nhỏ, thời gian tiến hành nhanh chóng và làm giảm bớt khả năng phân hủy của các chất có thể gặp trong trường hợp sắc ký cổ điển Phương pháp sắc ký nhanh đã được... chảy qua cột nhanh Áp suất được duy trì như vậy đến khi tất cả không khí trong cột bị đuổi ra ngòai Chú ý không được để lớp Silicagel trên đỉnh cột bị khô Cho chất phân tích vào cột cũng giống như sắc ký cột thường nghĩa là chất cần sắc ký cũng hòa tan vào dung môi rửa cột, điều chỉnh dòng chảy để nén tất cả dung dịch mẫu vào lớp silicagel, sau đó dùng vài ml dung môi tinh chế để rửa quanh thành cột Rót... RỬA CỘT Rửa cột còn được gọi là giải ly chất ra khỏi cột Tùy theo chất hấp phụ dùng và yêu cầu tốc độ chảy của cột mà có thể tiến hành giải ly cột bằng áp suất thường hoặc áp suất nén Rửa cột bằng áp suất thường: nghĩa là dung môi chảy ra nhờ vào trọng lực Rửa cột bằng áp suất nén: Thường cho một dòng khí nén (khí nitrogen hoặc không khí) vào đầu cột Việc lựa chọn các phương pháp rửa cột khác... sắc ký được nạp vào đầu cột ở dạng khô hoặc ướt để có một lớp mỏng và đều Lần lượt triển khai từ dung môi không phân cực đến dung môi phân cực Theo dõi quá trình giải ly và thay đổi hệ dung môi thích hợp bằng sắc ký lớp mỏng Với những cao trích từ cây cỏ, thường chứa rất nhiều thành phần khác nhau nên thường phải thực hiện sắc ký cột nhiều lần để thu được cấu tử sạch mong muốn Ưu điểm của sắc ký cột. .. lần để thu được cấu tử sạch mong muốn Ưu điểm của sắc ký cột nhanh và sắc ký cột nhanh khô là: - Tiết kiệm: so với sắc ký cột cổ điển, kỹ thuật này dùng ít chất hấp phụ và ít dung môi hơn Thời gian tiến hành cũng nhanh hơn - Đơn giản, dễ thực hiện, các dụng cụ thường có sẵn trong phòng thí nghiệm Một số dụng cụ dùng trong sắc ký cột: ... ly dung môi ra khỏi cột Một hợp chất có thể bị chất hấp phụ giữ lại mạnh hay yếu còn tùy thuộc vào độ phân cực của dung môi giải ly Ở sắc ký cột cổ điển, thường dùng dung môi tinh khiết có độ phân cực tăng dần để rửa cột Khi sử dụng silicagel đảo pha làm pha tĩnh, thì pha tĩnh có tính hấp thu tỉ lệ với tính thân dầu của hợp chất được sắc ký Pha động sử dụng thường là nước hoặc các hỗn hợp dung môi... methanol - nước Trên thực tế, nhiều khi dùng những dung môi đơn thuần không tách được nên người ta thường dùng hỗn hợp nhiều dung môi Một số hỗn hợp dung môi thường dùng cho các hợp chất phân cực (dùng cho sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng) CHẤT HẤP PHỤ CỔ ĐIỂN 1 CHCl3/MeOH /H2O 15:12:2 2 CHCl3/MeOH /H2O 8:4:1 3 BuOH/AcOH/H2O 4:1:5 4 CHCl3/MeOH /H2O 13:7:2 5 CHCl3/MeOH /H2O 7:3:1 6 CHCl3/MeOH/EtOAc/ H2O