Nhóm Lớp 08DTP06 Enzyme Amylase Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM Khoa Công Nghệ Thực Phẩm  Bài tiểu luận Lớp 08DTP06 Sinh viên thực hiện : 1/ Nguyễn Lê Hoàng 2/ Hoàng Ngọc Duy Quang 3/ Nguyễn Thị Kim Vân 4/ Nguyễn Ngọc Trung 5/ Lê Nguyễn Nhân Luân -1– Nhóm Lớp 08DTP06 Enzyme Amylase Tháng 5/2010 MỤC LỤC Giới thiệu chung A Giới thiệu I Khái niệm Enzyme II Enzyme Amylase là III Lịch sử phát hiện .5 B Tổng quan Enzyme Amylase I Phân loại .6 II Hệ Enzyme Amylase Enzyme α-Amylase Enzyme β-Amylase 11 Enzyme γ-Amylase 13 Oligo 1,6-glucosidase 14 Enzyme pullulanase .15 α-glucosidase hay maltase 14 III Cơ chất 15 Tinh bột 15 Glycogen 16 IV Công nghệ lên men và thu nhận Enzyme Amylase 17 Nguồn thu nhận 17 Thu nhận Enzyme Amylase từ thực vật 19 Thu nhận Enzyme Amylase từ vi sinh vật 22 V Phương pháp xác định hoạt độ 28 Đơn vị đo hoạt độ 28 Xác định hoạt độ Enzyme α-Amylase theo Rukhliadeva 28 Xác định hoạt độ Enzyme glucoamylase ( γ-Amylase ) 29 Điều kiện cần và đủ để thu nhận Amylase có hoạt lực cao 29 C Ứng dụng Enzyme Amylase I.Ứng dụng sản xuất Bia 33 II.Ứng dụng sản xuất Bánh mì 37 III Ứng dụng sản xuất Siro 38 IV.Ứng dụng sản xuất cồn 41 V Ứng dụng sản xuất bánh kẹo 42 VI.Ứng dụng sản xuất Glucose và Mật .43 VII.Ứng dụng chế biến thức ăn gia súc .43 VIII Ứng dụng công nghiệp dệt 43 Tài liệu tham khảo 45 -2– Nhóm Lớp 08DTP06 Enzyme Amylase Giới thiệu chung Tinh bột, với protein và chất béo là thành phần quan trọng bậc chế độ dinh dưỡng loài người nhiều loài động vật khác Người La Mã gọi là amilum, từ bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp (amilon ) Trong trình tiêu hóa chúng bị thủy phân thành đường glucose là chất tạo nên nguồn lượng thực phẩm Ngoài tinh bột giữ vai trò quan trọng cơng nghiệp thực phẩm tính chất hóa lý chúng Tinh bột thường dùng làm chất tạo độ nhớt sánh cho thực phẩm dạng lỏng, là tác nhân làm bền cho thực phẩm dạng keo, là yếu tố kết dính và làm đặc để tạo độ cứng, độ đàn hồi cho nhiều loại thực phẩm Bên cạnh đó, tinh bột dùng ngành công nghiệp khác sản xuất giấy, rượu, Nhiều nước giới sử dụng nguồn tinh bột từ khoai tây, lúa mì, ngơ (sắn), cịn riêng nước ta sử dụng gạo và khoai mì là nguồn tinh bột chủ yếu Trong chế biến tinh bột và đường, công đoạn quan trọng là thuỷ phân tinh bột đường đơn giản Sau đó, chủ yếu sở đường đơn nhờ lên men, người ta nhận nhiều sản phẩm quan trọng như: rượu cồn, rượu vang, bia, loại acid hữu cơ, amino acid,… Trước người ta hay dùng acid H 2SO4 để thủy phân tinh bột Nhưng kết cho thấy, thuỷ phân acid khó kiểm sốt và thường tạo nhiều sản phẩm khơng mong muốn và không đáp ứng tiêu chuẩn an toàn thực phẩm giá thành lại cao Cho nên hiện để thủy phân tinh bột người ta thường sử dụng Enzyme Amylase thu nhận từ thực vật loại vi sinh vật Ngoài ra, Amylase có nhiều ưu điểm sử dụng acid để thuỷ phân tinh bột lượng xúc tác thấp, không yêu cầu cao thiết bị sử dụng, giảm chi phí cho q trình tinh sạch dịch đường Nguồn Amylase có thể lấy từ mầm thóc, mầm đại mạch ( malt ), hạt bắp nảy mầm, hay từ nấm mốc,… Trong đó Amylase thu nhận từ malt với số lượng nhiều nhất, chủ yếu dùng sản xuất bia Nguyên liệu cho sản xuất Enzyme thường là gạo, bắp, khoai mì,… là nguồn nguyên liệu rẻ tiền có thể tìm thấy dễ dàng nước ta Cho nên là lợi và là hướng phát triển mạnh có thể làm sở cho nhiều ngành khác phát triển -3– Nhóm Lớp 08DTP06 Enzyme Amylase A Giới Thiệu I Khái niệm Enzyme: Trong thể sống (các tế bào) ln ln xảy q trình trao đổi chất Sự trao đổi chất ngừng sự sống khơng cịn tồn tại Q trình trao đổi chất là tập hợp nhiều phản ứng hóa học phức tạp Các phản ứng này có liên quan chặt chẽ với và điều chỉnh lẫn Enzyme là hợp chất protein xúc tác cho phản ứng hóa học đó Chúng có khả xúc tác đặc hiệu phản ứng hóa học định và đảm bảo cho phản ứng xảy theo chiều hướng định với tốc độ nhịp nhàng thể sống Enzyme có hầu hết loại tế bào thể sống Chính tác nhân xúc tác có nguồn gốc sinh học nên Enzyme gọi là chất xúc tác sinh học (biocatalysators) nhằm để phân biệt với chất xúc tác hóa học Chúng là chất xúc tác sinh học khơng có vai trị quan trọng q trình sinh trưởng, phát triển mọi sinh vật mà nó cịn giữ vai trị quan trọng cơng nghệ chế biến thực phẩm, y học, kỹ thuật phân tích, cơng nghệ gen và bảo vệ mội trường II Enzyme Amylase gì? Amylase là hệ Enzyme phổ biến giới sinh vật Các Enzyme này thuộc nhóm Enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử nhóm polysaccharide với sự tham gia nước RR’ + H-OH  RH + R’OH Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose và dextrin hạn chế Các Enzyme Amylase có nước bọt (còn gọi là ptyalin), dịch tiêu hóa người và động vật, hạt nảy mầm, nấm sợi, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn Trong nước bọt người có ptyalin số loại động vật có vú khơng có ngựa, chó, mèo Ptyalin bắt đầu thủy phân tinh bột từ miệng và trình này hoàn tất ruột non nhờ Amylase tuyến tụy (còn gọi là amylopsin) Amylase malt thủy phân tinh bột lúa mạch thành disaccharide làm chất cho trình lên men nấm men Amylase là loại Enzyme ứng dụng rộng rãi công nghiệp, y tế, và nhiều lĩnh vực kinh tế khác, đặc biệt là ngành công nghiệp thực phẩm -4– Nhóm Lớp 08DTP06 Enzyme Amylase III Lịch sử phát 1814: Kirchoff, Saint Petercburg chứng minh hạt lúa mạch nảy mầm có tác dụng chuyển hóa tinh bột thành đường nhiệt độ từ 4000C – 6000C Năm 1833, Payen và Perso (Pháp) thêm cồn vào dịch chiết này, thu kết tủa có khả phân giải tinh bột thành đường, và đặt tên là Diastase (xuất phát từ tiếng Hy Lạp, diastatics, có nghĩa là phân giải, đó là Amylase) Sau này theo đề nghị Duclo, Enzyme phân giải tinh bột gọi là Amylase Năm 1851: Leuchs phát hiện nước bọt có khả phân giải tinh bột thành đường Sau đó, Enzyme Amylase nước bọt, dịch tiêu hóa người và động vật, hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn bắt đầu quan tâm nghiên cứu Năm 1862, Danilevxki tách Amylase tuyến tụy phương pháp hấp thụ chọn lọc Năm 1949, Schwimmer xác định số chu chuyển α-Amylase là 19000 Năm 1950, Englard và Singer cho biết số chu chuyển -Amylase là 250000 Đến năm 1952, người ta thu 72 Enzyme trạng thái kết tinh đó có Enzyme α-Amylase Năm 1971, Uxtinilov và cộng sự phương pháp điện di gel poliacrylamid xác định sự có mặt lượng lớn α-Amylase và glucoamylase canh trường nấm mốc và lượng nhỏ phân đoạn có hoạt lực dextrinase và transglucosilase Hiện nước giới sản xuất hàng trăm chế phẩm Enzyme, đó Nhật là nước có truyền thống lâu đời nhất, sau đó đến Anh, Pháp, Mỹ, Đan Mạch, Thụy Điển, đặc biệt hãng Novo Đan Mạch là hãng sản xuất Enzyme tiếng giới Bên cạnh đó năm gần nước Đông Âu và Trung Quốc bắt đầu nghiên cứu và sản xuất Enzyme Nếu Tây Âu mạch nha từ lúa mạch là nguồn Enzyme chủ yếu cho việc chuyển hóa tinh bột thành đường, Viễn Đông Amylase thường sản xuất từ nấm mốc môi trường nuôi cấy là loại ngũ cốc có chứa tinh bột Như hãng Novo có nhiều chế phẩm Enzyme Amylase sử dụng rộng rãi ngành công nghiệp như: Công nghiệp sản xuất rượu bia, công nghiệp sản xuất bột giặt, công nghiệp giấy… -5– Nhóm Lớp 08DTP06 Enzyme Amylase B Tổng quan Enzyme Amylase I Phân loại : Hiện nay, có sáu loại Enzyme Amylase xếp vào nhóm: Endoamylase ( Enzyme nội bào ) và Exoamylase ( Enzyme ngoại bào ) - Endoamylase : gồm có α-Amylase (EC 3.2.1.1) và nhóm Enzyme khử nhánh Nhóm Enzyme khử nhánh này chia thành hai loại: khử trực tiếp là pullulanase ( hay α-dextrin 6-glucanohydrolase ) (EC 3.2.1.41); khử gián tiếp là transglucosylase (hay oligo-1,6glucosidase) (EC 3.2.1.20) và amylo-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.10) Các Enzyme này thủy phân liên kết bên chuỗi polysaccharide - Exoamylase Đây là Enzyme thủy phân tinh bột tử đầu không khử chuỗi polysaccharide Nhóm này gồm có: + β-Amylase (EC 3.2.1.2) + Amyloglucosidase (glucoamylase hay γ-Amylase) (EC 3.2.1.3) Amylase Exoamylase β-Amylase Endoamylase γ-Amylase Enzym khử nhánh Khử trực tiếp α-dextrin 6-glucanohydrolase (pullulanase) α-Amylase Khử gián tiếp oligo-1,6-glucosidase (transglucosylase) Và amylo 1,6-glucosidase Các loại Enzyme endoAmylase và exoAmylase * Sự khác biệt loại Enzyme Amylase: - Các loại Enzyme Amylase khơng khác đặc tính mà cịn khác pH hoạt động và tính ổn định với nhiệt -6– Nhóm Lớp 08DTP06 Enzyme Amylase - Tốc độ phản ứng Amylase phụ thuộc vào pH, nhiệt độ, mức độ polyme hóa chất Các Enzyme Amylase có nguồn gốc khác có tính chất, chế tác dụng và sản phẩm cuối trình thủy phân khác - Amylase có nguồn gốc khác có thành phần, tính chất, nhiệt độ hoạt động, pH tối ưu và đặc điểm thủy phân khác II Hệ Enzyme Amylase: Enzyme α-Amylase (Amylase (α-Amylase (1,4-Amylase (glucanohydrolase) (EC 3.2.1.1): a) Cấu tạo: Enzyme α-Amylase là protein có phân tử lượng thấp, thường nằm khoảng 50.000 đến 60.000 Dal Có số trường hợp đặc biệt α-Amylase từ loài vi khuẩn Bacillus macerans có phân tử lượng lên đến 130.000 Dal Đến người ta biết rõ chuỗi acid amin 18 loại α-Amylase có loại α-Amylase là taka-Amylase từ Apergillus orysee và α-Amylase tụy lợn nghiên cứu kỹ hình thể khơng gian cấu trúc bậc Mới nghiên cứu tính đồng chuỗi mạch acid amin và vùng kị nước cho thấy chuỗi mạch acid amin tất Enzyme α-Amylase có cấu trúc bậc tương tự Cấu trúc không gian α-AmylaseAmylase b) Cơ chế tác dụng α-AmylaseAmylase: -7– Nhóm Lớp 08DTP06 Enzyme Amylase α-Amylase từ nguồn khác có nhiều điềm giống α-Amylase có khả phân cắt liên kết α-1,4-glucoside nằm phía bên phân tử chất ( tinh bột glycogen ) cách ngẫu nhiên, không theo trật tự nào α-Amylase không thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân hạt tinh bột nguyên song với tốc độ chậm Quá trình thủy phân tinh bột α-Amylase là trình đa giai đoạn: + Ở giai đoạn đầu ( giai đoạn dextrin hóa ): Chỉ số phân tử chất bị thủy phân tạo thành lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin ), độ nhớt hồ tinh bột giảm nhanh ( amylose và amylopectin bị dịch hóa nhanh ) + Sang giai đoạn ( giai đoạn đường hóa ): Các dextrin phân tử thấp tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo tetra-trimaltose không cho màu với iodine Các chất này bị thủy phân chậm α-Amylase cho tới disaccharide và monosaccharide Dưới tác dụng αAmylase, amylose bị phân giải nhanh thành oligosaccharide gồm - gốc glucose ( vậy, người ta cho α-Amylase phân cắt amylose thành đoạn - gốc glucopiranose ) + Sau đó, poliglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo nên mạch polyglucose colagen ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose, maltotriose và maltose Qua thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân amylose chứa 13% glucose và 87% maltose Tác dụng α-Amylase lên amylopectin xảy tương tự khơng phân cắt liên kết α-1,6-glycoside chỗ mạch nhánh phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu sản phẩm cuối cùng, ngoài đường nói ( 72% maltose và 19% glucose ) có dextrin phân tử thấp và isomaltose 8% Tóm lại, dưới tác dụng α-Amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp Tuy nhiên, thông thường α-Amylase thủy phân tinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp không cho màu với Iodine và maltose Khả dextrin hóa cao α-Amylase là tính chất đặc trưng nó Vì vậy, người ta thường gọi loại Amylase này là Amylase dextrin hóa hay Amylase dịch hóa Các giai đoạn trình thủy phân tinh bột α-Amylase: + Giai đoạn dextrin hóa: Tinh bột α-Amylase dextrin phân tử lượng thấp + Giai đoạn đường hóa: Dextrin tetra và trimaltose di & monosaccharide Amylase oligosacharide poliglucose -8– Nhóm Lớp 08DTP06 Maltose Enzyme Amylase maltotriose maltotetrose c) Đặc tính α-AmylaseAmylase α-Amylase từ nguồn khác có thành phần amino acid khác nhau, loại αAmylase có tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng α-Amylase là protein giàu tyrosine, tryptophan, acid glutamic và aspartic Các glutamic acid và aspartic acid chiếm khoảng ¼ tổng lượng amino acid cấu thành nên phân tử Enzyme: + α-Amylase có methionine và có khoảng 7-10 gốc cysteine + Trọng lượng phân tử α-Amylase nấm mốc: 45.000-50.000 Da ( Knir 1956; Fisher, Stein, 1960 ) + Amylase dễ tan nước, dung dịch muối và rượu loãng + Protein α-Amylase có tính acid yếu và có tính chất globuline Điểm đẳng điện nằm vùng pH=4,2 - 5,7 ( Bernfeld P, 1951 ) α-Amylase là metaloEnzyme Mỗi phân tử α-Amylase có chứa 1-30 ngun tử gam Ca/mol, khơng - nguyên tử gam/mol Ca tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc Enzyme, trì hoạt động Enzyme ( Modolova, 1965 ) Do đó, Ca cịn có vai trị trì sự tồn tại Enzyme bị tác động tác nhân gây biến tính và tác động Enzyme phân giải protein Nếu phân tử α-Amylase bị loại bỏ hết Ca nó hoàn toàn bị hết khả thủy phân chất α-Amylase bền với nhiệt độ Enzyme khác Đặc tính này có lẽ liên quan đến hàm lượng Ca phân tử và nồng độ Mg2+ Tất Amylase bị kiềm hãm kim loại nặng Cu2+, Ag+, Hg2+ Một số kim loại : Li+, Na+, Cr3+, Mn2+, Zn2+, Co2+, Sn2+, Cr3+, không có ảnh hưởng đến αAmylase Một đặc điểm cần lưu ý là hầu hết α-Amylase bền với tác động protease pepsin, trypsin, papain Thành phần amino acid α-Amylase nấm mốc Aspergillus sau ( g/100 g protein ): alamine = 6,8 ; glycine = 6,6 ; valine = 6,9 ; leucine = 8,3 ; Isoleucine = 5,2 ; prolin = 4,2 ; phenylalanine = 4,2 ; tyrosine = 9,5 ; trytophan = 4,0; xetin = 6,5 ; trionin = 10,7 ; cystein + cystine = 1,6 ; glutamic acid = 6,9 ; amide = 1,5 ( Akabori et amilose 1954 ) Không giống α-Amylase khác, Amylase Asp.orysee có chứa phần phi protein là polysaccharide Polyose này bao gồm mol maltose, mol glucose, mol hexosemin mol Enzyme ( Akabori et amilose, 1965 ) Vai trò polyose này chưa rõ, song biết nó không tham gia vào thành phần trung tâm hoạt động và nằm phía phân tử Enzyme -9– Nhóm Lớp 08DTP06 Enzyme Amylase α-Amylase nấm mốc công hạt tinh bột bị thương tổn Sản phẩm cuối thủy phân Amylase là glucose và maltose Đối với nấm sợi tỉ lệ là 1:3,79 ( Hanrahan, Caldwell, 1953 ) Fenikxova và Eromsina (1991) cho biết maltopentose và maltohexose bị thủy phân theo sơ đồ sau: G5 G4 + G1; G6  G2 + G4 hay 2G3 ( ) G5 + G1 ( ) α-Amylase nấm sợi khơng cơng liên kết α-1,6 glucoside amylopectin, nên thủy phân nó tạo thành dextrin tới hạn phân nhánh Đây là cấu trúc phân tử tinh bột Enzyme α-Amylase phân cắt tạo thành dextrin tới hạn phân nhánh Sản phẩm thủy phân cuối tinh bột dưới tác dụng Amylase nấm sợi chủ yếu là maltose, thứ đến là maltotriose Nồng độ α-Amylase VSV tương đối lớn có thể chuyển hóa 70 - 85% tinh bột thành đường lên men Còn α-Amylase nấm mốc mức độ đường hóa đến glucose và maltose có thể lên tới 84 - 87% Điều kiện hoạt động α-Amylase từ nguồn khác thường khơng giống pH tối thích cho hoạt động α-Amylase từ nấm sợi là 4,0 - 4,8 ( có thể hoạt động tốt vùng pH từ 4,5 - 5,8 ) Theo số liệu Liphis, pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa và đường hóa chế phẩm Amylase từ Asp.orysee vùng 5,6 - 6,2 Còn theo số liệu Fenixova pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa nó là 6,0 - 7,0 Độ bền đối với tác dụng acid khác khác α-Amylase Asp.orysee bền vững đối với acid tốt là α-Amylase malt và vi khuẩn Bac.subtilis Ở pH= 3,6 và 0oC, α-Amylase malt bị vô hoạt hoàn toàn sau 15 - 30 phút; α-Amylase vi khuẩn bị bất hoạt đến 50%, đó hoạt lực α-Amylase nấm sợi khơng giảm ( Fenilxova, Rmoshinoi 1989 ) Trong dung dịch α-Amylase nấm sợi bảo quản tốt pH= 5,0 - 10 – ... .5 B Tổng quan Enzyme Amylase I Phân loại .6 II Hệ Enzyme Amylase Enzyme α -Amylase Enzyme β -Amylase 11 Enzyme γ -Amylase 13 Oligo... quan Enzyme Amylase I Phân loại : Hiện nay, có sáu loại Enzyme Amylase xếp vào nhóm: Endoamylase ( Enzyme nội bào ) và Exoamylase ( Enzyme ngoại bào ) - Endoamylase : gồm có α -Amylase (EC... mạch acid amin tất Enzyme α -Amylase có cấu trúc bậc tương tự Cấu trúc không gian α-AmylaseAmylase b) Cơ chế tác dụng α-AmylaseAmylase: -7– Nhóm Lớp 08DTP06 Enzyme Amylase α -Amylase từ nguồn