Đang tải... (xem toàn văn)
Chitosan KLPT thấp và oligochitosan được chế tạo bằng phương pháp cắt mạch bức xạ chitosan dạng bột và dung dịch chitosan 3%. Kết quả đo KLPT bằng phương pháp sắc ký gen cho thấy khối lượng phân tử giảm khi tăng liều xạ. Đối với chitosan chiếu xạ dạng bột KLPT giảm từ 120.000 Da xuống 40.000 Da khi tăng liều xạ từ 0 kGy đến 50 kGy. Đối với chitosan dạng dung dịch KLPT giảm xuống còn 6100 Da tại liều xạ 20 kGy. Chitosan KLPT thấp và oligochitosan được bồ sung vào thức ăn cho cá rô phi trong vòng 45 ngày ở nồng độ 100 ppm rồi sau đó gây nhiễm bằng vi khuẩn Strep. Agalactidae để khảo sát hiệu ứng kích kháng bệnh. Kết quả cho thấy oligochitosan có hiệu ứng kích kháng bệnh tốt hơn chitosan KLPT thấp. Tỉ lệ sống sót (%) của cá rô phi được bổ sung vào thức ăn oligochitosan, chitosan KLPT thấp và mẫu đối chứng lần lượt là 73,33 ± 2,89, 63,33 ± 10,41 và 46,67 ± 10,00. Ảnh hưởng nồng độ oligochitosan tới khả năng kích kháng bệnh đã được khảo sát. Kết quả cho thấy oligochitosan ở nồng độ 100 ppm có khả năng kích kháng bệnh cao nhất so với oligochitosan ở nồng độ 50ppm và 150 ppm. Tỉ lệ sống sót (%) của cá rô phi được bổ sung vào thức ăn oligochitosan tại các nồng độ 50 ppm, 100ppm, 150 ppm và mẫu đối chứng lần lượt là 61,67±2,89, 76,67±2,89, 75,00±10,00 và 43,33±10,41.
1 NGHIÊN CỨU HIỆU ỨNG KÍCH KHÁNG BỆNH CỦA CHITOSAN CẮT MẠCH BẰNG PHƯƠNG PHÁP BỨC XẠ ĐỐI VỚI CÁ RÔ PHI NGUYỄN NGỌC DUY 1 , ĐẶNG VĂN PHÚ 1 , NGUYỄN QUỐC HIẾN 1 , LÊ THỊ BÌNH 2 1 Trung tâm Nghiên cứu và Triển khai Công nghệ Bức xạ, Viện NLNT Việt Nam 202A, đường 11, Phường Linh xuân, Quận Thủ đức, Tp. HCM 2 Bộ môn Sinh Học Thủy Sản, Trường Đại học Nông Lâm, Khu phố 6, Phường Linh trung, Quận Thủ đức Tp. HCM Email: ngocduy158@yahoo.com Tóm tắt: Chitosan KLPT thấp và oligochitosan được chế tạo bằng phương pháp cắt mạch bức xạ chitosan dạng bột và dung dịch chitosan 3%. Kết quả đo KLPT bằng phương pháp sắc ký gen cho thấy khối lượng phân tử giảm khi tăng liều xạ. Đối với chitosan chiếu xạ dạng bột KLPT giảm từ 120.000 Da xuống 40.000 Da khi tăng liều xạ từ 0 kGy đến 50 kGy. Đối với chitosan dạng dung dịch KLPT giảm xuống còn 6100 Da tại liều xạ 20 kGy. Chitosan KLPT thấp và oligochitosan được bồ sung vào thức ăn cho cá rô phi trong vòng 45 ngày ở nồng độ 100 ppm rồi sau đó gây nhiễm bằng vi khuẩn Strep. Agalactidae để khảo sát hiệu ứng kích kháng bệnh. Kết quả cho thấy oligochitosan có hiệu ứng kích kháng bệnh tốt hơn chitosan KLPT thấp. Tỉ lệ sống sót (%) của cá rô phi được bổ sung vào thức ăn oligochitosan, chitosan KLPT thấp và mẫu đối chứng lần lượt là 73,33 ± 2,89, 63,33 ± 10,41 và 46,67 ± 10,00. Ảnh hưởng nồng độ oligochitosan tới khả năng kích kháng bệnh đã được khảo sát. Kết quả cho thấy oligochitosan ở nồng độ 100 ppm có khả năng kích kháng bệnh cao nhất so với oligochitosan ở nồng độ 50ppm và 150 ppm. Tỉ lệ sống sót (%) của cá rô phi được bổ sung vào thức ăn oligochitosan tại các nồng độ 50 ppm, 100ppm, 150 ppm và mẫu đối chứng lần lượt là 61,67±2,89, 76,67±2,89, 75,00±10,00 và 43,33±10,41. Từ khóa: Oligochitosan, chitosan KLPT thấp, kích kháng bệnh, cá rô phi I. MỞ ÐẦU Trong hai thập niên qua, trên phạm vi toàn thế giới, nuôi trồng thuỷ sản có mức tăng sản lượng cao nhất trong các lĩnh vực sản xuất lương thực thực phẩm. Nuôi trồng thuỷ sản có tiềm năng phát triển nhằm đáp ứng các nhu cầu về sản phẩm thuỷ sản trên hầu hết các vùng của thế giới. Tuy nhiên, một trong những bất lợi trong nuôi trồng thuỷ sản là thiệt hại do dịch bệnh. Qua nhiều thập niên cho thấy bệnh dịch là nguyên nhân gây suy giảm về hiệu quả kinh tế trong nuôi thủy sản. Do vậy rất cần có chiến lược quản lý hiệu quả sức khỏe vật nuôi như chẩn đoán nhanh, điều trị phòng ngừa và hệ thống an ninh sinh học. Sử dụng các chế phẩm sinh học, hạn chế sử dụng kháng sinh để phòng và trị bệnh cho vật nuôi trong nuôi trồng thủy sản là những hướng nghiên cứu và ứng dụng đang được quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới. Một số chất như levamisole, β-glucan, peptidoglycan, chitin, chitosan cũng như một vài dẫn xuất khác có nguồn gốc từ thực vật và động vật đã được sử dụng để phòng và trị bệnh. Chitosan là một polysacarit mạch thẳng được cấu tạo từ các D- glucosamine liên kết theo kiểu β-(1→ 4)-2-acetamido-2-deoxy–D–glucose, là sản phẩm của quá trình deacetyl hóa chitin, chitosan và các dẫn xuất là các polyme phân hủy sinh học có những ưu điểm nổi bật như có khả năng kháng khuẩn, tương hợp sinh học, làm lành vết thương nên chúng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như trong y học dùng làm chất mang dược phẩm, enzym, màng phủ vết thương, vết bỏng làm keo xịt tóc, kem dưỡng da,[2] Trong lĩnh vực nông nghiệp, chitosan được ứng dụng làm chất bảo quản nông phẩm, 2 chất điều hòa sinh trưởng [2,3] Ngoài ra chitosan còn được ứng dụng trong những lĩnh vực khác như hấp thụ kim loại, xử lý nước thải [2] Trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản việc sử dụng chitosan và oligochitosan như một tác nhân phòng và trị bệnh cho vật nuôi đã được quan tâm nghiên và áp dụng ở nhiều nước trên thế giới có nghành nuôi trồng thủy sản phát triển như Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Nhật Bản, Na Uy… Kết quả nghiên cứu của A. Gopalakannan và cộng sự [1] cho thấy, khi bổ sung chitosan, chitin và levamisole vào thức ăn cho cá chép trong 45 ngày thì tỷ lệ sống sót của cá sau khi được gây nhiễm cao hơn đáng kể so với mẫu cá đối chứng. Tỷ lệ sống sót cao nhất ở mẫu cá được bổ sung chitosan lên tới 80%, sau đó là levamisole 66,7% và chitin là 40%. Nhiều kết quả nghiên cứu khác cũng chứng minh chitosan và oligochitosan không chỉ có tác dụng trị bệnh mà còn có tác dụng làm tăng cường sức đề kháng từ đó tăng cường hệ miễn dịch của vật nuôi [3, 4, 5, 6, 7]. II. THỰC NGHIỆM 1. Nguyên vật liệu hóa chất: Chitosan được mua từ Vũng Tàu có khối lượng phân tử Mw = 120.000 Da. Cá rô phi được mua từ trại cá giống Tân Vạn, Bình Dương. Chủng vi khuẩn Streptococus agalactidae được phân lập từ cá bệnh tại Đồng Tháp, được định danh và bảo quản tại Phòng Thí Nghiệm Bệnh Học Thủy Sản, Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Môi trường tăng sinh vi khuẩn: Nutrien Broth (NB), Ấn Độ. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: Nutrien Agar (NA). Ấn Độ. Hóa chất nhuộm Gram: Crystal violet, Fuchsin, Lugol, dung dịch tẩy màu 2. Phương pháp Chế tạo chitosan KLPT thấp: Chế tạo chitosan KLPT thấp: chitosan dạng bột được đóng gói trong túi PE chiếu xạ tại các liều, 10, 20, 30, 50 kGy. Chế tạo dung dịch oligochitosan: Chitosan được hòa tan trong axit lactic 1,5% để được nồng độ 3% sau đó được cho vào bình thủy tinh có nút vặn thêm H 2 O 2 ở những nồng độ khác nhau chiếu xạ tại các liều 4, 8, 12, 16, 20 kGy Xác định KLPT của chitosan KLPT thấp và oligochitosan: KLPT M w được đo trên máy HP-GPC 1100, detector RI GI362A, hãng Agilent dùng cột Ultrahydrgel 250 và 500, hãng Water và chất chuẩn là pullulan có KLPT 780 – 380.000Da. Dung môi sử dụng là hỗn hợp 0,25M CH 3 COOH/ 0,25M CH 3 COONa với tốc độ dòng là 1ml/phút. Xác định độ deacetyl và cấu trúc của chitosan cắt mạch bức xạ: Ðộ đề acetyl được xác định bằng phổ hồng ngoại (IR) với kỹ thuật ép viên KBr. Độ đề acetyl được tính theo công thức [8]: DDA = 100 – ([ A 1320 /A 1420 – 0,3822]/0,03133). Trong đó A 1320 và A 1420 là mật độ quang tương ứng tại các đỉnh hấp phụ 1320cm -1 và 1420 cm -1 . Chiều cao của đỉnh hấp phụ được xác định bằng phần mềm Photoshop CS3 Phương pháp kiểm tra kí sinh trùng: Cá được làm chết bằng cách hủy não và đặt trong khay mổ sạch. Quan sát hình dạng ngoài của cá ở da, mang, gốc vây dưới kính giải phẫu và kính hiển vi. Phương pháp chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn: Vi khuẩn từ ống giữ giống được cấy ria trên các đĩa môi trường thạch NA, ủ ở 30 o C trong 24 giờ. Chọn khuẩn lạc đặc trưng, đứng riêng lẻ, mọc trên đường cấy. Định danh vi khuẩn bằng test kit Api 20 Strep, đồng thời cấy chuyền sang đĩa NA khác, ủ 30 o C trong 24 giờ. Nếu kết quả định danh là vi khuẩn Strep. agalactidae, chọn trên đĩa NA (đã ủ ở 30 o C trong 24 giờ) các khuẩn lạc đặc trưng, đứng riêng 3 lẻ và mọc trên đường cấy để pha huyền dịch vi khuẩn. Hòa các khuẩn lạc đã chọn ở mỗi chủng vào ống nghiệm có nước muối sinh lý vô trùng, đo OD của huyền dịch và sử dụng huyền dịch này để ngâm cho cá. Phương pháp gây nhiễm thực nghiệm: Gây nhiễm bằng phương pháp ngâm, thời gian ngâm cá trong 60 phút. Thể tích nước ngâm cá là 5 lít. Trong quá trình gây nhiễm có sử dụng hệ thống sục khí. Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn: Sau khi đo huyền dịch vi khuẩn, tiến hành pha loãng huyền dịch với độ pha loãng từ 10 -1 đến 10 -8 . Từ mỗi độ pha loãng hút 0,1 ml dung dịch nhỏ lên đĩa thạch NA (mỗi độ pha loãng lặp lại 2 lần), dùng que cấy trang, trang đều dung dịch trên thạch, để khô tự nhiên và đem ủ ở 30 o C trong 24 giờ. Đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch tại mỗi nồng độ pha loãng (chỉ đếm ở các đĩa có số khuẩn lạc từ 25 - 250), dựa vào công thức tính và liều dung dịch vi khuẩn tiêm cho cá ta suy ra mật độ vi khuẩn tiêm vào mỗi cá. - Công thức tính: A = X*1/K*V - Trong đó: A: số khuẩn lạc mọc trên một đơn vị ml. X: số khuẩn lạc trung bình mọc trên đĩa môi trường ở một hệ số pha loãng. V: thể tích (ml) mẫu dùng để cấy K: hệ số pha loãng. Phương pháp theo dõi cá sau khi gây nhiễm. Cá sau khi gây nhiễm theo dõi trong 21 ngày. Hàng ngày, tiến hành đo nhiệt độ 2 lần/ngày (lúc 7 giờ 30 phút và 15 giờ), kiểm tra DO, pH, NH 3 đo 1 lần/ngày. Thay nước hàng ngày với 10% thể tích bể thí nghiệm. Quan sát biểu hiện của cá, ghi nhận các biểu hiện bất thường, số liệu cá chết ở mỗi bể. Khi cá chết, ghi nhận biểu hiện bên ngoài, giải phẫu ghi nhận các biểu hiện bên trong. Đối với cá mới chết, cấy phân lập vi khuẩn từ gan, thận, lách. Số cá còn sống sau 14 ngày gây bệnh thực nghiệm được ghi nhận biểu hiện bên ngoài, bên trong và cấy phân lập vi khuẩn từ gan, thận, lách. Phương pháp giải phẫu cá: Khử trùng bề mặt cơ thể cá bằng cồn 70% tại những vị trí cần giải phẫu. Giải phẫu xoang bụng trái của cá bằng 3 đường cắt: Đường xuất phát từ trước lỗ hậu môn cắt song song với đường bụng và đường xuất phát từ trước lỗ hậu môn song song với đường bên. Đường thứ 3 song song rìa nắp mang và cắt 2 đường bên. Sau khi cắt xong tách rời 1 bên xoang bụng cho thấy nội tạng bên trong. Dùng 1 miếng bông gòn đã tẩm cồn lau sạch phần máu và dịch xoang bụng. Quan sát và ghi nhận biểu hiện của các nội quan. III. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 1. Khối lượng phân tử của chitosan KLPT thấp và oligochitosan theo liều xạ 1.1. Khối lượng phân tử của chitosan KLPT thấp theo liều chiếu xạ. 4 Hình 1. Sự suy giảm KLPT của chitosan chiếu xạ tia gamma Co-60 theo liều xạ Từ kết quả hình 1 thấy rằng chitosan KLPT thấp có thể dễ dàng chế tạo thông qua chiếu xạ chitosan KLPT cao dạng bột hoặc là dạng vảy. KLPT của chitosan giảm từ 120.699 Da xuống còn 40.747 Da khi tăng liều xạ từ 0-50 kGy. Bảng 1: Mw, Mn và chỉ số đa phân tán (PI = M w /M n ) của chitosan KLPT thấp Liều xạ (kGy) 0 10 20 30 50 Mw 120.669 112.050 85.853 63.548 40.747 Mn 56.377 54.598 44.027 36.732 25.153 PI 2,14 2,05 1,95 1,73 1,62 Kết quả PI ở bảng 1 nhận thấy rằng khi tăng liều xạ PI giảm từ 2,14 xuống giá trị 1,62 tại liều 50 kGy. Kết quả này chỉ ra rằng KLPT M w của chitosan càng nhỏ thì độ phân tán của chitosan càng hẹp. Kết quả này cũng khá phù hợp với công trình của Czechowska-Biskup [8] từ đó có thể kết luận khoảng liều xạ thích hợp để chế tạo chitosan KLPT thấp là 30 kGy đến 50 kGy với chitosan có KLPT ban đầu khoảng 120.000 Da. Hình 2. Phổ IR của chitosan ban đầu có Mw = 120.669 (a); chitosan-20kGy có M w = 63.548 (b); và chitosan-50kGy có M w = 40.747(c) Li ều xạ (kGy) Mw. 10 5 (Da) 5 Bảng 2. Giá trị DD của chitosan ban đầu và chitosan chiếu xạ từ 10-50 kGy Liều xạ (kGy) 0 10 20 30 50 DD,% 84,4 1,2 83,5 1,8 82,7 2,2 82,1 1,5 80,8 2,6 Kết quả về DD được đưa ra trong bảng 2 và phổ IR của các mẫu chitosan ban đầu và mẫu chitosan chiếu xạ tại các liều 20 và 50 kGy cho thấy chitosan chiếu xạ có hầu hết tất cả các đỉnh tương tự như chitosan ban đầu, điều này chứng tỏ cấu trúc cơ bản của chitosan chiếu xạ dạng bột không thay đổi so với chitosan ban đầu trong quá trình chiếu xạ và DD của chitosan chiếu xạ và chitosan ban đầu có sự khác biệt không đáng kể 1.2. Khối lượng phân tử oligochitosan theo liều xạ Hình 3. Sự thay đổi giảm KLPT của chitosan theo thời gian xử lý với H 2 O 2 , tia và H 2 O 2 /tia (suất liều: 1,14 kGy/h) Bảng 3 trình bày kết quả về hiệu ứng đồng vận cắt mạch chitosan trong dung dịch bằng tia γ và H 2 O 2 [9]. Kết quả cho thấy hiệu ứng đồng vận đạt hiệu quả cao trong khoảng liều xạ thấp. Cụ thể suy giảm KLPT là 58,4; 34,5; 13,0 và 0,2% tương ứng với liều xạ 4; 8; 12 và 16 kGy. Bảng 3. Suy giảm KLPT khi cắt mạch chitosan bằng hydroperoxit, tia γ và hiệu ứng đồng vận hydroperoxit và tia γ Ký hiệu Suy giảm KLPT, % = 100 × (M w0 – M w )/M w0 4 kGy (3 giờ) 8 kGy (6 giờ) 12 kGy (9 giờ) 16 kGy (12 gi ờ) A (1% H 2 O 2 ) * 10,4 14,5 21,3 23,5 B (tia γ) ** 21,7 44,8 61,9 73,4 C (A & B) 90,5 93,8 96,2 97,1 Hiệu ứng đồng vận D, % D = C – (A+B) 58,4 34,5 13,0 0,2 * Thời gian (giờ) xử lý với H 2 O 2 ** Thời gian (giờ) và/hoặc là liều xạ (kGy) xử lý với bức xạ tia γ 6 Cơ chế cắt mạch chitosan đã được Ulanski & von Sonntag (2000) nghiên cứu khá chi tiết [10]. Các tác giả đã chỉ ra rằng gốc hydroxyl tạo ra trong quá trình chiếu xạ dung dịch chitosan là tác nhân chính gây ra sự cắt mạch chitosan (Hình 1.4). O C H 2 O H O O H N H 3 5 O C H 2 O H O O H N H 3 6 O C H 2 O H O O H N H 3 O C H 2 O H O O H N H 3 2 O C H 2 O H O O H N H 3 4 O C H 2 O H O O H N H 3 3 1 O C H 2 O H O O H N H 3 O H H 2 O Hình 4. Sơ đồ cơ chế bắt hydro của gốc tự do hydroxyl [12] Từ kết quả hình 3 thấy rằng xử lý kết hợp H 2 O 2 và tia đã làm gia tăng hiệu ứng cắt mạch đối với chitosan và nồng độ H 2 O 2 càng cao thì mức độ suy giảm M w càng lớn tại cùng thời gian chiếu xạ (liều xạ). Nguyên nhân là do sự tạo thành gốc hydroxyl ( . OH) khi phân ly bức xạ nước và H 2 O 2 như sau [11]: H 2 O e aq , H . , . OH, H 2 O 2 , H 2 , H 3 O + , (7) H 2 O 2 2 . OH (8) Trong quá trình chiếu xạ e aq and H . Có thể phản ứng với H 2 O 2 như sau: e aq + H 2 O 2 . OH + OH (9) H . + H 2 O 2 H 2 O + . OH (10) Hằng số tốc độ của phản ứng (8) là k = 1,1 10 10 L mol 1 s 1 và phản ứng (9) là k = 9 10 7 L mol 1 s 1 (Buxton et al., 1988) [44]. Do vậy, ngoài sự tạo thành gốc . OH do thủy phân bức xạ nước, gốc . OH còn được tạo ra qua các phản ứng (7), (8) và (9) trong quá trình chiếu xạ. Như vậy chiếu xạ dung dịch chitosan với sự có mặt của H 2 O 2 là rất hiệu quả để cắt mạch chitosan. Phổ hồng ngoại (IR) của chitosan và oligochitosan từ dung dịch 3% chitosan chứa 0,25- 1% H 2 O 2 chiếu xạ 8 kGy được biểu thị trên hình 5. Hình 5. Phổ IR của chitosan ban đầu (a) và oligochitosans với M w : 9.700 (b); 8.300 (c) và 5.400 (d) tia γ tia γ Abs 7 Kết quả về DD được đưa ra trong hình 5 Phổ IR của các mẫu oligochitosan có hầu hết tất cả các đỉnh tương tự như chitosan ban đầu, điều này chứng tỏ cấu trúc cơ bản của oligochitosan có M w từ 5.000 đến 10.000 vẫn không thay đổi so với chitosan. Tuy nhiên, DD của oligochitosan giảm từ 84% (chitosan ban đầu) xuống còn 77,5-74,4% đối với oligochitosan. Như vậy quá trình cắt mạch chitosan đã kèm theo quá trình suy giảm nhóm – NH 2 . Nồng độ H 2 O 2 càng cao thì sự suy giảm hàm lượng nhóm –NH 2 của sản phẩm oligochitosan càng nhiều. Do vậy, sự lựa chọn tối ưu nồng độ H 2 O 2 và liều xạ là cần thiết để chế tạo oligochitosan bằng phương pháp chiếu xạ tia dung dịch chitosan chứa H 2 O 2 nhằm bảo vệ nhóm –NH 2 . Bảng 4. Giá trị DD của chitosan và oligochitosan từ dung dịch 3% chitosan với các nồng độ H 2 O 2 khác nhau chiếu xạ liều 8 kGy Mẫu Chitosan Oligochitosan 0,25% H 2 O 2 0,5% H 2 O 2 1,0% H 2 O 2 DD,% 84,4 1,2 77,5 2,8 76,4 1,9 74,4 2,2 2. Kết quả khảo sát hiệu ứng kháng bệnh của cá rô phi. 2.1. Kết quả kiểm tra cá trước khi gây nhiễm Kết quả kiểm tra ký sinh trùng trên cá trước khi thí nghiệm cho thấy cá không bị nhiễm ký sinh trùng. Kết quả kiểm tra vi khuẩn trên môi trường BHIA thì không có khuẩn lạc nào xuất hiện trên đĩa cấy phân lập vi khuẩn ở gan, thận, lách của cá trước khi thí nghiệm. Như vậy nguồn cá chuẩn bị thí nghiệm hoàn toàn khỏe mạnh. 2.2. Nồng độ vi khuẩn gây nhiễm Sau khi đếm số lượng khuẩn lạc và dựa vào công thức tính chúng tôi xác định được nồng độ vi khuẩn gây nhiễm cho cá là 8,47x10 6 cfu/ml. 2.3. Kết quả phân lập vi khuẩn Cá chết ở các nghiệm thức sẽ được phân lập gan, thận lách trên môi trường NA để xác định vi khuẩn gây bệnh. - Nghiệm thức ĐC1: không có sự hiện diện của vi khuẩn trên đĩa cấy phân lập. Như vậy, cá chết ở nghiệm thức này không do vi khuẩn gây nhiễm. - Nghiệm thức được gây nhiễm (ĐC2, NT1, NT2, NT3 ): có xuất hiện khuẩn lạc tròn, trắng đục mọc trên đường cấy của mẫu cấy phân lập gan, thận, lách cá chết. Tiếp tục chọn các khuẩn lạc nghi ngờ để cấy thuần và định danh vi khuẩn. Hình 6: Đĩa cấy thuần vi khuẩn phân lập được từ cá bệnh 8 2.4. Kết quả định danh Kết quả định danh vi khuẩn trước khi gây nhiễm: Vi khuẩn bắt màu tím, hình cầu, vi khuẩn có thể đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi trên tiêu bản nhuộm Gram; vi khuẩn không di động trên môi trường thạch bán lỏng, âm tính trong thử nghiệm với oxydase và catalase; đồng thời thử nghiệm với test kit Api 20 Strep. Kết quả khẳng định: vi khuẩn trước gây nhiễm là S. agalactidae. Vi khuẩn phân lập được từ cá chết sẽ được chọn lọc để cấy thuần, chọn vi khuẩn từ đĩa cấy thuần để định danh bằng các thử nghiệm như nhuộm Gram, oxidase, catalase và kiểm tra bằng test Api 20 Strep. Kết quả thu được vi khuẩn phân lập được từ cá bệnh là S. agalactidae. Như vậy, có thể kết luận vi khuẩn gây bệnh làm cho cá chết cũng chính là vi khuẩn gây nhiễm thực nghiệm: S. agalactidae. Hình 7: Mẫu nhuộm Gram vi khuẩn phân lập từ cá chết 2.5. Kết quả hiệu ứng kháng bệnh của chitosan KLPT thấp và oligochitoan Sau 21 ngày gây bệnh thực nghiệm, tỉ lệ cá chết ở các nghiệm thức được ghi nhận lại: Nghiệm thức ĐC 1 (đối chứng-không bổ sung Chitosan-không ngâm vi khuẩn) cá chết với tỷ lệ chết trung bình là 10%. Mẫu cấy phân lập cá chết không thấy có sự hiện diện của vi khuẩn gây nhiễm thực nghiệm. Như vậy, cá chết ở nghiệm thức này có thể do sức khỏe cá yếu. Bảng 5. Tỷ lệ chết của cá rô phi sau 21 ngày gây nhiễm với vi khuẩn S. Agalactidae của các nghiệm thức Nghiệm thức ĐC1 ĐC2 NT1 NT2 Tỷ lệ chết (%) 10,00 ± 5,00 a 53,33 ± 10,41 cd 36,67 ± 10,41 bc 26,67 ± 2,89 ab Ghi chú: Giá trị trung bình ± SD Giá trị cùng hàng giống nhau ký tự thì khác nhau không ý nghĩa thống kê (P<0,05) ĐC 1: (không bổ sung chitosan) ngâm bằng nước muối sinh lý vô trùng ĐC2: (không bổ sung chitosan) ngâm vi khuẩn S. agalactidae NT1: (bổ sung 100 ppm chitosan KLPT thấp) ngâm vi khuẩn S. agalactidae NT2: (bổ sung 100 ppm oligochitosan) ngâm vi khuẩn S. agalactidae Từ kết quả bảng 5 cho thấy oligochitosan có hiệu ứng kích kháng bệnh tốt hơn chitosan KLPT thấp điều này có thể được giải thích là do oligochitosan có KLPT thấp, mạch phân tử ngắn, kích thước nhỏ nên cá dễ hấp thu hơn là chitosan KLPT thấp. Kết quả là cùng nồng độ 100 ppm tỷ lệ chết của cá được ăn thức ăn có bổ sung oligochitosan (26,67 ± 2,89) thấp hơn so với cá được ăn thức ăn có bổ sung chitosan KLPT thấp (36,67 ± 10,41). Xu hướng tương tự cũng nhận được bởi A. Gopalakannan và cộng sự [1] khi bổ sung chitosan, chitin và levamisole vào thức ăn cho cá chép trong 45 ngày thì tỷ lệ sống sót của cá sau khi được gây 9 nhiễm cao hơn đáng kể so với mẫu cá đối chứng. Tỷ lệ sống sót cao nhất ở mẫu cá được bổ sung chitosan lên tới 80%, sau đó là levamisole 66,7% và chitin là 40%. 2.6. Ảnh hưởng nồng độ oligochitosan đến khả năng kháng bệnh của cá rô phi Bảng 6. Tỷ lệ chết của cá rô phi sau 21 ngày gây nhiễm với vi khuẩn S. agalactidae của các nghiệm thức Nghiệm thức ĐC1 ĐC2 NT1 NT2 NT 3 Tỷ lệ chết (%) 11,67 ± 2,89 a 56,67 ± 10,41 d 56,67 ± 10,41 d 23,33 ± 2,89 ab 25,00 ± 10,00 ab Ghi chú: Giá trị trung bình ± SD Giá trị cùng hàng giống nhau ký tự thì khác nhau không ý nghĩa thống kê (P<0,05) Trong đó: ĐC 1 (không bổ sung chitosan) ngâm bằng nước muối sinh lý vô trùng ĐC 2 (không bổ sung chitosan) ngâm vi khuẩn Strep. agalactidae NT 1 ( bổ sung 50 ppm oligochitosan) ngâm vi khuẩn Strep. agalactidae NT2 (bổ sung 100 ppm oligochitosan) ngâm vi khuẩn Strep. agalactidae NT3 (bổ sung 150 ppm oligochitosan) ngâm vi khuẩn Strep. agalactidae Bảng kết quả về tỷ lệ chết của cá khi được ăn thức ăn có bổ sung oligochitosan ở các nồng độ khác nhau cho thấy tỉ lệ cá chết giảm từ 38,33% ± 2,89 xuống 23,33 ± 2,89 khi tăng nồng độ oligochitsan từ 50 lên 100 ppm, tuy nhiên khi tăng nồng độ oligochitosan lên 150 ppm thì tỉ lệ cá chết thay đổi không đáng kể. Từ đó có thể kết luận nồng độ tối ưu để sử dụng oligochitosan như là chất kích kháng bệnh là 100 ppm ở các nồng độ thấp hơn (50 ppm) hoặc cao hơn (150 ppm) thì hiệu quả kích kháng bệnh đều thấp hơn. IV. KẾT LUẬN Chitosan KLPT thấp và oligochitosan đã được chế tạo bằng phương pháp chiếu xạ gamma Co-60. Khoảng liều chiếu xạ từ 30 đến 50 kGy là khoảng liều thích hợp để điều chế chitosan KLPT thấp (40.000 – 50.000) từ chitosan có KLPT ban đầu khoảng 120.000 và liều xạ 12kGy là liều tối ưu để điều chế dung dịch oligochitosan có KLPT trong khoảng 5.000- 7.000 (KLPT ban đầu khoảng 120.000) chứa 0,5%H 2 O 2 . Kết quả khảo sát hiệu ứng kháng bệnh của chitosan KLPT thấp và oligochitosan đối với cá rô phi cho thấy oligochitosan có khả năng kháng bệnh tốt hơn so với chitosan KLPT thấp ở cùng một nồng độ. Nồng độ tối ưu của oligochitosan sử dụng làm chất kháng bệnh cho cá rô phi là 100 ppm 10 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] A. Gopalakannan et al., Immunomodulatory effect of dietary intake of chitin, chitosan and levamisole on the immune system of Cyprinus carpio and control of Aeromonas hydrophila infection in ponds, Aquaculture, 255, pp.179–187 (2006). [2] K.V.H. Prashanth et al., Chitin/chitosan modification and their unlimited application potential – an overview, Trend in Food Science & Technology,18, pp.117–131 (2007). [3] S. Hirano et al., Chitosan as an ingredient for domestic animal feeds, J. Agric, Food Chem, 38, pp.1214–1217 (1980). [4] R. Huang et al., Dietary oligochitosan supplementation enhances immune status of broiler, Journal of the Science of Food and Agriculture, 87, pp.153–159 (2007). [5] S.H. Wang, J.C. Chen, The protective effect of chititn and chitosan against vibrio alginolyticus in white shrimp litopenaeus vannamei, Fish & Shellfish Immunology, 19, pp.191–204 (2005). [6] S.H. Cha et al., Effect of chitosan – coated diet on improving water quality and innate immunity in olive flounder, Paralichthys olivaceus, Aquaculture, 278, pp.110–118 (2008). [7] Y. Okamoto et al., Effect of chitin/chitosan and their oligomers/monomers on migration of fibroblasts and vascular endothelium, Biomaterials, 23, pp.1975–1979 (2002). [8] Czechowska-Biskup, R et al., Radiation-induce and sonochemical degradation of chitosan as a way to increase its fat-binding capacity. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B 236, pp.383-390, 2005. [9] Hien, N.Q et al., Degradation of chitosan in solution by gamma irradiation in the presence of hydrogen peroxide. Carbohydr. Polym. 87, pp.935-938, 2012. [10] Ulanski, P et al., OH-radical-induced chain scission of chitosan in the absence and presence of dioxygen. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, pp.2022-2028, 2000. [11] Makuuchi, K et al., Critical review of radiation processing of hydrogel and polysaccharide. Radiat. Phys. Chem. 79, pp.267-271, 2010. STUDY ON EFFECT OF IMMUNE RESPONSE OF GAMMA-RAY IRRADIATED CHITOSAN ON TILAPIA Abstract: Low molecular weight chitosan (LMWC) powder and oligochitosan solution were prepared by -irradiation method. The efficiency of the degradation process was demonstrated by gel permeation chromatography (GPC) analysis of the average molecular weight of degraded chitosan. Results showed that the molecular weights decreased with increasing doses. For LMWC molecular weight reduces from 120,000 Da to 40,000 Da when dose raises from 0 kGy to 50 kGy and oligochitosan reduces to 6100 Da at 20k Gy. Tilapia fish, which was fed with LMWC and oligochitosan 100ppm for 45 days, was challenged with Strep. Agalactidae bacteria to investigate immune response. The results also exhibited that oligochitosan has effect of immune response higher than LMWC. The effect of various concentrations (50 ppm, 100 ppm, 150 ppm) was investigated. Results showed that oligochitosan 100 ppm shows survival rate the highgest. Keywords: Low molecular weight chitosan, oligochitosan, immune response, gamma irradiation. . by gamma irradiation in the presence of hydrogen peroxide. Carbohydr. Polym. 87, pp.935-938, 2012 . [10] Ulanski, P et al., OH-radical-induced chain scission of chitosan in the absence and presence. review of radiation processing of hydrogel and polysaccharide. Radiat. Phys. Chem. 79, pp.267-271, 2010 . STUDY ON EFFECT OF IMMUNE RESPONSE OF GAMMA-RAY IRRADIATED CHITOSAN ON TILAPIA Abstract: