XÂY DỰNG - TỔ CHỨC - QUẢN LÝ PHÒNG XÉT NGHIỆM MỤC TIÊU : 1 Trình bày được cách thiết kế xây dựng một phòng xét nghiệm 2 Mô tả đúng cách bố trí, sắp xếp hợp lý một phòng xét nghiệm 3 Liệt kê được các trang thiết bị và dụng cụ cần thiết cho cho một phòng xét nghiệm 4 Trình bày được công tác quản lý một phòng xét nghiệm NỘI DUNG: 1 THIẾT KẾ XÂY DỰNG MỘT PHÒNG XÉT NGHIỆM: 1.1 HƯỚNG NHÀ: Tốt nhất là hướng nam Trục của khu nhà theo hướng đông tây, lưng nhà quay về hướng bắc Để tận dụng được ánh sáng mặt trời, mát về mùa hè Tránh gió rét về mùa đông 1.2 NỀN NHÀ: Để tránh ẩm thấp, nền nhà phải cao: 0,8 - 1m Lát gạch men chống trơn để thường xuyên cọ rửa, khử khuẩn 1.3 TƯỜNG NHÀ: Mặt trong tường nên lát một lớp gạch men cao: 0,7- 1m để tiện cho việc cọ rửa, khử khuẩn 1.4 HỆ THỐNG ÁNH SÁNG: Tận dụng ánh sáng tự nhiên một cách tối đa để tiết kiệm điện hoặc dùng ánh sáng đèn, tuỳ điều kiện mỗi nơi song phải đảm bảo hệ thống chiếu sáng là 1/4- 1/5 Nếu tận dụng ánh sáng tự nhiên nên chú ý tới tỷ lệ giữa diện tích các cửa sổ, cửa ra vào, lỗ thoáng với diện tích nền nhà bằng 1/4- 1/5 Ví dụ: diện tích nền nhà bằng 50 m2 thì diện tích các cửa lỗ thoáng phải bằng 10- 13 m2 Kinh nghiệm cửa sổ làm chiều cao: 1,2- 1,4m; chiều rộng: 0,7- 0,8m Nên làm cửa 2 lớp: lớp trong là cửa kính, lớp ngoài là cửa gỗ Cửa ra vào nên làm ở chính giửa phòng 1.5 HỆ THỐNG ĐIỆN NƯỚC: 1.5.1 Hệ thống điện: Tuỳ từng điều kiện cho phép song phải có ổn áp, có công suất lớn riêng cho khu xét nghiệm để đảm bảo nguồn điện ổn định, nâng cao hiệu qủa của máy móc xét nghiệm Phải mắc các ổ cắm điện ngang tầm với chiều cao của bàn làm xét nghiệm để tiện lợi cho việc sử dụng máy móc, có dây nối đất cho từng máy để đảm bảo an toàn về điện khi sử dụng 1.5.2 Hệ thống nước: Phải được cung cấp đầy đủ nước cho khu xét nghiệm, phải xây dựng hệ thống bể dự trữ nước và đường ống dẫn vào các phòng Nếu không có nước máy phải xây dựng hệ thống bể lọc nước để đảm bảo nguồn nước trong, sạch rửa các dụng cụ thuỷ tinh 1 2 TỔ CHỨC, SẮP XẾP MỘT PHÒNG XÉT NGHIỆM: 2.1 TỔ CHỨC, BỐ TRÍ PHÒNG LÀM VIỆC: Tuỳ theo điều kiện của cơ sở, qui mô lớn hay nhỏ ta có thể bố trí như sau: - Phòng hành chính: nên để đầu dãy nhà để cho tiện việc giao nhận, trả phiếu xét nghiệm, sinh hoạt khoa Có 3 khoa riêng biệt: Vi khuẩn-ký sinh trùng, Huyết học, Hoá Sinh Nếu không có điều kiện có thể ghép huyết học và hoá sinh cùng một phòng hoặc một phòng xét nghiệm máu, phòng xét nghiệm phân và nước tiểu, phòng rửa dụng cụ.v.v 2.2 SẮP XẾP TRONG PHÒNG: Ở giữa phòng để bàn làm xét nghiệm Bàn nên làm bằng sắt lát gạch men để dễ làm vệ sinh, khử khuẩn Trên bàn ở giữa có thể kê giá cao, thấp để hoá chất thuốc thử Phía sát tường nên có một dãy tủ chiều cao khoảng 0,8 m để đựng dụng cụ hoá chất, giống như một kho nhỏ của phòng, mặt trên tủ có lát một lớp gạch men trắng để máy móc hoặc có thể dùng làm bàn xét nghiệm - Lavabô: để góc nhà - Bàn nhuộm tiêu bản để cạnh Lavabô - Bàn để máy ly tâm riêng - Bàn để cân phân tích hoặc cân điện riêng - Bàn để kính hiển vi nên đặt sát cửa sổ để tận dụng ánh sáng mặt trời - Các góc của phòng là nơi để các tủ lạnh, tủ ấm, tủ sấy, nồi hấp, máy cất nước Riêng tủ lạnh, nồi hấp, máy cắt nước nên để gần Lavabô để tiện cho việc vận hành, vệ sinh hàng ngày, tránh ẩm ướt khắp phòng Nên bố trí tủ để kính hiển vi riêng, trong tủ có hệ thống đèn dùng để sấy kính, 1 tủ kín có hệ thống thông hơi ra ngoài đựng hoá chất độc 3 TRANG THIẾT BỊ CẦN THIẾT: 3.1 DỤNG CỤ DÂN DỤNG: Nên dùng ghế sắt quay không gỉ, các đồ gỗ (tủ làm việc, tủ đựng hoá chất, giá để hoá chất ) 3.2 NHỮNG MÁY MÓC CẦN THIẾT : - Kính hiển vi - Cần phân tích - Cân điện - Tủ lạnh - Ổn áp riêng cho máy đo quang - Máy ly tâm - Nồi cách thuỷ 2 - Máy đo quang - Tủ ấm - Nồi hấp - Máy cất nước - Tủ sấy - Tủ cấy - Máy điện di - Máy điện giải - Máy đếm tế bào Tuỳ theo điều kiện kinh phí cho phép những máy móc tối thiểu cần cho một phòng xét nghiệm là: kính hiển vi, cân, tủ lạnh, tủ sấy, máy cất nước, máy ly tâm, máy đo quang 3.3 DỤNG CỤ THUỶ TINH (xem bài dụng cụ thuỷ tinh) 3.4 DỤNG CỤ LẤY BỆNH PHẨM: - Dụng cụ lấy máu tĩnh mạch: bơm kim tiêm, dây garô, ống nghiệm, gối kê tay, bông cồn sát khuẩn - Dụng cụ lấy máu mao mạch: kim chích, lam kính, bông thấm, cồn sát khuẩn - Dụng cụ lấy phân: lọ penicilin đã được rửa, sấy khô, hộp nhựa có nắp kín, que tre( tăm bông) để lấy bệnh phẩm giun kim - Dụng cụ lấy nước tiểu: lọ penicilin rửa sạh, sấy khô, ống nghiệm nhỏ, dài để xét nghiệm bằng máy, bình tam giác ≥ 500 ml để lấy nước tiểu 24h - Dụng cụ lấy đờm: hộp nhựa có nắp, lọ thuỷ tinh có nút xoáy - Dụng cụ dùng riêng cho hoá sinh: ống nghiệm các loại, pipet các loại, giá ống nghiệm( giá bằng sắt không rỉ, có lỗ thoáng ở dưới để thoát nước) giá pipet gỗ, pipet tự động , cân đĩa , cân phân tích, máy đo quang, tỉ niệu kế - Dụng cụ dùng riêng cho huyết học: ống hút Sahli, ống hút bạch cầu, hồng cầu, buồng đếm, máy đếm, huyết sắc kế Sahli, ống Wesstergreen đo tốc độ máu lắng, máy đếm tế bào - Dụng cụ dùng riêng cho vi khuẩn: tủ cấy, nồi cách thuỷ, que cấy, lưỡi amiăng, đèn cồn - Các dụng cụ chung khác: pipet, ống đong( thuỷ tinh, nhựa), ống nghiệm, lam kính, lamen, bình đựng nước, bình hút ẩm, đồng hồ bấm giây, thùng tôn, chậu nhựa, vòi hút chân không, nhiệt kế, chổi lông, quả bóp cao su, bút chì kính, nhãn dán, gạc, giấy lọc, giấy đo PH, tủ thuốc sơ cứu tai nạn 3.5 HOÁ CHẤT- THUỐC THỬ: - Acid: các acid hay dùng như acid acetic, acid clohydrric, acid sulfuric, acid Tricloacetic, acid phosphoric 3 - Kiềm: Natrihydroxyt, Kalihydroxyt, amoniac - Muối: KaliIodua, đồng sunfat, natricitrat, natriclorua, natrisunfat, natriacetat - Dung môi: aceton, cồn 950, ether, xylen Các chất khác: cresol đặc, nước oxy già, formol, phenol, vaselin, dầu cede, bột lưu huỳnh, pyramidon - Thuốc nhuộm: xanh metylen, xanh crêzyl brillant, xanh bromothymol, eosin, Fucsin, Giemsa bột, phenol, tím, gentian - Thuốc thử: Bariclorua, Kali feroxyanua, thuốc thử Gros, thuốc thử Fouchet huyết thanh mẫu các loại, dung dịch chuẩn hemoglobin, Kit hoá chất dùng cho máy sinh hoá, dung dịch rửa cho máy đếm tế bào 4 QUẢN LÝ PHÒNG XÉT NGHIỆM: 4.1 QUẢN LÝ TRANG THIẾT BỊ DỤNG CỤ HOÁ CHẤT: - Mỗi trang thiết bị máy móc trong phòng xét nghiệm phải có: + Lý lịch máy + Nội qui sử dụng máy + Người sử dụng bảo quản - Dụng cụ: + Sắp xếp thứ tự + Dụng cụ thuỷ tinh xếp hộp kín, trong tủ ấm để tránh bụi bẩn - Hoá chất: mỗi lọ hoá chất phải có nhãn ghi rõ ràng thời hạn sử dụng Các Kit hoá chất để tủ lạnh, hoá chất độc để trong tủ kính có khoá, có ống thông hơi ra ngoài + Tất cả các máy móc, dụng cụ, hoá chất đều được quản lý bằng thẻ kho theo mẫu sau: Tên Nguồn gốc Dự trù Ngày Nhận Số Ngày lượng Xuất Số lượng Ngày Số lượng 4.2 QUẢN LÝ CHUYÊN MÔN: Quản lý theo chức trách của từng đối tượng cán bộ 4.3 NỘI QUI LÀM VIỆC: - Qui định thời gian lấy bệnh phẩm: tuỳ theo xét nghiệm đa, số lấy bệnh phẩm vào sáng sớm Trường hợp đặc biệt phải lấy bệnh phẩm tại giường - Qui định đối với bệnh phẩm: 4 + Mỗi lọ bệnh phẩm phải có nhãn ghi rõ họ, tên bệnh nhân, khoa phòng điều trị, số giường, số buồng + Những xét nghiệm cấp cứu phải ghi chữ '' cấp cứu'' để ưu tiên làm trước, trả kết quả ngay - Qui định đối với kỹ thuật viên: + Căn cứ yêu cầu xét nghiệm sắp xếp công việc hợp lý + Đánh số thứ tự bệnh phẩm phù hợp với phiếu xét nghiệm + Những xét nghiệm yêu cầu cần phải làm ngay + Những kết quả xét nghiệm cần được ghi vào sổ sách cụ thể + Những kết quả cho kết quả nghi ngờ phải yêu cầu làm lại và báo cáo trưởng khoa xem xét + Những xét nghiệm dễ lây lan phải theo đúng qui tắc phòng dịch + Những xét nghiệm với khí độc phải làm trong tủ có hệ thống thông hơi + Phải tổ chức cấp cứu phòng độc, phòng tai nạn có thể xảy ra + Tổ chức tẩy uế sau giờ làm việc + Tổ chức thường trực để thường trực cấp cứu bệnh nhân + Quản lý chặt chẽ thuốc độc và chất dễ cháy, nổ, các chủng vi khuẩn có tính chất lây lan mạnh LƯỢNG GIÁ: TRẢ LỜI CÁC CÂU SAU: 1 Trình bày nội dung thiết kế xây dựng một phòng xét nghiệm 2 Nêu công tác tổ chức, sắp xếp một phòng xét nghịêm 3 Kể tên những máy móc cần thiết trang bị cho một phòng xét nghiệm 4 Liệt kê các dụng cụ lấy bệnh phẩm 5 Trình bày nguyên tắc quản lý khoa xét nghiệm ĐIỀN VÀO CHO ĐỦ VÀ ĐÚNG CÁC CÂU SAU: 6 5 vấn đề cần lưu ý trong thiết kế xây dựng phòng xét nghiệm là: A Hướng nhà C B D E 7 5 loại trang thiết bị cần thiết cho một phòng xét nghiệm là: A Dụng cụ dân dụng C B Máy móc cần thiết D E 5 PHÂN BIỆT ĐÚNG SAI TRONG CÁC CÂU SAU: 8 Có thể để cân cùng với máy ly tâm 9 Hướng nhà nên làm theo hướng đông 10 Khi lấy máu mao mạch phải dùng dây garô 11 Bàn nhuộm tiêu bản để gần Lavabô CHỌN 1 GIẢI PHÁP ĐÚNG NHẤT: 12 Tường nhà lát một lớp gạch men cao: A 0,7- 1 m B 0,6- 1m C 0,7m D 0,5- 1m E 0,8- 1m KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC MỤC TIÊU : 1 Mô tả đúng các bộ phận của kín hiển vi và nêu tác dụng của nó 2 Trình bày đúng quy trình sử dụng kính 3 Trình bày đúng cách bảo quản kính hiển vi 4.Thao tác đúng.theo qui trình kỹ thuật NỘI DUNG: Kính hiển vi quang học là một dụng cụ quang học không thể thiếu trong phòng xét nghiệm Nó có tác dụng phóng đại ảnh của vật lên nhiều lần giúp cho việc chẩn đoán bệnh chính xác 1 Cấu tạo: 1- Ống trục chính (ống mang thị kính) 2- Đầu kính 3- Bàn xoay 4- Vật kính 5- Thị kính 6- Màn kính 7- Tụ quang 8- Gương 9- Tay cầm (thân kính) 10- Đế kính 11- Ốc đại cấp 12- Ốc vi cấp 6 13- Ốc điều chỉnh tụ quang 14- Đèn soi kính hiển vi 1.1 Ống trục chính (main tu be): Có hình trụ tròn,một đầu mang thị kính, một đầu nối với đầu kính.Có 2 loại: 1 ống trục chính (mang 1 thị kính) gọi là kính 1 mắt, 2 ống trục chính (mang thị kính) gọi là kính 2 mắt, 4 ống trục chính (mang 4 thị kính) gọi là kính 4 mắt (Kính thường dùng cho cả thầy và trò cùng quan sát: kính thầy) 1.2 Đầu kính (Bodytube): Đầu kính có hình tròn hoặc đa giác Trong đầu kính chứa các thấu kính lăng trụ tam giác - Tác dụng: lăng kính này có tác dụng hắt ảnh của vật từ vật kính lên thị kính không bị đảo ngược 1.3 Bàn xoay (Revolingnosepiese): Hình tròn có 3 lỗ mang vật kính và một lỗ gọi là điểm mù không mang vật kính -Tác dụng: Bàn xoay có thể xoay tròn 360 0 giúp cho điều chỉnh vật kính vào giữa mâm kính dễ dàng 1.4 Vật kính (onjective) 7 Đây là một bộ phận quan trọng nhất của kính cần phải bảo vệ tốt để tránh mốc (vật kính mốc sẽ không nhìn thấy ảnh của vật) Đầu dưới vật kính được gắn một hệ thống thấu kính, đầu trên tiếp xúc với hệ thống lăng kính và thị kính - Tác dụng: Phóng đại ảnh của vật lên nhiều lần giúp ta quan sát rõ hình thể của vật Có nhiều loại vật kính với hệ phóng đại khác nhau: 4x, 6x, 8x,10x,40x,90x, 100x Có nghĩa là các vật kính đó phóng đại được:4 lần, 6 lần 100 lần.(vật kính có độ phóng đại 90x,100x còn gọi là vật kính dầu * Sự khác nhau giữa các vật kính: + Vật kính có độ phóng đại nhỏ thì kích thước ngắn, vật kính có độ phóng đại lớn thì kích thước dài + Khoảng cách giữa vật kính với mâm kính khác nhau: • Vật kính 10x: khoảng cách xa(khoảng 15,98mm) Vật kính 40x: khoảng cách gần(khoảng 4,31mm) Vật kính 100x: khoảng cách rất gần(khoảng 1,81mm) Chính vì vậy mà khi dùng vật kính 40x, 100x không bao giờ được dùng ốc đại cấp để tránh vỡ tiêu bản, hỏng vật kính + Cửa sổ ánh sáng(khả năng phân ly của các loại vật kính) • Vật kính 10x: cửa sổ ánh sáng lớn, khả năng phân ly nhỏ(0,3) có khả năng nhìn rõ 2 vật ở xa nhau Vật kính 40x: cửa sổ ánh sáng nhỏ, khả năng phân ly tương đối lớn(0,65) có khả năng nhìn được 2 vật tương đối gần Vật kính 100x(90x): cửa sổ ánh sáng rất nhỏ, khả năng phân ly lớn 1,3, có khả năng nhìn được 2 vật rất gần nhau ở vật kính này khả năng phân ly lớn, ánh sáng không tập trung, khi sử dụng phải dùng ánh sáng tối đa và dầu soi để tăng độ chiết quang(nhỏ một giọt dầu cede) ta nhìn thấy vật rõ nét hơn 8 1.5 Thị kính(Cocular): Có hình trụ tròn được gắn ở đầu ống trục chính ở trong được cấu tạo bởi một hệ thống thấu kính - Tác dụng: phóng đại vật, trên thị kính cũng ghi hệ số phóng đại(6x, 8x, 10x nghĩa là ảnh được phóng đại(6 lần, 8 lần, 10lần ) Ví dụ: nếu soi một mẫu vật có độ phóng đại của thị kính 8x và vật kính có độ phóng đại 10X thì mẫu vật được phóng đại 80 lần, nếu vật kính là 100X thì mẫu vật được phóng đại 800 lần (8 x 100) 1.6 Mâm kính (Stage): Có hình tròn hay hình vuông tuỳ nơi sản xuất - Tác dụng: nâng đỡ mẫu vật(tiêu bản).Trên mâm kính có một lỗ tròn hoặc vuông hoặc bầu dục để cho ánh sáng đi thẳng từ gương qua tụ quang lên vật kính Trên mâm kính còn có một hệ thống kẹp giữ tiêu bản Một bộ phận di chuyển tiêu bản gọi là xe đẩy(Chariot) cótác dụng đưa tiêu bản lên trên, xuống dưới, sang phải, sang trái, có bộ phận thước đo gọi là duxich 1.7 Tụ quang (Sub Stage): Là một hệ thống thấu kính - Tác dụng: Tập trung, hội tụ ánh sáng lên vật định soi Nếu để tụ quang thấp thì ánh sáng được tập trung ít, nếu đưa tụ quang lên cao thì ánh sáng được tập trung nhiều(khi soi vật kính 10X nên hạ thấp tụ quang; khi soi vật kính 40X, 100X phải nâng tụ quang lên cao để tập trung ánh sáng Ở tụ quang còn được gắn 2 bộ phận là: chắn sáng và lọc sáng - Chắn sáng: là những lá nhựa xếp theo hình đồng tâm Muốn ánh sáng mạnh thì mở rộng chắn sáng, muốn ánh sáng nhỏ thì thu hẹp ánh sáng - Lọc sáng: Đặt ở dưới tụ quang, hình tròn, màu xanh có tác dụng làm dịu ánh sáng khi soi kính, khi không cần thiết có thể tháo ra 9 1.8 Gương: Hình tròn, có một mặt phẳng, một mặt lõm - Tác dụng: Phản xạ ánh sáng (hắt ánh sáng) lên vật định soi - Gương phẳng để lấy ánh sáng gần - Gương lõm lấy ánh sáng xa hơn 1.9 Thân kính:(tay cầm) (arm) Hình cong hoặc gấp khúc - Tác dụng: nâng đỡ ống trục chính và mâm kính Trên thân kính mang các ốc đại cấp, vi cấp Có tác dụng điều chỉnh khoảng cách giữa vật kính và tiêu bản Chú ý: - Khi sử dụng vật kính 10X thì điều chỉnh ốc đại cấp (nâng mâm kính gần sát vật kính rồi vặn ốc đaị cấp để hạ dần mâm kính xuống, khi thấy ảnh của vật thì điều chỉnh ốc vi cấp cho ảnh rõ nét hơn) - Khi dùng vật kính 40X, vật kính dầu chỉ điều chỉnh ốc vi cấp Nếu sử dụng nhầm sang ốc đại cấp dễ bị vỡ tiêu bản, hỏng vật kính 1.10 Đế kính- chân kính(Base Foot): Hình chữ nhật hay hình móng ngựa, chắc chắn, giữ cho kính cố định 2 QUY TRÌNH SỬ DỤNG 2.1 Tháo, lắp kính 2.1.1 Tháo kính: thứ tự các bước như sau: 10 VD2 S - Proteine, massc = 75 g/l (Pháp) Protein - HT, NĐKL VD3 JU-glucose, ams = 75 g/l (Việt Nam) = 13,8mmol Glucose-NT24, LC = 13,8 mmol LƯỢNG GIÁ TRẢ LỜI CÁC CÂU SAU: 1 Trình bày các tiếp đầu ngữ của hệ SI 2 Trình bày các đơng vị cơ sở và các đơn vị dẫn xuất đơn giản 3 Trình bày các đơngvị thường dùng trong hoá sinh lâm sàng 4 Viết công thức chuyển đổi giữa nồng độ khối lượng- nồng độ lượng chất - Nồng độ lượng chất và nồng độ mili đương lượng - Nồng độ U/l và nKat/e - Đơn vị Pascal và milimet thuỷ ngân 5 Trình bày trình tự cách biểu thị các kết quả xét nghiệm Điền vào cho đủ và đúng các câu sau: 6 4 loại đơn vị thường dùng trong xét nghiêm hoá sinh là: A Khối lượng C……………………… B……………………… D……………………… 7 - 7 đơn vị cơ sở của hệ SI là: A Độ dài D……………………… B Khối lượng E……………………… C……………………… G……………………… H……………………… Phân biệt đúng sai các câu sau: 8 Một ngày bằng 86000S 9 Chữ viết tắt của hồng cầu là erc 10 Huyết tương được gọi là Plasma 11 Nước tiểu có tên là URine 114 12 1mmHg= 0,113 Kpa 13 1lít= 1dm3 14 Nồng độ lượng chất có tên là: Subtance Concentration Chọn một giải pháp đúng bằng cách khoanh tròn vào chữ cái đầu câu: 15 Huyết tương của bệnh nhân lúc đói viết tắt là: A 1pt C aSg E Erc B fpt D LVC F (fpt) P PHƯƠNG PHÁP MIỄN DỊCH MỤC TIÊU: Sau khi học xong học viên trình bày lại được : - Định nghĩa kháng nguyên , kháng thể - Thế nào là phức hợp kháng nguyên kháng thể - Nguyên tắc kỹ thuật miễn dịch độ đục - Nguyên tắc kỹ thuật điện di miễn dịch - Nguyên tắc kỹ thuật điện di miễn dịch định lượng - Nguyên tắc kỹ thuật miễn dịch phóng xạ - Nguyên tắc kỹ thuật miễn dịch enzym NỘI DUNG : Mọi sinh vật đều có khả năng tự bảo vệ chống lại sự xâm nhập của các vật lạ bên ngoài dù có hại hay không, nhằm đảm bảo tính toàn vẹn của cơ thể Khả năng tự bảo vệ xuất hiện ngay ở những cơ thể sống cấp thấp nhất Cùng với sự tiến hoá, các biện pháp bảo vệ ngày càng phong phú và hoàn thiện Đáp ứng miễn dịch là một biện pháp quan trọng và phức tạp nhất Miễn dịch là khả năng của cơ thể nhận diện được các vật lạ (trong miễn dịch học gọi là kháng nguyên) Ở người đáp ứng miễn dịch tạm chia làm hai loại là miễn dịch tự nhiên và miễn dịch thu được Hai loại miễn dịch này song song tồn tại và liên quan với được nhau chặt chẽ 115 Miễn dịch tế bào là khả năng của các tế bào nhận diện các chất lạ , thu nhận để đào thải ra ngoài Miễn dịch thể dịch là những phức hợp protein trong huyết thanh có tác dụng trung hoà các chất lạ Trong phần viết này chúng tôi chỉ đề cập tới phần miễn dịch thể dịch 1 KHÁNG NGUYÊN Kháng nguyên là chất được hệ thống miễn dịch nhận biết một cách đặc hiệu, gây ra đáp ứng miễn dịch (tính sinh kháng thể hay tính gây mẫn cảm) Các kháng nguyên thường là những phân tử lớn: các protein, polysaccarid Các phân tử trên có thể ở dạng tự do trong dung dịch hoặc gắn với bề mặt của tế bào, vi khuẩn, siêu vi khuẩn Một số hợp chất có phân tử nhỏ: kim loại nặng (Crom, niken) hay một số thuốc, các chất này sẽ trở thành kháng nguyên khi chúng kết hợp với protein Các đặc tính của kháng nguyên: - Đặc tính sinh kháng thể Tính sinh kháng thể là khả năng của kháng nguyên tạo ra một đáp ứng miễn dịch Đáp ứng này có thể là tế bào hay dịch thể -Tính đặc hiệu Tính đặc hiệu là kháng nguyên sẽ phản ứng với các sản phẩm của đáp ứng miễn dịch 2 KHÁNG THỂ Kháng thể là những protein huyết thanh , các globulin miễn dịch, được tạo ra từ tế bào lympho, có tác dụng đặc hiệu với kháng nguyên tạo thành phức hợp kháng nguyên kháng thể Các globulin miễn dịch : Các globulin miễn dịch được ký hiệu là Ig Có nhiều loại globulin miễn dịch, mỗi loại có cấu trúc và chức phận khác nhau Tất cả các globulin miễn dịch đều có cùng cấu trúc cơ bản Gồm chuỗi polypeptid nặng (H: heavy) và hai chuỗi nhẹ (L: light) nối với nhau bằng cầu disulfua Có 5 loại chuỗi nặng tương ứng với 5 loại globulin miễn dịch - Các chuỗi γ tương ứng với các IgG - Các chuỗi µ tương ứng với các IgM - Các chuỗi α tương ứng với các IgA - Các chuỗi ε tương ứng với các IgE - Các chuỗi δ tương ứng với các IgD Chuỗi nhẹ cũng có hai loại : chuỗi kapa (κ) và chuỗi lamda (λ) IgG 116 Có 4 loại: IgG1 ,IgG2, IgG3, IgG4, trọng lượng phân tử chung là 146.000, trừ IgG là 170.000, nồng độ chung của IgG trong máu là 11g/l, người Việt nam cao hơn, khoảng 14g/l, trong đó IgG1 66%, IgG2 23%, IgG3 7%,IgG4 4% IgM Trọng lượng phân tử lớn : 970.000, nồng độ trong huyết thanh 1,2g/l, ở người Việt nam :1,4g/l IgA Gồm IgA1 chiếm 80% và IgA2 20% , trọng lượng phân tử 400.000, dạng monome (TLPT: 160.000) Nồng độ trong máu 2,4g/l, người Việt nam 3,5g/l IgD Hàm lượng IgD trong huyết thanh rất thấp, vai trò của IgD cũng chưa rõ, TLPT: 160.000 IgE Nồng độ IgE trong huyết thanh rất thấp : 0,0001g/l, ở người Việt nam cao hơn gấp 3 –6 lần TLPT: 190.000, giữ vai trò quan trọng trong viêm và trong quá mẫn tức khắc 3 PHỨC HỢP KHÁNG NGUYÊN - KHÁNG THỂ Phản ứng kết hợp kháng nguyên (KN) và kháng thể (KT) là phản ứng cơ bản của đáp ứng miễn dịch Trong cơ thể phản ứng kết hợp KN-KT có nhiều biểu hiện khác nhau từ mức độ im lặng, thường là có lợi cho cơ thể đến những biểu hiện ầm ĩ có thể nguy hiểm đến tính mạng Trong xét nghiệm , phản ứng kết hợp kháng nguyên kháng thể là cơ sở của nhiều thử nghiệm dùng để phát hiện hoặc kháng nguyên hoặc kháng thể hoặc cả hai, được sử dụng nhiều trong lĩnh vực miễn dịch và nhiều lĩnh vực khoa học khác Cơ chế kết hợp kháng nguyên kháng thể Khi trộn kháng thể và kháng nguyên đặc hiệu tương ứng thì chúng sẽ kết hợp với nhau có thể nhận thấy bằng mắt thường khi chúng ở dưới hình thức lên bông, kết tủa hay ngưng kết Sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể nhờ các liên kết ion, lực tĩnh điện, lực Vander Walls do đám mây điện tử quanh nguyên tử, lực kỵ nước 4 CÁC KỸ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG: Có thể định lượng một kháng thể khi có một kháng nguyên tinh khiết hoặc thuần nhất Dựa vào các loại phản ứng kháng nguyên kháng thể có các kỹ thuật định lượng sau: Phản ứng kết tủa : Một số phản ứng kháng nguyên kháng thể có thể nhận thấy ngay bằng mắt thường như hiện tượng kết tủa Một số kỹ thuật dựa trên hiện tượng này như các kỹ thuật miễn dịch khuếch tán.Với hiện tượng ngưng kết kháng nguyên kháng thể được áp dụng trong các kỹ thuật miễn dịch huyết học như :Test Coombs Một số phản ứng kháng nguyên kháng thể không nhận thấy trực tiếp, người ta phải dùng các kỹ thuật ghi dấu như: 117 kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang, kỹ thuật miễn dịch phóng xạ , kỹ thuật miễn dịch enzym Sau đây là một số kỹ thuật thuộc lĩnh vực hoá sinh miễn dịch 4.1 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH KHUẾCH TÁN (Immunodiffusion) Kỹ thuật miễn dịch khuếch tán được thực hiện trong môi trường gel thạch, khi KN và KT gặp nhau gây kết tủa, tủa không di chuyển có thể nhìn thấy được hoặc có thể nhuộm để thấy rõ hơn Kỹ thuật miễn dịch khuếch tán đơn thuần của Oudin (1946) (1946) Kỹ thuật này được thực hiện trong ống nghiệm Cho kháng thể vào thạch rồi đổ thạch vào một ồng nghiệm, trên bề mặt của thạch đổ kháng nguyên Kháng nguyên sẽ khuếch tán trong thạch Một đường kết tủa xuất hiện trong thạch Hình 1 Miễn dịch khuếch tán đơn thuần ( kỹ thuật Oudin) Kỹ thuật miễn dịch khuếch tán kép của Ouchterlony (1947) Đây là một kỹ thuật bán định lượng dùng để xác định bản chất miễn dịch của một kháng nguyên bởi một kháng thể hoặc để xác định những liên quan miễn dịch giữa hai kháng nguyên Trong một lớp thạch không dày người ta đục các lỗ cách đều nhau, khoảng cách phụ thuộc vào hệ số khuếch tán của từng chất phản ứng Nhỏ vào mỗi lỗ đối diện với nhau dung dịch kháng nguyên và kháng thể.Thời hạn xuất hiện các đường khung kết tủa dài , có thể tới một tuần 118 Hình 2 Miễn dịch khuếch tán kép (kỹ thuật Ouchterlony) Kết quả: 1 Phản ứng giống nhau (reaction d’identité) khi hai kháng nguyên giống nhau thì đường kết tủa với kháng thể nối liền nhau 2 Phản ứng không giống nhau (reaction de non – indentité) Nếu hai kháng nguyên khác nhau sẽ kết hợp riêng rẽ với hai kháng thể và hai đường kết tuả sẽ cắt chéo nhau 3 Phản ứng giống một phần (reaction d’identité particelle) phần tính chất kháng nguyên giống nhau sẽ cho một đường tủa chung liền với nhau, một đường tủa phụ xuất hiện như một cái cựa gắn vào đường tủa trên với kháng nguyên thứ hai Kỹ thuật này cũng được dùng để phát hiện hai kháng huyết thanh gây tủa xem chúng có nhận biết cùng một kháng nguyên hay không Kỹ thuật miễn dịch khuếch tán vòng: Kỹ thuật Mancini (1964) Kỹ thuật miễn dịch khuếch tán vòng (immunodifusion radiale) được dùng để định lượng kháng nguyên Kháng thể đặc hiệu được hoà đều vào trong thạch trước khi giải thạch vào hộp Petri Đục các lỗ và cho vào đó các các kháng nguyên có độ pha loãng khác nhau Kháng nguyên khuếch tán gặp kháng thể ngay trong thạch tạo nên những vòng tủa mà diện tích tỷ lệ thuận với đậm độ kháng nguyên Việc định lượng được suy ra từ một đường biểu diễn chuẩn lập từ những nồng độ đã biết của kháng nguyên Hình 3 Kỹ thuật miễn dịch khuếch tán vòng ( kỹ thuật Mancini) 119 a Các vòng kết tủa khi phản ứng kết thúc b Nồng độ kháng nguyên tỷ lệ thuận với diện tích của vòng kết tủa 4.2 ĐIỆN DI MIỄN DỊCH Kỹ thuật Grabar và Williams 1953 Điện di miễn dịch là một phương pháp kết hợp hai kỹ thuật: kỹ thuật điện di protein (kháng nguyên) và kỹ thuật miễn dịch khuếch tán đối với những kháng thể đặc hiệu Kỹ thuật này chủ yếu được dùng cho việc phân tích các protein trong huyết thanh người, nó đòi hỏi phải có các kháng huyết thanh của động vật đặc hiệu chống lại protein người Với kỹ thuật này có thể phát hiện được gần 30 protein khác nhau trong huyết thanh, mỗi protein dưới hình thức một cung kết tủa riêng Kỹ thuật này cũng có thể phân tích các protein trong nước tiểu (để phát hiện protein Bences Jones tức chuỗi nhẹ ) Tuy nhiên đây chỉ là phương pháp định tính Kỹ thuật được tiến hành theo 2 giai đoạn: - Giai đoạn 1: Các protein trong huyết thanh đóng vai trò kháng nguyên được điện di trên phiến thạch trong môi trường đệm pH = 8,3 – 8,6 Đặt huyết thanh vào lỗ tròn , điện di , các protein được tách trên phiến kính - Giai đoạn 2: Kháng huyết thanh được đặt vào rãnh khoét song song với chiều dài của phiến kính Phản ứng kết tủa sẽ được thực hiện trong 24 hoặc 48 giờ, xuất hiện thành các hình vòng cung màu trắng Với huyết thanh người được khoảng 25 vòng cung, mỗi vòng cung tương ứng với một protein riêng biệt 120 .Kỹ thuật điện di miễn dịch định lượng ( Kỹ thuật Laurell 1966) Kỹ thuật điện di miễn dịch định lượng là kỹ thuật kết hợp giữa kỹ thuật điện di và kỹ thuật miễn dịch khuếch tán Kháng huyết thanh (kháng thể) được trộn với thạch Các lỗ đục ở đường xuất phát, trong đó chứa các kháng nguyên cần định lượng (ví dụ albumin trong huyết thanh) và các kháng nguyên chuẩn có độ pha loãng khác nhau để chuẩn độ Khi điện di, các kháng nguyên di chuyển về cực dương, sẽ tạo thành phức hợp kháng nguyên - kháng thể khi có sự tiếp xúc giữa kháng nguyên và kháng thể Phức hợp kháng nguyên - kháng thể cũng di chuyển và sẽ dừng lại khi tất cả kháng nguyên kháng thể đã kết hợp , sau 24 hoặc 48 giờ Tủa được hình thành dưới dạng hình ngọn lửa , còn gọi là hình roket Chiều dài của hình roket này tỷ lệ với nồng độ kháng nguyên Điện di miễn dịch định lượng (kỹ thuật Laurell) 4.3 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH KẾT TỦA HAY MIỄN DỊCH ĐỘ ĐỤC (immunoprecipitation) Kỹ thuật miễn dịch hoá học này cần phương tiện phức tạp hơn so với kỹ thuật miễn dịch khuếch tán vòng Kỹ thuật này định lượng protein bằng phương pháp miễn dịch độ đục dựa trên lượng độ đục của phản ứng giữa kháng nguyên cần định lượng với kháng thể tương ứng Trong thí nghiệm nồng độ kháng thể không thay đổi, nồng độ phức hợp kháng 121 nguyên – kháng thể hoàn toàn phụ thuộc vào nồng độ protein của kháng nguyên Sau đó đo độ đục bằng phương pháp đo độ đục 4.3 MIỄN DỊCH PHÓNG XẠ RIA (radioimmunassay) Những phương pháp trên không định lượng được những lượng protein quá thấp Phương pháp miễn dịch cạnh tranh định lượng được các protein có nộng độ thấp tới picrogam Nguyên tắc chung của phương pháp này là cạnh trạnh giữa hai kháng nguyên trên cùng một kháng thể ( immunocompetition) hoặc hình thức kẹp chả (Sandwich) Miễn dịch cạnh tranh: Gọi Ag là kháng nguyên hoặc hapten cần định lượng Ag* là kháng nguyên trên nhưng được ghi dấu Ab là kháng thể Cho tác dụng Ag* với Ab có phản ứng tạo phức hợp kháng nguyên – kháng thể.: Ag* + Ab ↔ Ag*- Ab Thêm vào phức hợp Ag* - Ab mẫu cần định lượng chứa kháng nguyên không ghi dấu (Ag) Kháng nguyên này cạnh tranh đẩy kháng nguyên ghi dấu ra khỏi phức hợp Ag + Ag* - Ab ↔ Ag – Ab + Ag* Tỷ lệ giữa phức hợp ghi dấu và phức hợp không ghi dấu phụ thuộc vào nồng độ hai kháng nguyên Nếu lượng kháng nguyên ghi dấu và kháng thể cố định thì chỉ phụ thuộc vào kháng nguyên không ghi dấu tức kháng nguyên cần đo Kháng nguyên được ghi dấu bằng chất phóng xạ, thường là Iod 131 (I 131), có thời gian bán huỷ là 8 ngày, hoặc Iod 125 (I125) có thợi gian bán huỷ dài hơn, 60 ngày Kỹ thuật RIA gồm 4 giai đoạn: - Tạo thành phức hợp kháng thể với kháng nguyên ghi dấu (Ag*-Ab) - Đẩy kháng nguyên ghi dấu Ag* ra khỏi phức hợp Ag* - Ab bởi sự cạnh tranh của kháng nguyên không ghi dấu Ag - Tách kháng nguyên ghi dấu Ag* khỏi phức hợp Ag - Ab bằng những phương pháp khác nhau: - Định lượng kháng nguyên ghi dấu Ag* ở dich lọc hoặc ở trong phức hợp Ag* - Ab Đường cong chuẩn được thực hiện bằng môi trường phản ứng trong lượng kháng nguyên biết trước với sự có mặt của kháng nguyên ghi dấu và kháng thể 122 Sơ đồ minh hoạ nguyên tắc kỹ thuật RIA Hoạt độ phóng xạ ở dịch trong tỷ lệ thuận với lượng kháng nguyên không ghi dấu tức là chất cần đo Hoặc ngược lại hoạt độ phóng xạ ở phần tủa (phức hợp) tỷ lệ nghịch với lượng kháng nguyên không ghi dấu Kỹ thuật RIA có nhiều ưu điểm , độ nhạy cao, tuy nhiên giá thành đắt và chỉ có thể thực hiện được trong những phòng thí nghiệm đặc biệt Trong lĩnh vực hoá sinh thường dùng kỹ thuật RIA trong định lượng các hormon: kích tố tuyến yên, kích tố nhau thai, hormon tuyến giáp., prostaglandin, các protein huyết thanh có hàm lượng rất thấp như alpha foetoprotein, dấu ấn ung thư CEA, các loại thuốc như vitamin B12, acid folic, thuốc ngủ, 4.4 KỲ THUẬT MIỄN DỊCH ENZYM Kỹ thuật này cũng dựa trên nguyên tắc của phương pháp miễn dịch cạnh tranh như kỹ thuật miễn dịch phóng xạ, chỉ khác là chất ghi dấu là enzym Người ta hay dùng enzym phosphatase hoặc peroxidase Như vậy phản ứng gồm hai giai đoạn : giai đoạn phản ứng miễn dịch và giai đoạn phản ứng enzym Kỹ thuật này không đòi hỏi phải có các chất pháng xạ và các trang thiết bị phức tạp Kỹ thuật này có thể định lượng được kháng nguyên hoặc kháng thể Phương pháp ELISA (Enzym Linked Immuno Sorbent Assay) còn gọi là phương pháp kẹp chả - Sandwich Trong trường hợp định lượng kháng nguyên cần hai kháng thể đơn dòng, kháng nguyên có ít nhất hai vị trí gắn với kháng thể: một gắn với kháng thể cố định và một gắn với kháng thể ghi dấu bằng enzym Kháng nguyên sẽ tác dụng với một lượng thừa kháng thể cố định ở thể rắn (gắn vào thành ống nghiệm), sau khi ủ và rửa, tất cả kháng nguyên đã cố định với kháng thể lại được kết hợp với một lượng kháng thể ghi dấu enzym Sau khi rửa lại lần thứ hai, hoạt đọ của enzym ghi dấu được định lượng và như vậy cho phép định lượng trực tiếp lượng kháng nguyên Kết quả được đối chiếu với đường cong chuẩn 123 Ví dụ định lượng kích giáp trạng tố TSH bằng phương pháp ELISA, cần sử dụng hai kháng thể đơn dòng Quá trình định lượng diễn ra hai giai đoạn: - Phản ứng kết hợp kháng nguyên kháng thể - Phản ứng enzym Cơ chế của phản ứng ELISA 1 Kháng thể đơn dòng kháng TSH 2 TSH có trong ống thử , ống mẫu và ống kiểm tra 3 Liên hợp enzym với kháng thể đơn dòng kháng TSH (enzym peroxidase) 4 Cơ chất lên màu: ortho phenylendiamin (OPD) và H2O2 Trong giai đoạn 2: Enzym peroxidase xúc tác phản ứng tạo thành phức hợp màu : peroxidase H2O2 + OPD > H2O + phức hợp màu Nồng độ TSH của mỗi ống thử được xác định qua đường cong chuẩn Kỹ thuật ELISA được sử dụng để định lượng các hormon: insulin, progesteron, cortisol, estradiol, testosteron, T3, T4, IgE, 4.5 KỸ THUẬT ĐIỆN HOÁ PHÁT QUANG MIỄN DỊCH ( electro chemi luminescence immuno assay ECLIA) Kỹ thuật này được đo trên máy chuyên dụng : Elecsys Kỹ thuật cũng có thể trên cơ sở phản ứng miễn dịch cạnh tranh (định lượng fT4) hoặc hình thức kẹp chả ( sandwich) định lượng TSH Nguyên tắc : Chất cần định lượng đóng vai trò kháng nguyên, kết hợp với kháng thể ghi dấu bằng biotin và ruthenium Phức hợp kháng nguyên kháng thể được cố định trên pha cứng bởi liên kết streptavidin – biotin ở các hạt nhỏ, các hạt nhỏ này được giữ 124 lại trên bề mặt điện cực bằng từ tính gây ra sự thay đổi điện thế của được cực sẽ khởi động sự sản sinh ra quang học và được đo bằng hệ thống khuếch đại quang học Kết quả được tính toán theo đường cong chuẩn được chuyển thành dạng mã vạch 125 MỤC LỤC TT Nội dung Trang 1 Xây dựng tổ chức phòng xét nghiệm 1 2 Kính hiển vị quang học 6 3 Cân dùng trong phòng Xét nghiệm 16 4 Tủ lạnh 22 5 Tủ ấm 25 6 Tủ sấy 29 7 Nồi hấp ướt 32 8 Máy ly tâm 36 9 Máy cất nước 40 10 Nước dùng trong phòng xét nghiệm 43 11 Điện và cách sử dụng điện trong phòng xét nghiệm 50 12 Dụng cụ thuỷ tinh 55 13 Máy đo quang 63 126 14 Máy điện giải đồ 76 15 Máy điện di 78 16 Khử khuẩn trong phòng xét nghiệm 81 17 Súc vật thí nghiệm - kỹ thuật tiêm truyền súc vật 85 18 Tai nạn thường gặp trong phòng xét nghiệm và cách xử trí 91 19 Hệ thống đơn vị quốc tế SI 96 20 Phương pháp miễn dịch 106 TÀI LIỆU THAM KHẢO - Kỹ thuật cơ bản của phòng xét nghiệm - Eliênn Levy Lam bert 1978 - Kỹ thuật xét nghiệm cơ bản ở phòng khám đa khoa khu vực - Vụ khoa học và Đào tạo Bộ Y tế 1991 - Xét nghiệm cơ bản Bộ Y tế 1995 127 - Kỹ thuật xét nghiệm hoá sinh lâm sàng- Tài liệu Đào tạo Kỹ thuật Bệnh viện Bạch Mai 2001 - Một số chuyên đề về hoá sinh lâm sàng ứng dụng Kỹ thuật cao bệnh viện Bạch Mai 2002 128 ... THIẾT : - Kính hiển vi - Cần phân tích - Cân điện - Tủ lạnh - Ổn áp riêng cho máy đo quang - Máy ly tâm - Nồi cách thuỷ - Máy đo quang - Tủ ấm - Nồi hấp - Máy cất nước - Tủ sấy - Tủ cấy - Máy điện... kế xây dựng phòng xét nghiệm Nêu công tác tổ chức, xếp phịng xét nghịêm Kể tên máy móc cần thiết trang bị cho phòng xét nghiệm Liệt kê dụng cụ lấy bệnh phẩm Trình bày nguyên tắc quản lý khoa xét. .. bào QUẢN LÝ PHÒNG XÉT NGHIỆM: 4.1 QUẢN LÝ TRANG THIẾT BỊ DỤNG CỤ HOÁ CHẤT: - Mỗi trang thiết bị máy móc phịng xét nghiệm phải có: + Lý lịch máy + Nội qui sử dụng máy + Người sử dụng bảo quản -