ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN VĂN TÍNH TỔNG HỢP CƠ CHẤT, CHẾ TẠO KÍT VÀ NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN TỐI ƢU ĐỂ NHUỘM TẾ BÀO PHỤC VỤ CHẨN ĐOÁN BỆNH UNG THƢ BẠCH CẦU NGƢỜI Chuyên nHóa hữu Mã số: LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC ỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC Hƣớng dẫn 1: PGS.TSKH Lƣu Văn Bôi Hà Nội,2012 HÀ NỘI - 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN VĂN TÍNH TỔNG HỢP CƠ CHẤT, CHẾ TẠO KÍT VÀ NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN TỐI ƢU ĐỂ NHUỘM TẾ BÀO PHỤC VỤ CHẨN ĐOÁN BỆNH UNG THƢ BẠCH CẦU NGƢỜI Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số: 62 44 27 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TSKH Lƣu Văn Bôi GS.TS Nguyễn Anh Trí HÀ NỘI - 2012 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC BẢNG iii DANH MỤC CÁC HÌNH iv CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN v MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng hợp 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit 1.1.1 Phƣơng pháp giai đoạn 1.1.2 Tổng hợp 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit phƣơng pháp hai giai đoạn 1.2 Tính chất 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit 1.2.1 Tính chất vật lý 1.2.2 Tính chất phổ 1.2.3 Tính chất hóa học 1.3 Ứng dụng 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit 10 1.3.1 Ứng dụng để sản xuất phẩm màu 10 1.3.2 Sản xuất chất để nhuộm tế bào bạch cầu 13 CHƢƠNG THỰC NGHIỆM 25 2.1 Phƣơng pháp nghiên cứu 25 2.2 Hóa chất thiết bị 25 2.2.1 Hóa chất 25 2.2.2 Các dụng cụ thiết bị 27 2.3 Phần thực nghiệm 28 2.3.1 Điều chế dẫn xuất 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit 28 2.3.2 Điều chế dẫn xuất este 3-(N-thế)naphtalen-2-yl cacboxylat 34 2.3.3 Tối ƣu hóa phản ứng nhuộm esteraza phƣơng pháp đơn hình 37 iii 2.3.4 Nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu ngƣời chất este tổng hợp theo kỹ thuật tối ƣu hóa 41 2.3.5 Nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu ngƣời naphtol AS-OL -clopropionat naphtol AS-OL 42 2.3.6 Pha chế kít nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu ngƣời chất naphtol AS-OL -clopropionat tổng hợp đƣợc 42 2.3.7 Đánh giá thời gian ổn định kít 43 2.3.8 Ứng dụng kít để chẩn đốn dịng tế bào bệnh bạch cầu cấp 43 2.3.9 Nghiên cứu mối quan hệ cấu trúc hoạt tính 44 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 47 3.1 Tổng hợp 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit 48 3.1.1 Tổng hợp naphtol AS-X phƣơng pháp truyền thống 48 3.1.2 Tổng hợp naphtol AS-X phƣơng pháp lị vi sóng 51 3.1.3 Tổng hợp 3-hiđroxi-[N-(xiclohexyl/phenyl/naphtyl/antraxyl)]naphtalen -2-cacboxamit 63 3.2 Tổng hợp 3-(N-thế-cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat 73 3.3 Nghiên cứu nhuộm tế bào bạch cầu chất tổng hợp đƣợc 95 3.3.1 Nghiên cứu tối ƣu hoá phản ứng nhuộm esteraza tế bào bạch cầu 96 3.3.2 Nghiên cứu yếu tố ảnh hƣởng chất đến kết nhuộm 101 3.4 Nghiên cứu mối tƣơng quan hoạt tính cấu trúc chất phƣơng pháp tính hóa lƣợng tử 110 3.5 Nghiên cứu chế tạo kít chất naphtol AS-OL α-clopropionat 115 3.5.1 Thành phần kít cho 100 tiêu nhuộm 115 3.5.2 Tài liệu hƣớng dẫn sử dụng kít naphtol AS-OL α-clopropionat 116 3.5.3 Đánh giá chất lƣợng kít 117 3.5.4 Nghiên cứu thời gian bảo quản sử dụng kít 118 3.5.5 Ứng dụng kít để chẩn đốn dòng tế bào bệnh bạch cấp 120 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 123 Danh mục cơng trình khoa học tác giả liên quan đến luận án 125 Tài liệu tham khảo 126 Phụ lục phổ, ảnh tài liệu khác 136 iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Bảng 1.2 Các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit đƣợc thƣơng mại hóa Một số phẩm màu từ naphtol AS 10 Bảng 1.3 Bảng 1.4 Mối tƣơng quan độ tan cấu trúc phẩm màu Các lĩnh vực ứng dụng phẩm màu naphtol AS 12 13 Bảng 1.5 Bảng phân loại theo tiêu chuẩn FAB nhuộm hóa học tế bào 19 Bảng 2.1 Bảng 2.2 Giá trị ri Ri Ma trận mã hóa đơn hình S0 38 38 Bảng 2.3 Ma trận mã hóa thay số đơn hình S0 38 Bảng 2.4 Lựa chọn mức gốc thực nghiệm 39 Bảng 2.5 Bảng 3.1 Ma trận thực nghiệm đơn hình S0 Mối tƣơng quan điều kiện phản ứng hiệu suất Ia tổng hợp theo phƣơng pháp truyền thống 39 Bảng 3.2 Bảng 3.3 Bảng 3.4 Mối tƣơng quan điều kiện tiến hành phản ứng hiệu suất tổng hợp Ia phƣơng pháp lò vi sóng Mối quan hệ nhiệt độ phản ứng với hiệu suất Ia tổng hợp theo phƣơng pháp lò vi sóng Kết tổng hợp, số số hóa lý, phổ IR ESI-MS naphtol AS-X Bảng 3.5 Dữ liệu phổ H-NMR naphtol AS-X Bảng 3.6 Ảnh hƣởng hiệu ứng điện tử nhóm lên độ chuyển dịch hóa học proton OH NH Kết tổng hợp, số số hóa lý, phổ IR ESI-MS 3-hiđroxi-N-( xiclohexyl/phenyl/1-naphtyl/1-antraxyl) naphtalen2-cacboxamit Phổ 1H-NMR 3-hiđroxi-N-(xiclohexyl/phenyl/1-naphtyl/ 1-antraxyl)naphtalen-2-cacboxamit Kết tổng hợp, số số hóa lý, số liệu phổ IR ESIMS naphtol AS-X cloaxetat Bảng 3.7 Bảng 3.8 Bảng 3.9 Bảng 3.10 Dữ liệu phổ 1H-NMR naphtol AS-X cloaxetat Bảng 3.11 Kết tổng hợp, số số hóa lý, số liệu phổ IR ESIMS naphtol AS-X -clopropionat Bảng 3.12 Số liệu phổ 1H-NMR các naphtol AS-X -clopropionat v 50 53 53 57 59 61 70 71 79 81 83 85 Bảng 3.13 Kết tổng hợp, số số hóa lý, liệu phổ IR ESI-MS 3-(xiclohexyl/phenyl/naphtyl/antraxylcacbamoyl) naphtalen-2-yl cacboxylat Bảng 3.14 Số liệu phổ 1H-NMR 3-(xiclohexyl/phenyl/naphtyl/antraxyl cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat 87 89 Bảng 3.15 Kết tổng hợp, số số hóa lý, kiện phổ IR, ESI-MS naphtol AS-D naphtol AS-OL cacboxylat Bảng 3.16 Phổ 1H-NMR naphtol AS-D naphtol AS-OL 92 cacboxylat Bảng 3.17 Lựa chọn mức gốc thực nghiệm 93 97 Bảng 3.18 Kết nhuộm theo phƣơng pháp quy hoạch hóa thực nghiệm đơn hình 97 Bảng 3.19 Kết thí nghiệm lặp lại đỉnh tối ƣu Bảng 3.20 Tính đặc hiệu 26 chất naphtol AS-X cloaxetat α-clopropionat phản ứng nhuộm esteraza loại bạch cầu máu ngoại vi Bảng 3.21 Điểm nhuộm este naphtol AS-X cloaxetat Bảng 3.22 Điểm nhuộm este naphtol AS-X α-clopropionat Bảng 3.23 Tính đặc hiệu chất Va-h phản ứng nhuộm esteraza loại bạch cầu máu ngoại vi Bảng 3.24 Kết nhuộm tế bào bạch cầu chất este dãy Va-h 99 102 102 103 105 105 Bảng 3.25 Tính đặc hiệu chất có gốc cacboxylat khác phản ứng nhuộm esteraza loại bạch cầu máu ngoại vi Kết nhuộm naphtol AS-D AS-OL cacboxylat có gốc hiđrocacbon khác Kết góc nhị diện thu đƣợc từ tính tốn lƣợng tử điểm nhuộm thực nghiệm Điểm nhuộm thực tế điểm tính theo phƣơng trình hồi quy Kết theo dõi tính ổn định kít Độ đặc hiệu chất naphtol AS-OL α-clopropionat kít 108 hãng Sigma phản ứng nhuộm esteraza loại bạch cầu tủy Bảng 3.31 Kết nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu ngƣời kít naphtol AS-OL α-clopropionat tổng hợp đƣợc kít naphtol AS-D cloaxetat hãng Sigma 120 Bảng 3.26 Bảng 3.27 Bảng 3.28 Bảng 3.29 Bảng 3.30 vi 108 112 114 118 121 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Tâm hoạt động esteraza 14 Hình 1.2 Phân tử esteraza 16 Hình 2.1 Màn hình cài đặt chƣơng trình tính tốn 44 Hình 2.2 Màn hình cài đặt phƣơng pháp tính tốn 45 Hình 2.3 Cửa sổ cài đặt dung môi câu lệnh thêm vào 45 Hình 3.1 Phổ IR 3-hiđroxi-N-(2-metylphenyl)-, N-(4-metylphenyl)-, N-(2-bromphenyl)- N-(4-bromphenyl)naphtalen-2-cacboxamit 54 Hình 3.2 Hai cấu dạng phân tử naphtol AS-X 55 Hình 3.3 Phổ IR chất Ik Il 56 Hình 3.4 Phổ MS chất Il 63 Hình 3.5 Sự phân mảnh hợp chất Il 63 Hình 3.6 Phổ IR hợp chất IIc 68 Hình 3.7 Phổ MS hợp chất IId 69 Hình 3.8 Sắc kí mỏng naphtol AS-D sản phẩm phản ứng 75 Hình 3.9 Biểu diễn điểm đơn hình (S) trình tối ƣu hố 98 Hình 3.10 Ảnh nhuộm enzym esteraza bạch cầu điều kiện tối ƣu hoá với chất naphtol AS-D cloaxetat (Sigma-Aldrich) 99 Hình 3.11 Ảnh nhuộm esteraza bạch cầu chất IIIa IIIi 104 Hình 3.12 Ảnh nhuộm esteraza bạch cầu naphtol chất Vc Vg 106 Hình 3.13 Kết nhuộm esteraza bạch cầu ngƣời chất naphtol AS-D naphtol AS-OL cloaxetat α-clopropionat 109 Hình 3.14 Góc nhị diện nhóm cacboxylat 111 Hình 3.15 Biểu đồ biểu thị độ ổn định kít theo thời gian 119 Hình 3.16 Kết nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu ngƣời chất naphtol AS-OL α-clopropionat tổng hợp đƣợc naphtol AS-D cloaxetat hãng Sigma 122 vii CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN Asp: Asparagine C.I Danh mục chất màu (Color Index) c.s Cộng kDa Kilo dalton DFT: Thuyết phiến hàm mật độ điện tử (Density Functional Theory) DIPEA N,N-Diisopropylethylamine DMF Đimetyl Focmamit DMSO Đimetyl Sunfoxit EC: Uỷ ban Enzym (The enzyme commission ) ELISA: Kỹ thuật miiễn dịch gắn enzym (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay ) EST Nhuộm Esteraza không đặc hiệu (Esterase) EST: Esteraza (Essterase) EST+NaF Nhuộm Esteraza không đặc hiệu với chất ức chế NaF FAB: Hội nhà Huyết học Anh-Pháp-Mỹ (French-American-British) FPIA: Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang Assay) Glu: Gly Glutamine Glycin His: Histidine IUB: Hiệp hội Hóa sinh quốc tế (International Union of Biochemistry) L1 Bệnh bạch cầu cấp dịng lympho biệt hóa (Acute lymphoblastic) L2 Bệnh bạch cầu cấp dịng lympho chƣa biệt hóa (Acute lymphoblastic) L3 Bệnh bạch cầu lymphoblastic) M0 Bệnh bạch cầu cấp dịng tuỷ biệt hóa tối thiểu (Minimally differentiated acute myeloid) M1 Bệnh bạch cầu cấp dịng tuỷ khơng có tế bào trƣởng thành (Acute myeloblastic without maturation) cấp dòng (Fluorescen Polary Immuno lympho loại Burkitt (Acute M2 Bệnh bạch cầu cấp dịng tuỷ có tế bào trƣởng thành (Acute myeloblastic with maturation) M3 Bệnh bạch cầu cấp dòng tiền tuỷ (Acute promyelocytic) M4 Bệnh bạch cầu cấp dòng tuỷ-monoxit (Acute myelomonocytic) M5 Bệnh bạch cầu cấp dòng monoxit (Acute monocytic) M6 Bệnh bạch cầu cấp dòng hồng cầu (Erythroleukemia) M7 Bệnh bạch cầu cấp dòng tiểu cầu (Acute megakaryoblastic) mM miliMol mRNA ARN thông tin (messenger RiboNucleic Acid) NaF Natri Florua NAS Naphtol AS (Naphthol AS) NASD Naphtol AS-D (Naphthol AS-D) NASDCl Nhuộm esteraza đặc hiệu (Naphthol AS-D chloroacetate) NEAT New Eindhoven Architectural synthesis Toolbox NMP N-Metyl Pyroliđinon P.A Nhuộm photphataza axit PAS Nhuộm glucozit thuốc thử Periodic Axit Schiff PER Nhuộm peroxydaza QSAR: Mối tƣơng quan định lƣợng hoạt tính cấu trúc (Quantitaive Structure-Activity Relationship) SD Nhuộm hạt mỡ Sudan B Ser: Serine SUDAN Tên riêng phẩm màu THF TetraHydroFuran Tnc Nhiệt độ nóng chảy Ts Nhiệt độ sơi WHO: Tổ chức Y tế giới (World Health Organization) MỞ ĐẦU Bệnh bạch cầu cấp nhóm bệnh quan tạo máu chiếm tỷ lệ khoảng 38,5% bệnh máu [1] Cũng nhƣ bệnh ung thƣ khác, bệnh có xu hƣớng ngày tăng mơi trƣờng nhiễm, sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật khơng có kiểm sốt hậu chất da cam dioxin chiến tranh để lại [2] Đặc trƣng bệnh tăng sinh mức tế bào non ác tính lấn át tế bào tủy máu ngoại vi bình thƣờng Đặc điểm tế bào có rối loạn protein cấu trúc tế bào Bệnh gồm nhiều thể loại khác nhau, theo tiêu chuẩn FAB đƣợc ký hiệu từ M0 đến M7 L1 đến L3 [16] Việc xếp loại đúng, nhanh chóng xác thể bệnh có vai trị định giúp cho bác sỹ lâm sàng áp dụng phác đồ điều trị có hiệu cho ngƣời bệnh Đặc biệt thể M3 có nguy chảy máu cao việc chẩn đốn nhanh chóng, xác cịn có ý nghĩa định đến sinh mạng bệnh nhân [6] Tiêu chuẩn FAB dựa kết xét nghiệm ba phƣơng pháp miễn dịch, di truyền nhuộm hóa học tế bào Phƣơng pháp miễn dịch di truyền sử dụng kỹ thuật địi hỏi máy móc đại đắt tiền nguồn lao động có trình độ cao Phƣơng pháp nhuộm hóa học tế bào đồng gồm kỹ thuật nhuộm PAS, peroxidaza, nhuộm sudan B, photphataza axit, photphataza kiềm, esteraza đặc hiệu không đặc hiệu ức chế với NaF không ức chế Esteraza đặc hiệu có mặt tế bào dịng tủy cịn dịng khác âm tính dƣơng tính với cƣờng độ thấp Esteraza khơng đặc hiệu có mặt nhiều dòng tế bào khác nhƣng dịng monoxit bị ức chế NaF Ngồi hai kỹ thuật nhuộm PAS nhuộm Sudan dùng để phát glucozit lipit sáu kỹ thuật cịn lại nhuộm phát enzym Do độ đặc hiệu thấp, việc phân loại dòng tế bào theo tiêu chuẩn FAB dựa phƣơng pháp nhuộm hóa học cần phải có điều chỉnh tới 29,7% nhờ vào kỹ thuật miễn dịch di truyền Phƣơng pháp xác định tế bào thuộc dòng tủy dựa chủ yếu vào kết nhuộm peroxidaza esteraza đặc hiệu Kỹ thuật nhuộm peroxidaza thƣờng không ổn định dễ bị phân hủy ánh sáng cần bổ sung thêm kỹ thuật nhuộm esteraza có độ ổn định Hiện nay, chất nhuộm esteraza đặc hiệu naphtol AS-D cloaxetat đƣợc đƣợc hãng Sigma bán thị trƣờng với giá thành cao (13 triệu/1 gam) Qua nghiên cứu tài liệu thấy, chất naphtol AS-D cloaxetat đƣợc tổng hợp theo phƣơng pháp truyền thống ngƣng tụ axit 3-hiđroxi-2-naphtoic với o-toluiđin, sau este hóa cloaxetyl clorua Phản ứng ngƣng tụ cần thời gian dài, hiệu suất thấp; q trình chuyển hóa naphtol AS-D thành dẫn xuất cloaxetat hiệu suất không ổn định 10 Phổ 1H-NMR 3-(naphtalen-1-ylcacbamoyl)naphtalen-2-yl cloaxetat (Vc) Phổ 1H-NMR 3-(naphtalen-1-ylcacbamoyl)naphtalen-2-yl cloaxetat (Vc) P104 Phổ 1H-NMR 3-(antraxen-1-ylcacbamoyl)naphtalen-2-yl cloaxetat (Vd) Phổ 1H-NMR 3-(antraxen-1-ylcacbamoyl)naphtalen-2-yl cloaxetat (Vd) P105 Phổ 1H-NMR 3-(xyclohexylcacbamoyl)naphtalen-2-yl-2-clopropionat (Ve) Phổ 1H-NMR 3-(xyclohexylcacbamoyl)naphtalen-2-yl-2-clopropionat (Ve) P106 Phổ 1H-NMR 3-(xyclohexylcacbamoyl)naphtalen-2-yl-2-clopropionat (Ve) P107 Phổ 1H-NMR 3-(phenylcacbamoyl)naphtalen-2-yl-2-clopropionat (Vf) Phổ 1H-NMR 3-(phenylcacbamoyl)naphtalen-2-yl-2-clopropionat (Vf) P108 Phổ 1H-NMR 3-(naphtalen-1-ylcacbamoyl)naphtalen-2-yl-2-clopropionat (Vg) Phổ 1H-NMR 3-(naphtalen-1-ylcacbamoyl)naphtalen-2-yl-2-clopropionat (Vg) P109 Phổ 1H-NMR 3-(antraxen-1-ylcacbamoyl)naphtalen-2-yl-2-clopropionat (Vh) Phổ 1H-NMR 3-(antraxen-1-ylcacbamoyl)naphtalen-2-yl-2-clopropionat (Vh) P110 PHỔ 1H-NMR CỦA DÃY VI: Naphtol AS-OL AS-D cacboxylat Phổ 1H-NMR 3-[(2-metylphenyl)cacbamoyl]naphtalen-2-yl butyrat (VIa) Phổ 1H-NMR 3-[(2-metylphenyl)cacbamoyl]naphtalen-2-yl butyrat (VIa) P111 Phổ 1H-NMR 3-[(2-metylphenyl)cacbamoyl]naphtalen-2-yl butyrat (VIa) Phổ 1H-NMR 3-[(2-metylphenyl)cacbamoyl]naphtalen-2-yl 2-clobutyrat (VIb) P112 Phổ 1H-NMR 3-[(2-metylphenyl)cacbamoyl]naphtalen-2-yl 2-clobutyrat (VIb) = Phổ 1H-NMR 3-[(2-metylphenyl)cacbamoyl]naphtalen-2-yl 2-clobutyrat (VIb) P113 Phổ 1H-NMR 3-[(2-metylphenyl)cacbamoyl]naphtalen-2-yl-clo(phenyl)axetat (VIc) Phổ 1H-NMR 3-[(2-metylphenyl)cacbamoyl]naphtalen-2-yl-clo(phenyl)axetat (VIc) P114 Phổ 1H-NMR 3-[(2-metoxiphenyl)cacbamoyl]naphtalen-2-yl butyrat (VId) Phổ 1H-NMR 3-[(2-metoxiphenyl)cacbamoyl]naphtalen-2-yl butyrat (VId) P115 Phổ 1H-NMR 3-[(2-metoxiphenyl)cacbamoyl]naphtalen-2-yl 2-clobutyrat (VIe) Phổ 1H-NMR 3-[(2-metoxiphenyl)cacbamoyl]naphtalen-2-yl 2-clobutyrat (VIe) P116 Phổ 1H-NMR 3-[(2-metoxiphenyl)cacbamoyl]naphtalen-2-yl 2-clobutyrat (VIe) P117 Phổ 1H-NMR 3-[(2-metoxiphenyl)cacbamoyl]naphtalen-2-yl-2-clo(phenyl)axetat (VIf) Phổ 1H-NMR 3-[(2-metoxiphenyl)cacbamoyl]naphtalen-2-yl-2-clo(phenyl)axetat (VIf) P118 ... NHIÊN TRẦN VĂN TÍNH TỔNG HỢP CƠ CHẤT, CHẾ TẠO KÍT VÀ NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN TỐI ƢU ĐỂ NHUỘM TẾ BÀO PHỤC VỤ CHẨN ĐOÁN BỆNH UNG THƢ BẠCH CẦU NGƢỜI Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số:... tính đặc hiệu cao; tối ƣu hóa điều kiện nhuộm chế tạo kít nhuộm esteraza để phân loại tế bào phục vụ việc khám điều trị bệnh ung thƣ máu Nội dung nghiên cứu 1- Nghiên cứu tổng hợp 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit... 3.3 Nghiên cứu nhuộm tế bào bạch cầu chất tổng hợp đƣợc 95 3.3.1 Nghiên cứu tối ƣu hoá phản ứng nhuộm esteraza tế bào bạch cầu 96 3.3.2 Nghiên cứu yếu tố ảnh hƣởng chất đến kết nhuộm 101 3.4 Nghiên