MỤC LỤC Trang Mở đầu Chƣơng Tổng quan 1.1 Vấn đề ô nhiễm asen nước ngầm nhu cầu phát triển cơng cụ phân tích nhanh 1.1.1 Nguyên tố asen tự nhiên đời sống 1.1.2 Vấn đề ô nhiễm asen nước giếng khoan giới Việt Nam 1.1.3 Nhu cầu phát triển cơng cụ phân tích nhanh, phục vụ cho 10 nhiệm vụ đánh giá trạng ô nhiễm asen nước giếng khoan 1.2 Biosensor sử dụng vi khuẩn chuyển gen để phân tích asen 14 nước 1.2.1 Biosensor sử dụng tế bào vi khuẩn 14 1.2.2 Biosensor vi khuẩn đáp ứng đặc hiệu với asen có gắn 16 gen thị khác 1.2.2.1 Gen kháng asen vi khuẩn E coli (arsenic resistance 16 gene) 1.2.2.2 Các gen thị thường sử dụng biosensor vi 17 khuẩn 1.2.2.3 Ứng dụng thực tiễn biosensor sử dụng vi khuẩn 20 biến đổi gen có đáp ứng với asen 1.3 Sử dụng biomarker nghiên cứu thâm nhiễm asen 23 người 1.3.1 Tác hại tới sức khoẻ gây nhiễm độc asen 23 1.3.2 Sử dụng biomarker nghiên cứu thâm nhiễm asen 24 người 1.3.2.1 Vai trò biomarker đánh giá nguy 24 nhiễm độc 1.3.2.2 Sử dụng số hàm lượng asen tóc để đánh giá 27 mức độ thâm nhiễm lâu dài asen từ nước giếng khoan 1.3.2.3 Sử dụng số thành phần asen methyl hoá 28 nước tiểu để đánh giá mức độ thâm nhiễm asen cung cấp số liệu minh hoạ chế nhiễm độc asen người Chƣơng Nguyên liệu phƣơng pháp nghiên cứu 34 2.1 Nguyên liệu 34 2.1.1 Mẫu nước giếng khoan, mẫu tóc mẫu nước tiểu 34 2.1.2 Mẫu biosensor sử dụng chủng vi khuẩn thị 36 2.1.3 Thiết bị, hoá chất chất chuẩn 37 2.2 Phương pháp 38 2.2.1 Nuôi, cấy chuyển giữ giống vi khuẩn thị asen 38 2.2.2 Phân tích hàm lượng asen hồ tan dung dich trung tính 38 vi khuẩn thị 2.2.3 Thí nghiệm chọn thời gian vi khuẩn thị E coli luxAB tiếp xúc với asen tối ưu hố lượng chất n-decanal 40 2.2.4 Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng hàm lượng sắt nước tới khả sử dụng sinh học asen vi khuẩn thị 40 2.2.5 Phương pháp phân tích asen dung dịch quang phổ hấp thụ nguyên tử nối ghép thiết bị sinh khí hydrua asin 41 (AsH3) 2.2.6 Phương pháp xử lý mẫu tóc 41 2.2.7 Phân tích dạng asen hữu nước tiểu kỹ thuật 42 nối ghép sắc ký trao đổi ion với phổ khối cảm ứng plasma (ICICPMS) Chƣơng Kết bàn luận 3.1 Chọn lựa tối ưu phương pháp phân tích hàm lượng asen 43 nước giếng khoan biosensor sử dụng vi khuẩn thị 3.1.1 So sánh khả phân tích asen ba chủng vi khuẩn E 43 coli có gen thị khác lacZ, gfp luxAB 3.1.2 Tối ưu hố xây dựng qui trình phân tích asen nước 50 giếng khoan chủng vi khuẩn E coli luxAB 3.1.3 Ứng dụng biosensor vi khuẩn để đánh giá ô nhiễm asen 59 nước giếng khoan Việt Nam 3.2 Mối tương quan ô nhiễm asen nước giếng khoan với mức 65 độ thâm nhiễm asen người 3.2.1 Mức độ tích luỹ asen mẫu tóc 65 3.2.2 Mối tương quan ô nhiễm asen nước giếng khoan, 73 nước lọc với hàm lượng asen tóc 3.2.3 Mối tương quan ô nhiễm asen nước giếng khoan, 76 nước lọc với hàm lượng dạng asen methyl hoá nước tiểu Kết luận 84 Kiến nghị nghiên cứu 85 Tài liệu tham khảo 86 Danh mục cơng trình khoa học tác giả liên quan tới luận án 97 Danh mục bảng Bảng 1.1 Ví dụ trạng ô nhiễm asen nước ngầm số quốc gia giới Bảng 2.1 Địa điểm số lượng mẫu thu thập cho nghiên cứu ứng dụng biomarker Bảng 3.1 So sánh kết phân tích asen 410 mẫu nước giếng khoan Bảng 3.2 Số liệu thực địa nghiên cứu mức độ thâm nhiễm asen tóc Bảng 3.3 Hàm lượng asen trung bình tóc, nước giếng nước sinh hoạt (đã lọc dùng trực tiếp) Bảng 3.4 So sánh mức độ ô nhiễm asen nghiên cứu với số địa điểm giới Bảng 3.5 Hàm lượng asen nước tiểu, nước giếng nước sinh hoạt (đã lọc dùng trực tiếp) Danh mục hình vẽ, đồ thị Hình 1.1 Mối quan hệ biomarker bioindicator Hình 1.2 Sơ đồ chuyển hố chất độc thể Hình 1.3 Sơ đồ giả thuyết chuyển hố asen thể người Hình 2.1 Bản đồ vị trí lấy mẫu sinh học Hình 3.1 Kết thí nghiệm đánh giá hàm lượng asen nước vi khuẩn thị E coli lacZ Hình 3.2 Ảnh chụp kính hiển vi huỳnh quang kết thí nghiệm đánh giá hàm lượng asen nước vi khuẩn thị E coli gfp Hình 3.3 Tương quan cường độ ánh sáng phát nồng độ asen dung dịch thử nghiệm với vi khuẩn thị E coli luxAB Hình 3.4 Ảnh hưởng thời gian tiếp xúc với asen lên cường độ ánh sáng phát phản ứng xúc tác luciferase vi khuẩn thị E coli luxAB Hình 3.5 Ảnh hưởng lượng chất n-decanal lên cường độ ánh sáng phát Hình 3.6 Ảnh hưởng lượng sắt dung dịch lên khả sử dụng sinh học asen vi khuẩn thị E coli luxAB Hình 3.7 So sánh tác dụng hoá chất tới khả sử dụng sinh học asen vi khuẩn thị E coli luxAB Hình 3.8 Ảnh hưởng lượng EDTA lên cường độ ánh sáng phát phản ứng xúc tác luciferase vi khuẩn thị E coli luxAB Hình 3.9 Cường độ ánh sáng phát phản ứng xúc tác enzym luciferase vi khuẩn thị E coli luxAB dùng dung dịch NaOH Natri Pyrophotphat 200mM Hình 3.10 Quy trình phân tích hàm lượng asen nước giếng khoan vi khuẩn thị E coli luxAB Hình 3.11 Khoảng đáp ứng động học vi khuẩn thị E coli luxAB asen Hình 3.12 Đường chuẩn biểu diễn tương quan đáp ứng vi khuẩn thị với nồng độ asen pha nước giếng khoan Hình 3.13 Tương quan số liệu nồng độ asen nước giếng khoan thu từ vi khuẩn thị quang phổ hấp thụ nguyên tử Hình 3.14 Bản đồ ô nhiễm asen số khu vực thuộc đồng sơng Hồng Hình 3.15 Hàm lượng As mẫu tóc thu đồng sơng Hồng Hình 3.16 Hàm lượng As mẫu tóc thu đồng sơng Mê Kơng Hình 3.17 Phân bố hàm lượng asen theo nhóm tuổi Hình 3.18 Phân bố phần trăm số mẫu tóc với hàm lượng asen trung bình nam, nữ trẻ em Hình 3.19 Tương quan hàm lượng asen trung bình tóc nước Hình 3.20 Sắc ký đồ thu phân tích dạng asen nước tiểu Hình 3.21 Tương quan hàm lượng asen methyl hoá nước tiểu hàm lượng asen nước Hình 3.22 Tương quan hàm lượng asen methyl hoá với asen tổng số nước tiểu thể không phơi nhiễm asen Hình 3.23 Tương quan hàm lượng asen methyl hố với asen tổng số nước tiểu thể phơi nhiễm với asen mức độ khác Hình 3.24 Tương quan mức độ ô nhiễm asen nước sinh hoạt, asen tóc asen methyl hố nước tiểu MỞ ĐẦU Đảm bảo chất lượng nước ăn nước sinh hoạt cho cộng đồng dân cư khu vực nông thôn vấn đề trọng tâm chương trình chăm sóc sức khoẻ ban đầu Việt Nam Đồng sông Hồng đồng sông Mê kông hai khu vực tập trung đông dân nước ta với dân số tương ứng 17,7 triệu 16,9 triệu, chiếm gần 42,7% tổng số khoảng 80,9 triệu dân nước (theo số liệu điều tra dân số năm 2003 Tổng cục Thống kê) Ngoại trừ thành phố, thị trấn có hệ thống cấp nước tập trung từ nhà máy nước, lại hầu hết dân cư sống xa đô thị phải tự khai thác sử dụng nguồn nước khác nước mặt (nước sông, hồ), nước ngầm (nước giếng khơi, giếng khoan), nước mưa Để tránh số bệnh tiêu chảy, đau mắt, giun sán, v.v…do sử dụng nước sông, nước hồ gây ra, ngày hầu hết hộ dân hai khu vực tự khoan giếng để lấy nước ngầm sử dụng cho sinh hoạt hàng ngày ăn uống, tắm giặt [5] Nhưng người dân lại có nguy đối mặt với nhiễm mang tính tự nhiên, có mặt nguyên tố asen (thạch tín) nước ngầm [78] Asen thâm nhập hàng ngày vào thể kể hàm lượng thấp gây tác hại cho sức khoẻ như: gây hoại tử vết loét tay, chân, làm rối loạn sắc tố da, sừng hoá gan bàn tay, gan bàn chân, chí liên quan tới bệnh tiểu đường, tim mạch, ung thư bàng quang, ung thư gan, v.v…[97] Do tác hại lâu dài asen lên sức khoẻ người, ngày Tổ chức Y tế giới đề nghị mức giới hạn asen nước uống 10g/l, Bộ Y tế Việt Nam ban hành tiêu chuẩn asen nước uống 10g/l thay cho tiêu chuẩn Việt Nam năm 1995 50g/l [1, 2] 10 Từ năm cuối kỷ 20, thảm hoạ nhiễm độc asen dùng nước giếng khoan phát nước nam Á Ấn Độ (vùng Tây Bengan), Bănglađet Trung Quốc (vùng cao nguyên Nội Mông) [22, 78, 98] Ở Việt Nam có số nghiên cứu tình trạng nhiễm asen nước ngầm, nước cấp khu vực Hà Nội số tỉnh lân cận [6, 13] Mức độ ô nhiễm asen số tỉnh Hà Nam, Hà Tây, phía nam Hà Nội coi nghiêm trọng ngang với quốc gia bị ô nhiễm nặng Đó kết ban đầu dựa việc phân tích hàm lượng asen khoảng 14 nghìn tổng số 620 nghìn giếng, chiếm tỷ lệ 2,2% Như vậy, số giếng điều tra so với số giếng cịn lại cần biết có nhiễm asen hay khơng Đây tốn cần giải sớm khơng Việt Nam mà nước khác chịu ô nhiễm asen [22] Các thiết bị có khả phân tích xác hàm lượng asen lại tập trung hầu hết phịng thí nghiệm đại, viện nghiên cứu, trường đại học Các phương pháp phân tích asen trường theo ngun tắc hố học sử dụng phổ biến độ tin cậy lại chưa cao Chính vậy, việc nghiên cứu, chế tạo cơng cụ phân tích asen nhanh, hiệu quả, xác theo nguyên tắc sinh học hướng nhà khoa học giới Để phát triển phép đo asen nhanh, số biosensor dựa vi khuẩn thị asen thiết kế phịng thí nghiệm nhờ việc lắp ghép gen cảm ứng đặc hiệu asen với gen thị tạo tín hiệu đo [15, 74, 82, 85] Tuy nhiên độ tin cậy, khả ứng dụng thực tiễn để phân tích asen nước giếng khoan chưa thử nghiệm, khả sử dụng sinh học asen (bioavailability) vi khuẩn thị bị giảm thành phần hoá học khác nước Để đánh giá mức độ thâm nhiễm asen người, biomarker hàm lượng asen tóc, hàm lượng dạng asen hữu tiết nước tiểu sử dụng phổ biến Vấn đề ô nhiễm asen nước ngầm 11 phát Việt Nam số lượng cơng trình công bố thâm nhiễm asen quần thể có phơi nhiễm asen dùng nước giếng khoan cịn hạn chế Để góp phần vào việc triển khai ứng dụng cơng cụ phân tích asen biosensor sử dụng vi khuẩn thị asen biến đổi gen, đánh giá mức độ thâm nhiễm asen người đề xuất giải pháp giảm thiểu nhiễm độc asen, luận án thực với chủ đề: “NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CÁC CHỈ THỊ HÓA SINH ĐỂ ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ Ô NHIỄM ASEN TRONG NƢỚC GIẾNG KHOAN VÀ MỐI TƢƠNG QUAN VỚI THÂM NHIỄM ASEN TRÊN NGƢỜI”, gồm hai mục tiêu sau: Chọn lựa tối ƣu phƣơng pháp phân tích hàm lƣợng asen nƣớc giếng khoan biosensor sử dụng vi khuẩn thị Đánh giá mối tƣơng quan ô nhiễm asen nƣớc giếng khoan với mức độ thâm nhiễm asen ngƣời Kết thu luận án góp phần vào việc ứng dụng thành công nghệ sinh học vào nhiệm vụ bảo vệ môi trường thông qua việc nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích asen nước vi khuẩn thị biến đổi gen Luận án đưa chứng ô nhiễm asen nước sinh hoạt lấy từ giếng khoan, mức độ thâm nhiễm asen người sử dụng nguồn nước Với kết đó, luận án đóng góp phần nhỏ bé vào việc thực nhiệm vụ chương trình Quốc gia Asen nước ngầm 12 Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Vấn đề ô nhiễm asen nƣớc ngầm nhu cầu phát triển cơng cụ phân tích nhanh 1.1.1 Nguyên tố asen tự nhiên đời sống Asen ngun tố hố học thuộc nhóm V bảng tuần hồn Mendeleep, nhóm với ngun tố N, P, Sb Bi Asen tồn hợp chất vô hữu với bốn mức hoá trị -3, 0, +3 +5 Nguyên tố asen không tan nước, muối asen có độ tan khác phụ thuộc vào pH, lực ion ơxy hố khử mơi trường Ví dụ mơi trường trường mang tính khử pH thấp As(III) chiếm ưu thế, ngược lại môi trường mang tính ơxy hố pH cao As(V) dạng bền [78, 97] Asen có mặt 200 loại khoáng khác với nồng độ trung bình khoảng 2mg/kg Phổ biến asenopyrit orpiment As2S3, realgar AsS, mispikel FeAsS, loellingite FeAs2, nicolite NiAs, cobalite CoAsS, tennantite Cu12As4S13, v.v… Từ quặng này, trình phun trào núi lửa chuyển asen từ đất vào khơng khí Việc khai thác mỏ rửa trơi muối asen quặng gây ô nhiễm asen nước mặt khu vực xung quanh mỏ Trong tầng nước ngầm, q trình hồ tan asen xảy theo chế khử, tạm thời giải thích sau: phản ứng sinh học, hoá học diễn lịng đất tiêu hao ơxy tạo nên mơi trường mang tính khử Sắt (III) - dạng kết tủa quặng chuyển thành sắt (II) - dạng dễ tan nước Quá trình đồng thời làm cho asen rời khỏi quặng sắt tan nước ngầm Một số khu vực đồng thấp trũng, thường xảy lụt lội nơi nước ngầm thiếu ơxy khử thấp (Eh < 100mV), ví dụ Bănglađet, đồng sông Gange, Ấn Độ, đồng sơng Hồng, Việt Nam Và đây, ô nhiễm asen nước ngầm phát thập kỷ vừa qua [13, 60, 78] Trong công nghiệp, asen tạo nhờ q trình khử ơxyt asen (As2O3) với than, ôxyt asen sản phẩm phụ q trình luyện kim thường có bụi 13 ... Ứng dụng biosensor vi khuẩn để đánh giá ô nhiễm asen 59 nước giếng khoan Việt Nam 3.2 Mối tương quan ô nhiễm asen nước giếng khoan với mức 65 độ thâm nhiễm asen người 3.2.1 Mức độ tích luỹ asen. .. gen, đánh giá mức độ thâm nhiễm asen người đề xuất giải pháp giảm thiểu nhiễm độc asen, luận án thực với chủ đề: “NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CÁC CHỈ THỊ HĨA SINH ĐỂ ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ Ơ NHIỄM ASEN TRONG NƢỚC.. .nhiễm độc 1.3.2.2 Sử dụng số hàm lượng asen tóc để đánh giá 27 mức độ thâm nhiễm lâu dài asen từ nước giếng khoan 1.3.2.3 Sử dụng số thành phần asen methyl hoá 28 nước tiểu để đánh giá mức độ