Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01 MỤC LỤC Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Cơng nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DNA Deoxyribonucleotit acid RNA Ribonucleotit acid mRNA Messenger RNA (RNA thông tin) tRNA Transfer RNA (RNA vận chuyển) Amp Ampicillin EDTA Ethylen diamin tetra–acetic acid EtBr Ethidium bromide SDS Sodium dodecyl sulphate TAE Tris–Acetate–EDTA TE Tris–EDTA Taq Polymerase Thermus aquaticus OD Optical Density Nu Nucleotid Kb Kilo base Bp Bazơ pairs Kp Kilo bazơ KDa Kilo Dalton ORF Open reading frame (khung đọc mở) E.coli Escherichia coli M Marker NCBI National Center for Biotechnology Information Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Cơng nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01 DANH MỤC HÌNH VẼ TT Số hình 1.1 Tên hình Cấu trúc hóa học kháng sinh Novobiocin Trang 11 1.2 Sơ đồ tổng hợp kháng sinh Novobiocin 13 1.3 Con đường chung mô tả chế sinh tổng hợp 16 đuờng deoxy–hexose từ glucose–1–phosphate Cấu tạo đường L–Noviose 1.4 Con đường sinh tổng hợp đường dTDP–L– 18 Noviose (ring C) 1.5 Vị trí gen NovU cosmid (9–6G) 19 1.6 Vector pET-32a(+) 19 1.7 Trình tự gen NovU 22 3.1 Kết so sánh tương đồng gen NovU 34 3.2 với gen chức Genbank 35 10 3.3 Kết so sánh tương đồng axit amin 36 enzyme NovU với enzyme chức Genbank 11 3.4 Kết chạy điện di sản phẩm NovU 38 chuyển vào pET-32a(+) 12 3.5 Kết điện di mẫu protein tái tổ hợp 39 nồng độ IPTG khác 13 3.6 Kết điện di mẫu protein tái tổ hợp điều 41 kiện nhiệt độ khác 14 3.7 Kết điện di mẫu protein tái tổ hợp điều kiện thời gian khác Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Cơng nghệ sinh học 42 Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01 MỞ ĐẦU Công nghệ sinh học ứng dụng vào nhiều lĩnh vực như: công nghiệp, nông nghiệp, y học, dịch vụ, du lịch… nhằm phục vụ cho nhu cầu sống như: dinh dưỡng, giải trí, chăm sóc sức khỏe… Bằng kiến thức sinh học thực vật, động vật, nấm, vi khuẩn… sử dụng “Công nghệ DNA tái tổ hợp” nhà khoa học cố gắng tạo trồng, vật ni có suất chất lượng cao, loại thực phẩm, dược phẩm phục vụ cho việc chữa bệnh người… Hiện nay, giới ngành công nghệ hóa dược phát triển lên đến đỉnh cao Các công ty dược, công ty công nghệ sinh học đã, sản xuất bán loại thuốc có nguồn gốc sản phẩm ngành công nghệ sinh học, công nghệ protein, công nghệ gen nhờ ứng dụng công nghệ vi sinh sinh học phân tử Xu hướng nghiên cứu hóa dược giới nghiên cứu tạo hệ kháng sinh cách thay gốc đường vào gốc đường cũ số nhóm kháng sinh [1] Vì vậy, kháng sinh hệ có hoạt tính kháng khuẩn cao hơn, tránh tượng kháng thuốc vi khuẩn, đồng thời khả thải trừ thuốc cao Hiện Việt Nam quan tâm nhiều đến nghiên cứu, gồm nghiên cứu nghiên cứu ứng dụng tạo kháng sinh hệ Vì nghiên cứu gen sinh tổng hợp đường dTDP–L–Noviose có ý nghĩa khoa học thực tiễn Nội dung đề tài: "Nghiên cứu biểu gen NovU tham gia sinh tổng hợp đuờng khử dTDP–L–Noviose thuộc nhóm gen sinh tổng hợp kháng sinh Novobiocin" Mục tiêu đề tài kiểm tra vector tái tổ hợp có chứa gen NovU nghiên cứu biểu gen NovU Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Cơng nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01 CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương kháng sinh 1.1.1 Lịch sử phát triển kháng sinh 1.1.1.1 Lịch sử phát triển kháng sinh giới Giữa kỉ XVII, thầy thuốc hoàng gia Anh chữa bệnh cách dùng rêu đắp lên vết thương Đến cuối kỉ thứ XIX người ta chữa lành vết thương cách sử dụng mẫu bánh mì mốc Năm 1928, Alexander Fleming (Bệnh viện Saint Mary, London) phát nấm tiết chất có tác dụng diệt khuẩn Với phát ông coi người mở kỉ nguyên sử dụng kháng sinh y học Ông trao giải thưởng Nobel y học năm 1945 với Ernst Boris Chain Howard Walter Florey việc tìm phân tách penicillin, từ penicillin coi loại kháng sinh việc điều trị bệnh nhiễm trùng Sulfonamid Gerhard Domard (Đức) tìm vào năm 1932 Streptomycin Selman Waksman Albert Schatz tìm vào năm 1934 Năm 1938, Ernst Boris Chain Howard Walter Florey (Đại học Oxford) bắt đầu nghiên cứu tác dụng điều trị penicillin [2] Năm 1939, Chain theo Florey nghiên cứu tác nhân tự nhiên chống vi khuẩn vi sinh vật sản xuất gây xem xét lại cơng trình Alexander Fleming – người mơ tả penicillin từ năm trước Từ Chain Florey định khám phá tác dụng chữa bệnh penicillin thành phần hóa học Ông tạo lý thuyết cấu trúc penicillin, lý thuyết xác nhận việc xác định cấu trúc tinh thể phương pháp chiếu tia X ba chiều (X–ray crystallography) Dorothy Hodgkin làm Vì Chain, Florey Fleming đoạt giải Nobel năm 1945 Ngày 25/05/1940, thử nghiệm tác dụng kháng sinh thành công chuột Edward Abraham nghiên cứu điều chế penicillin tinh chất Năm 1943, dự án sản xuất penicillin phủ Mỹ đặc biệt ý nghiên cứu thử nghiệm bước đầu sản xuất Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Công nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01 Đến nay, có 1600 chất kháng sinh tìm có khoảng 150 loại sử dụng rộng rãi (các chất kháng sinh không sử dụng phần lớn do: có tính độc, có tác dụng phụ, phổ kháng khuẩn hẹp, giá thành sản xuất cao…) 1.1.1.2 Lịch sử phát triển kháng sinh Việt Nam Ở nước ta kháng sinh đánh đấu bước ngoặt lớn công tác cấp cứu, điều trị chiến thương bảo vệ sức khỏe cộng đồng Năm 1950 kháng chiến chống Pháp, GS Đặng Văn Ngữ nuôi cấy Penicillin Chryroylum dùng chiết môi trường nuôi cấy để điều trị vết thương cho thương binh Năm 1968, môn công nghệ dược Đại học Dược Hà Nội thành lập đào tạo cán chuyên khoa kháng sinh giáo sư Trương Công Quyền làm chủ nhiệm đời sau thời gian hoạt động không thành công nên mơn khơng trì Sau Việt Nam nhiều đối tác nước ngồi Liên Xơ (cũ), Trung Quốc, Tây Ban Nha, Triều Tiên hợp tác giúp đỡ sản xuất, điều chế kháng sinh sau khơng thành cơng nhiều ngun nhân [3] Năm 1985 – 1990, chương trình nghiên cứu Nhà nước 64C – Bộ Y Tế nghiên cứu sản xuất thử kháng sinh Oxytetracyclin Tetracyclin đạt kết không cao công nghệ lẫn hiệu suất Như vậy, thời gian nghiên cứu cộng tác điều chế sản xuất kháng sinh gặp nhiều khó khăn chưa thành công Hiện giới có khoảng 800 kháng sinh tìm thấy có nguồn gốc từ vi sinh vật Và việc sử dụng kháng sinh không giới hạn lĩnh vực y học mà cịn áp dụng rộng rãi chăn ni, trồng trọt công nghiệp thực phẩm 1.1.2 Định nghĩa kháng sinh Kháng sinh định nghĩa theo nhiều cách, theo định nghĩa Waskman (1942): “Kháng sinh sản phẩm trao đổi chất tự nhiên vi sinh vật tạo có tác dụng ức chế hay tiêu diệt chọn lọc vi sinh vật khác” [4] Trong thời đại ngày nay, định nghĩa bộc lộ hạn chế, chưa nêu loại kháng sinh bán tổng hợp, kháng sinh Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Công nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01 thực vật hợp chất hóa học có tác dụng tương tự kháng sinh Vì định nghĩa kháng sinh rộng hơn: “Kháng sinh tất hợp chất tự nhiên, tổng hợp bán tổng hợp có tác dụng ức chế tiêu diệt chọn lọc vi sinh vật gây bệnh mà khơng có khơng tác dụng lên người, động vật thực vật” [5] 1.1.3 Phân loại kháng sinh Phân loại kháng sinh nhằm khái quát cách có hệ thống danh mục kháng sinh ngày nhiều thêm, có nhiều sở để phân loại kháng sinh, dựa vào phổ tác dụng, chế tác dụng, vào nguồn gốc, đường sinh tổng hợp hay theo cấu trúc hóa học Dưới cách phân loại dựa theo cấu trúc hóa học Theo cách kháng sinh có nhóm [4]: Các kháng sinh cacbonhydrat Các saccarid nojirimycin Các aminoglycosid streptomycin Các lacton macrocylic Các kháng sinh macrolid erythromycin Các kháng sinh polyen nystatin Các kháng sinh quinon dẫn xuất Các tetracylin tetracylin Các antracylin adriamycin Các kháng sinh peptid acid amin Các dẫn xuất axit amin cycloserin Các kháng sinh β–lactam penicillin Các kháng sinh dị vòng chứa nitơ Các kháng sinh nucleotid polyoxin Các kháng sinh dị vòng chứa oxy Kháng sinh polyete monenzin Kháng sinh mạch vòng no Các dẫn xuất alkan cycloheximid Kháng sinh steroid axit fuzidic Các kháng sinh chứa nhân thơm Các dẫn chất benzen chloramphenicol Các chất nhân thơm ngưng tụ griseofulvin Các ete thơm Novobiocin (kháng sinh nghiên cứu đề tài này) Các kháng sinh mạch thẳng Các kháng sinh chứa photpho photphomycin 1.1.4 Cơ chế tác dụng kháng sinh Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Cơng nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01 Gồm có chế chính: Kháng sinh ức chế sinh tổng hợp thành tế bào vi khuẩn Quá trình tổng hợp thành tế bào vi khuẩn gồm nhiều phản ứng với bước khác sau: - Sự tổng hợp UDP–N–acetyl–muramyl–pentapeptid - Tổng hợp đơn vị peptidoglycan (murein) - Nối đơn vị peptidoglycan với qua phản ứng xuyên mạch peptid tạo không gian ba chiều mạng lưới dày đặc, tức màng vi khuẩn Trong q trình xun mạch phải có tham gia enzyme transpeptidase Các thuốc kháng sinh sau khuếch tán vào dịch thể tổ chức mô bào chúng kết hợp với enzyme transpeptidase tạo phức nhầm với kháng sinh bền vững không hồi phục, phức cản trở phản ứng xuyên mạch peptid vi khuẩn [6] Vi khuẩn lúc tiếp tục tổng hợp protein vỏ bị dị dạng Kháng sinh ức chế sinh tổng hợp màng tế bào vi khuẩn Màng tế bào vi khuẩn gồm thành phần chính: - Murein chủ yếu Gram (+) (các đơn vị peptidoglycan) - Polysaccarid, Protein, Lipoprotein: có chủ yếu Gram (–) Lypopolysaccarid Các thành phần gắn kết với hài hòa để tạo nên màng tế bào vi khuẩn đặc biệt ý đến Murein tạo nên polymer dạng lưới Các kháng sinh làm cản trở hình thành dạng lưới Ví dụ: + Penicillin, Baxi tranxin vơ hiệu hóa enzyme Transpeptidase (là enzyme chuẩn bị Murein để xây dựng nên màng vi khuẩn) làm cho việc tu bổ màng tế bào vi khuẩn bị ngừng trệ + Vancomycin cản trở trình tạo nên màng lưới Mureinpolymer kháng sinh gắn chặt với Alanindipeptid (là chất quan trọng q trình này) + Chloramphenicol dày khơng cân đối, tạo nên u thành vỏ vi khuẩn Gentamycin làm đông đặc biến dạng thành vỏ vi khuẩn [6] + Các nhóm kháng sinh ức chế chức màng tế bào gồm có: colistin, polymycin, gentamycin, amphoterricin [4] Kháng sinh làm Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Công nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01 chức màng tế bào cho phân tử có khối lượng lớn ion bị Kháng sinh ức chế sinh tổng hợp Protein vi khuẩn Các kháng sinh làm rối loạn ức chế tổng hợp protein vi khuẩn mức ribosome Vi khuẩn không tạo nên chất tham gia vào trình phân chia di truyền tế bào Kháng sinh gắn vào tiểu phần 30s, 50s 70s ribosome tế bào vi khuẩn làm cho q trình tổng hợp protein khơng diễn Nhóm aminoglycosid gắn với receptor tiểu phần 30s robosome làm cho q trình dịch mã khơng xác Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phần 50s ribosome ức chế enzyme peptidyltransferase ngăn cản việc gắn acid amin vào chuỗi polypeptide Nhóm macrolides lincoxinamid gắn với tiểu phần 50s ribosome làm ngăn cản trình dịch mã acid amin chuỗi polypeptide [6] Nhóm kháng sinh tác dụng lên hệ thống enzyme có chức điều hịa q trình sinh tổng hợp protein Theo chế này, loại kháng sinh tác động vào giai đoạn khác q trình sinh tổng hợp Ví dụ như: Tetracycline, Gentamycin cản trở vận chuyển phenylalaline làm giảm lực tRNA với acid amin Chloramphenicol Puromycin lại tác động vào giai đoạn cuối aminoacetyl–adenul–là chất gắn vào tRNA, làm cho tRNA không vận chuyển acid amin [4] Kháng sinh ức chế sinh tổng hợp DNA vi khuẩn Ức chế trình tổng hợp acid nucleic Nhóm refampin gắn với enzyme polymerase ngăn cản trình mã tạo thành mRNA (RNA thơng tin) Nhóm quinolone ức chế tác dụng enzyme DNA gyrase làm cho hai mạch đơn DNA khơng thể duỗi xoắn, làm ngăn cản q trình nhân đơi DNA Nhóm Sulfomide có cấu trúc giống PABA (p–aminobenzoic acid) có tác dụng cạnh tranh PABA ngăn cản trình tổng hợp acid nucleic Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Công nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01 Nhóm trimethoprim tác động vào ezyme xúc tác cho trình tạo nhân purin làm ức chế trình tạo acid nucleic Kháng sinh ức chế sinh tổng hợp axit Folic Tác động lên tổng hợp Folate coenzyme Ví dụ: Sulfamethaxozol, Rifamycin… Kháng sinh ức chế số trình sinh tổng hợp khác 1.1.5 Ứng dụng kháng sinh a Các penicillin Các penicillin nhóm kháng sinh phát Ban đầu chiết suất từ nấm Penicillin Hiện tổng hợp từ số loại hóa chất khác Các dịng penicillin gồm có: - Penicillin G penicillin V: Hai loại tổng hợp - Aminopenicillin: Là penicillin bán tổng hợp gồm có ampicillin, amocillin… - Các penicillin kháng enzyme penicillinase: Như axacillin, methicillin, chloxacillin… - Penicillin chuyên dùng để điều trị vi khuẩn nhóm Pseudomonas: piperacillin, carbercillin, ficarcillin… b Các cephalosporin Gồm hệ: I, II, III, IV Thế hệ I, II chủ yếu điều trị vi khuẩn Gram (+), hệ III, IV chủ yếu điều trị vi khuẩn Gram (–) - Các penicillin kết hợp chất ức chế enzyme β–lactamase - Nhóm tetracycline gồm: tetracyclin, oxytetracycline, chlorotetracycline, cloxycyclin… - Nhóm chloramphenicol như: chlocid, chloramphenicol… - Nhóm macrolide gồm: erythromycin, spiramycin, azthromycin, rovamycin, tylosin… - Nhóm lincoxinamide: lincoxin - Nhóm aminoglycosid: streptomycin, neomycin… - Nhóm quinolon: ciprofloxacin, ciprofloxacin–d8, oxolinic acid, danofloxacin, enrofloxacin, difloxacin, sarafloxacin, ofloxacin, norfloxacin… c Các aminosid Có từ nguồn gốc vi sinh, có phổ tác dụng rộng, chủ yếu vi khuẩn Gram (–), theo nguồn gốc vi sinh chia ra: Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Cơng nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01 Hình 3.2 Kết so sánh tương đồng gen NovU với gen chức Genbank 3.1.2 Dự đoán chức enzyme NovU Ngoài so sánh độ tương đồng nucleotid ta cịn so sánh độ tương đồng axit amin Cũng qua địa Web ta thấy gen NovU có độ tương đồng trình tự axit amin (Hình 3.3) với trình tự axit amin có tính chất C–methyltransferase Cụ thể độ tương đồng 89% với Streptomyces roseochromogenes subsp oscitans, độ tương đồng 86% với Streptomyces rishiriensis… Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Cơng nghệ sinh học 33 Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01 Hình 3.3 Kết so sánh tương đồng axit amin enzyme NovU với enzyme chức Genbank Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Công nghệ sinh học 34 Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01 Dựa vào kết so sánh tương đồng axit amin enzyme NovU với enzyme chức ngân hàng gen kết giải trình tự chuỗi gen mã hóa enzyme NovU, ta dự đốn kích thước protein 1200 bp Qua kết giải trình tự bao gồm so sánh độ tương đồng gen axit amin, ta dự đoán chức gen NovU mã hóa cho C– methyltransferase tham gia vào q trình sinh tổng hợp đường dTDP–L– Noviose (Hình 3.2) (Hình 3.3) 3.2 Kiểm tra vector biến nạp E.coli BL 21 DE3 Để kiểm tra lại kết chuyển gen NovU vào pET-32a(+), ta nuôi tăng sinh chủng E.coli BL 21 DE3 chuyển gen NovU môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh ampicillin với nồng độ 1mg/1ml môi trường 37 0C lắc dịch nuôi 250 vòng/phút khoảng 16–18 Khi OD đạt 0.6, tiến hành tách plasmid, plasmid cắt hai enzyme giới hạn KpnI/HindIII theo công thức: Thành phần Buffer NEB3 Enzyme KpnI Enzyme HindIII Plasmid Nước Tổng Thể tích 3.0 µl 1.5 µl 1.5 µl 20.0 µl 4.0 µl 30.0 µl Thực phản ứng 370C Kiểm tra mẫu cắt phương pháp điện di agarose Sản phẩm cắt chạy điện di gel agarose Kết chạy điện di thể hình 3.4 Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Cơng nghệ sinh học 35 Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01 Hình 3.4 Kết chạy điện di sản phẩm NovU chuyển vào pET-32a(+) M : Marker (đơn vị kb) Mẫu 1: Mẫu plasmid mang gen NovU với 5.9 kb độ dài vector pET-32a(+), 1.2 kb độ dài gen NovU Từ kết điện di thu thấy mẫu có vạch DNA với kích thước mong muốn Trong đó, vạch lớn có độ dài 5.9 kb tương ứng với độ dài vector pET-32a(+), vạch nhỏ có độ dài 1.2 kb tương ứng với độ dài gen NovU Kết chứng minh gen NovU chuyển vào E coli BL21 DE3 thành công 3.3 Biểu gen NovU 3.3.1 Biểu Để biểu NovU, E.coli BL21 DE mang gen NovU phát triển môi trường LB đặc có bổ sung ampicillin, sau tăng sinh mơi trường LB lỏng có bổ sung ampicillin (nồng độ 1mg/ml), nuôi khoảng 8– Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Công nghệ sinh học 36 Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01 12 370C, OD đạt 0.6 bổ sung IPTG với nồng độ khác là: mg/ml, mg/ml mg/ml tiếp tục nuôi thời gian 12 240C để dự đốn nồng độ IPTG cho khả sinh enzyme nhiều Khi tìm nồng độ IPTG thích hợp, ta lại ni tăng sinh E.coli BL21 DE3 mang gen mã hóa NovU 370C OD đạt 0.6 bổ sung nồng độ IPTG mg/ml Sau tiếp tục ni điều kiện sau: + Trong thời gian 12 nhiệt độ khác 24 0C, 280C 320C + Ở 240C thời gian khác là: giờ, 12 3.3.2 Kết biểu 3.3.2.1 Ảnh hưởng nồng độ IPTG Hình 3.5 Kết điện di mẫu protein tái tổ hợp nồng độ IPTG khác Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Cơng nghệ sinh học 37 Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01 M : Marker Mẫu 1: Nồng độ IPTG mg/ml Mẫu 2: Nồng độ IPTG mg/ml Mẫu 3: Nồng độ IPTG mg/ml Sau nuôi E.coli BL 21 DE3 (NovU) nồng độ IPTG khác nhau, ta tiến hành thu mẫu, tách enzyme đem chạy điện với mẫu riêng biệt Qua hình ảnh ta thấy mẫu protein tái tổ hợp biểu với khối lượng 62 kDa Khối lượng bao gồm khối lượng đoạn 6xHis.Tag acid amin protein thioredoxin Hai đoạn thành phần mã hóa đoạn gen liên kết với gen NovU nằm vector biểu pET-32a(+) Tại nồng độ IPTG mg/ml (cùng nhiệt độ thời gian) vạch protein xuất khối lượng 62 kDa đậm Điều chứng tỏ nồng độ enzyme nội bào sinh nhiều Vậy ta tiếp tục tìm điều kiện nhiệt độ thích hợp để vi sinh vật có khả sinh enzyme nội bào nhiều với nồng độ IPTG mg/ml 3.3.2.2 Ảnh hưởng điều kiện nhiệt độ biểu Tiếp tục nuôi E.coli BL 21 DE3 (NovU) điều kiện nhiệt độ khác sau bổ sung IPTG với nồng độ thích hợp mg/ml thời gian Sau thu mẫu, tiến hành tách enzyme đem chạy điện di, ta thấy điều kiện thời gian 12 nhiệt độ 28 0C 320C mẫu xuất vạch protein đậm khơng phải enzyme NovU có khối lượng 62 kDa mong muốn Vì vậy, enzyme nhiệt độ không biểu Riêng 240C, lượng enzyme sinh lớn vạch protein khối lượng 62 kDa có màu đậm Điều chứng tỏ nhiệt độ E.coli BL21 DE3 (NovU) cho biểu lượng enzyme lớn Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Công nghệ sinh học 38 Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01 Hình 3.6 Kết điện di mẫu protein tái tổ hợp điều kiện nhiệt độ khác M : Marker Mẫu thứ 1: Nuôi 240C Mẫu thứ 2: Nuôi 280C Mẫu thứ 3: Nuôi 320C 3.3.2.3 Ảnh hưởng điều kiện thời gian biểu Sau tìm nồng độ nhiệt độ thích hợp, ta lại tiến hành ni E.coli BL 21 DE3 (NovU) nhiệt độ thích hợp 24 0C với điều kiện thời gian khác sau bổ sung IPTG với nồng độ thích hợp mg/ml Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Công nghệ sinh học 39 Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01 Hình 3.7 Kết điện di mẫu protein tái tổ hợp điều kiện thời gian khác M : Marker Mẫu thứ 1: Nuôi Mẫu thứ 2: Nuôi Mẫu thứ 3: Nuôi 12 Qua kết ta nhận thấy rằng: Các mẫu nuôi nồng độ IPTG nhiệt độ xuất vạch protein chứng tỏ điều kiện E.coli BL21 DE3 (NovU) sinh enzyme nội bào tốt Tuy nhiên, dựa vào màu sắc kết mẫu điện di ta thấy mẫu ni thời gian có lượng Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Công nghệ sinh học 40 Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01 protein sinh thấp Với thời gian ni lượng protein sinh nhiều không đáng kể Khi nuôi thời gian 12 lượng protein sinh nhiều mốc 62 kDa nhận thấy màu đậm Do đó, thời gian ni 12 điều kiện thích hợp để E.coli BL21 DE3 (NovU) cho biểu lượng enzyme lớn Từ kết thu được, ta nhận xét điều kiện nuôi cấy 240C 12 với nồng độ IPTG 6mg/ml, vi khuẩn E.coli BL21 DE3 biểu enzyme NovU tốt Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Cơng nghệ sinh học 41 Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu trên, rút số kết luận sau: Phân tích có mặt gen NovU tế bào vật chủ Tổng số nucleotid gửi giải trình tự khớp với nucleotid đăng ký ngân hàng gen Và qua kết thấy gen NovU có độ tương đồng 99% với gen tương tự chủng Streptomyces caeruleus Kết chạy điện di agarose kiểm tra plasmid tái tổ hợp tương ứng với độ dài gen NovU Điều chứng minh sau thiết kế, vector có tồn tế bào vật chủ trình chuyển vector thành công Kết thu tách enzyme NovU thô với sản phẩm điện di protein cho thấy enzym NovU biểu khối lượng 62 kDa bao gồm khối lượng đoạn 6xHis.Tag acid amin protein thioredoxin Hai đoạn thành phần mã hóa đoạn gen liên kết với gen NovU mà nằm vector biểu pET-32a(+) Điều chứng minh q trình biểu protein thành cơng Đồng thời dự đoán điều kiện tối ưu để biểu gen NovU để sinh enzyme NovU dạng tan 24 0C 16 với nồng độ IPTG mg/ml Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Cơng nghệ sinh học 42 Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01 TÀI LIỆU THAM KHẢO Steffensky, M., Muhlenweg, A., Wang, Z.X , Li, S.M and Heide, L (2000) Identification of the novobiocin biosynthetic gene cluster of S spheroides NCIB 11891 Antimicrob Agents Chemother 44, 1214–1222 http://d.violet.vn/uploads/resources/562/426665/KHANGSINH.ppt Nguyễn Duy Lương, Đoàn Hồng Đào, GS Vũ Khánh Sản xuất nguyên liệu kháng sinh nước Hội dược học PGS.TS Cao Văn Thu (2000) Bài giảng kháng sinh vitamin Dương Thị Kim Chung (2009) Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ xạ khuẩn Streptomyces 119.23 Khóa luận tốt nghiệp kỹ sư công nghệ sinh học (2005–2009) Khoa Nông–Lâm ĐH Tây Nguyên (2008) Kháng sinh chăn nuôi http://en.wikipedia.org/wiki/Novobiocin David Greenwood: Sách Antimicrobial drugs: chronicle of a twentieth century medical triumph – Page 240 Vorgelegt von Alessandra da Silva Eustáquio (2004): Biosynthesis of aminocoumarin antibiotics in Streptomyces: Generation of structural analogues by genetic engineering and insights into the regulation of antibiotic production 10 Kamprainis, S.C., Gormley, N.A., Tranter, R., Orphanides, G and Maxwell, A (1999) Probing the binding of coumarins and cyclothialidines to AND gyrase Biochemistry 38, 1967–1976 11 Luận văn tiến sỹ TS Tạ Thị Thu Thủy 12 Hooper, D.C., Wolfson, J.S., McHugh, G.L., Winters, M.B and Swartz, M.N (1982) The effects of novobiocin, coumemycin A1, clorobiocin, and their analogs on Escherichia coli DNA gyrase and bacterial growth Antimicrob Agents Chemother 22, 662–671 Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Công nghệ sinh học 43 Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01 13 Hansen, J L., Ippolito, J A., Ban, N., Nissen, P., Moore, P B., Steitz, T A., (2002) Mol Cell., 10, 117–128 14 Khuất Hữu Thanh, 2006, Kỹ thuật gen nguyên lý ứng dụng, NXB khoa học kỹ thuật Hà Nội 15 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16850190 16 http://www.springerlink.com/content/9g477k557j36r264/ 17 PGS TS Đặng Thị Thu, PGS Lê Ngọc Tú, TS Tô Kim Anh, PGS TS Phạm Thu Thủy, TS Nguyễn Xuân Sâm, Công nghệ enzyme, Nxb Khoa học kỹ thuật 18 Quyền Đình Thi, (2005), Cơng nghệ sinh học tập I, Nxb Khoa học kỹ thuật 19 Võ Thị Thương Lan, (2008), Giáo trình sinh học phân tử ứng dụng, Nxb Khoa học kỹ thuật 20 Robert A Copeland, (1994), Methods for protein analysis, first pudlished by Chapman & Hall One Penn Plaza New York, NY 10119, Publish in Great Britain by Chapman and Hall, 2-6 Boundary Row London SE1 8HN 21 Kirst, H A.,Sides, G.D., (1998) Antimicrob Agents Chemother., 33, 1313-1418 22 Henninger, T.C.,(2003), Expert Opin Ther Part 13, 787-805 23 Susan, M.P., Kofoed, C., Vester, (2000) J Mol Biol., 304, 471-481 24 Zhanel, G G., Dueck, M., Hoba, D J., Vercaogeme, L M., embil, J M., Gin, A.S., Karlowsky, J.M., (2001) Drugs, 61, 443-498 Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Công nghệ sinh học 44 ... nghiên cứu gen sinh tổng hợp đường dTDP–L–Noviose có ý nghĩa khoa học thực tiễn Nội dung đề tài: "Nghiên cứu biểu gen NovU tham gia sinh tổng hợp đuờng khử dTDP–L–Noviose thuộc nhóm gen sinh tổng hợp. .. Trong đường sinh tổng hợp đường noviose (Ring C) kháng sinh Novobiocin có tham gia gene bao gồm: NovV, NovT, NovW, NovU, NovS [10] Vị trí gene NovU phần gene tham gia trình sinh tổng hợp Novobiocin. .. Các nghiên cứu kháng sinh Novobiocin Năm 2000, nhóm gen tham gia vào đường sinh hóa tổng hợp Novobiocin tách dịng thành cơng nhóm nghiên cứu M.Steffensky cộng Toàn DNA với tổng số 26.5 kb 23 gen