ỦY BAN NHÂN DÂN TP. HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH ĐOÀN TP. HỒ CHÍ MINH B B Á Á O O C C Á Á O O N N G G H H I I Ệ Ệ M M T T H H U U KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN, CHỐNG OXY HÓA VÀ KHÁNG VIÊM CỦA CÂY TỨ BẠCH LONG (BLEPHARIS MADERASPATENSIS (L.) ROTH) CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG ThS. Văn Đức Thịnh PGS. TS. Trần Hùng CƠ QUAN QUẢN LÝ CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) (Ký tên/đóng dấu xác nhận) THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 6/2014 VII DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT THUẬT NGỮ TIẾNG VIẾT AREC Ampicillin- resistant Escherichia. coli C 13 -NMR Phổ cộng hưởng từ carbon DMSO Dimethyl sulphoxid DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl EA Ethyl acetat EDTA Ethylendiamin tetraacetic acid EtOH Ethanol H 1 -NMR Phổ cộng hưởng từ proton IR Phổ hồng ngoại LB Lauria broth MeOH Methanol MRSA Methicillin- resistant Staphylococcus aureus MSSA Methicillin- sensitive Staphylococcus aureus NSAIDs Non-steroidal anti-inflammatorial drugs PA Pseudomonas aeruginosa SDA/B Sabouraud dextrose agar/broth TBL Tứ Bạch Long TM Trychophyton mentagrophytes TSA/B Trypticase soy agar/broth UV Phổ tử ngoại DANH MỤC BẢNG SỐ TÊN BẢNG SỐ LIỆU TRANG 3.1 Tóm tắt phản ứng định tính hóa học cao phân đoạn 29 3.2 Kết quả độ ẩm bột dược liệu 31 3.3 Kết quả độ tro dược liệu 32 3.4 Kết quả độ trong không tan trong acid 32 3.5 Kết quả phân tích sơ bộ hóa thực vật trên nguyên liệu của cây Tứ Bạch Long 33 3.6 Hiệu suất chiết cao tổng nước bằng phương pháp siêu âm 35 3.7 Hiệu suất chiết cao tổng cồn bằng phương pháp ngấm kiệt 36 3.8 Hiệu suất chiết các cao phân đoạn 37 3.9 Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học trên các phân đoạn cao 38 3.10 Các nhóm chất hiện diện trong các phân đoạn dịch chiết 39 4.1 Kết quả đường kính kháng khuẩn (mm) trên 2 cao tổng 51 4.2 Kết quả đường kính kháng khuẩn (mm) trên 5 phân đoạn 52 4.3 Kết quả khảo sát MIC của cao chloroform 53 4.4 Kết quả khảo sát MIC của cao ethyl acetat 54 4.5 Kết quả khảo sát MIC của tetracyclin trên các chủng vi khuẩn 54 4.6 Kết quả khảo sát MIC của clotrimazol trên C. albicans 54 5.1 Quy trình khảo sát năng lực khử 58 5.2 Quy trình khảo sát hoạt tính quét gốc tự do DPPH 59 5.3 Quy trình khảo sát khả năng quét gốc hydroxyl tự do 61 5.4 Năng lực khử của cao tổng và cao chiết Tứ Bạch Long 62 5.5 Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao cồn tổng 65 5.6 Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao nước tổng 66 5.7 Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao phân đoạn ether 67 dầu 5.8 Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao phân đoạn chloroform 68 5.9 Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao phân đoạn ethyl acetat 69 5.10 Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao phân đoạn n- buthanol 70 5.11 Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao phân đoạn nước còn lại 71 5.12 Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của vitamin C tinh khiết 72 5.13 Giá trị IC 50 về khả năng quét DPPH 73 5.14 Khả năng kháng gốc hydroxyl tự do của Tứ Bạch Long 76 6.1 Quy trình khảo sát khả năng ức chế biến tính albumin 80 6.2 Khả năng ức chế biến tính albumin của các dạng cao chiết từ cây Tứ Bạch Long 82 6.3 IC 20 khả năng ức chế biến tính albumin của cây Tứ Bạch Long 86 7.1 Các thông số thực hiện phương pháp sắc ký nhanh – cột khô 90 7.2 Các thông số thực hiện phương pháp cột cổ điển 91 7.3 Các phân đoạn thu được từ sắc ký nhanh – cột khô 93 7.4 Bảng nhận xét SKLM các phân đoạn thu được từ phương pháp sắc ký nhanh – cột khô 95 7.5 Các phân đoạn thu được từ sắc ký cột cổ điển 97 7.6 Bảng nhận xét kết quả SKLM các phân đoạn thu được từ sắc ký cột cổ điển 98 DANH MỤC ĐỒ THỊ SỐ TÊN ĐỒ THỊ TRANG 5.1 Năng lực khử cao tổng và cao chiết Tứ Bạch Long 62 5.2 Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao cồn tổng 65 5.3 Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao nước tổng 66 5.4 Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao phân đoạn ether dầu 67 5.5 Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao phân đoạn chloroform 68 5.6 Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao phân đoạn ethyl acetat 69 5.7 Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao phân đoạn n - buthanol 70 5.8 Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao phân đoạn nước còn lại 71 5.9 Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của vitamin C tinh khiết 72 5.10 Giá trị IC 50 về khả năng quét DPPH 73 5.11 Khả năng kháng gốc hydroxyl tự do của Tứ Bạch Long 77 6.1 Khả năng ức chế biến tính albumin của các dạng cao chiết từ cây Tứ Bạch Long 83 6.2 Khả năng ức chế biến tính albumin của Tứ Bạch Long ở nồ độ thấp (<100µg/ml) 84 6.3 IC 20 khả năng ức chế biến tính albumin của cây Tứ Bạch Long 86 DANH MỤC HÌNH ẢNH SỐ TÊN HÌNH ẢNH TRANG 1.1. Cây Tứ Bạch Long ở Bắc Bình – Bình Thuận 4 1.2. Cây Tứ Bạch Long ở Tháp Chàm – Phan Rang – Ninh Thuận 4 2.1 Một đoạn cây Tứ Bạch Long 10 2.2 Cấu tạo vi phẫu rễ Tứ Bạch Long 12 2.3 Cấu tạo vi phẫu thân Tứ Bạch Long 14 2.4 Cấu tạo vi phẫu lá Tứ Bạch Long 17 2.5 Kết quả soi bột dược liệu Tứ Bạch Long 20 3.1 Chiết xuất cao tổng cồn và các cao phân đoạn từ bột cây Tứ Bạch Long 28 3.2 Sắc đồ hệ chloroform – ethyl acetat (7:3) 41 3.3 Sắc đồ hệ n-Buthanol - a. acetic - nước (7:1:2) 42 3.4 Sắc đồ hệ n-Buthanol – a. acetic – nước (4:1:5) 43 3.5 Sắc đồ hệ ethyl acetat – methanol – nước (100:17:13) 44 3.6 Sắc đồ hệ ethyl acetat – a. acetic – a. formic – nước (100:11:11:27) 46 7.1 Quy trình tổng quát phân lập hợp chất quan tâm từ Tứ Bạch Long 89 7.2 Hình SKLM các phân đoạn thu được từ sắc ký nhanh – cột khô chạy hệ ethyl acetat – methanol – nước (100:17:13) 94 7.3 Hình SKLM của các phân đoạn thu được từ sắc ký nhanh – cột khô với dung môi methanol chạy hệ ethyl acetat – methanol – nước (100:17:13) 94 7.4 Hình SKLM các phân đoạn thu được từ sắc ký cột cổ điển 97 7.5 Phân đoạn A7 khai triển SKLM hệ chloroform – 99 methanol (8:2) 7.6 Các bước phân lập chất 1 và chất 2 100 7.7 SKLM chất 1 hệ ethyl acetat – methanol – nước (100:17:13) 100 MỤC LỤC Trang MỤC LỤC TÓM TẮT / ABSTRACT DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ẢNH DANH MỤC ĐỒ THỊ PHẦN MỞ ĐẦU 1 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1 Giới thiệu chung về Tứ Bạch Long 3 1.1.1 Danh pháp và phân loại 3 1.1.2 Hình thái học 3 1.1.3 Sinh thái học và phân bố 4 1.1.4 Thành phần hóa học 4 1.1.5 Công dụng 5 1.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng cây Tứ Bạch Long 5 1.2.1 Thế giới 5 1.2.2 Trong nước 8 Chương 2: KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC CỦA TBL 9 2.1 Phương pháp nghiên cứu thực vật học 9 2.1.1 Khảo sát đặc điểm hình thái 9 2.1.2 Khảo sát đặc điểm vi học 9 2.1.2.1 Vi phẫu 9 2.1.2.2 Bột dược liệu 9 2.2 Kết quả nghiên cứu thực vật học 10 2.2.1 Khảo sát về đặc điểm hình thái 10 2.2.2 Khảo sát đặc điểm vi học 11 2.2.2.1 Vi phẫu 11 2.2.2.2 Bột dược liệu 18 Chương 3: KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA TBL 21 3.1 Phương pháp nghiên cứu hóa học 21 3.1.1 Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu 21 3.1.1.1 Xác định độ ẩm: 21 3.1.1.2 Xác định độ tro trong dược liệu 21 3.1.2 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật 23 3.1.2.1 Chuẩn bị dịch chiết 23 3.1.2.2 Các phản ứng hóa học khảo sát 24 3.1.3 Chiết xuất dược liệu 27 3.1.3.1 Chiết cao toàn phần từ cây Tứ Bạch Long 27 3.1.3.2 Tách phân đoạn cao toàn phần 28 3.1.4 Phân tích định tính thành phần hóa học các phân đoạn dịch chiết 28 3.1.5 Phương pháp sắc ký lớp mỏng 30 3.2 Kết quả nghiên cứu hóa học 31 3.2.1 Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu 31 3.2.1.1 Độ ẩm bột dược liệu 31 3.2.1.2 Độ tro dược liệu 31 3.2.2 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật 32 3.2.3 Chiết xuất dược liệu 35 3.2.3.1 Chiết xuất các dạng cao tổng 35 3.2.3.2 Chiết xuất các phân đoạn dịch chiết 36 3.2.4 Phân tích định tính thành phần hóa học các phân đoạn dịch chiết 37 3.2.5 Khảo sát SKLM các phân đoạn dịch chiết 40 Chương 4: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA TBL 49 4.1 Phương pháp khảo sát hoạt tính kháng khuẩn 49 4.1.1 Định tính khả năng kháng khuẩn của cao chiết bằng phương pháp khuếch tán đĩa 49 4.1.2 Định lượng khả năng kháng khuẩn của cao chiết bằng phương pháp MIC 50 4.2 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn 50 4.2.1 Khảo sát khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa 50 4.2.2 Khảo sát khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp MIC 53 Chương 5: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA CỦA TBL 57 5.1 Phương pháp khảo sát hoạt tính chống oxy hóa 57 5.1.1 Khảo sát năng lực khử 57 5.1.2 Khảo sát khả năng quét gốc tự do 58 5.1.2.1 Khả năng quét gốc tự do DPPH 58 5.1.2.2 Khả năng quét hydroxyl tự do 60 5.2 Kết quả khảo sát hoạt tính chống oxy hóa 61 5.2.1 Khảo sát năng lực khử 61 5.2.2 Khảo sát khả năng quét gốc tự do 64 5.2.2.1 Khả năng quét gốc tự do DPPH 64 5.2.2.2 Khả năng quét hydroxyl tự do 75 Chương 6: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG VIÊM CỦA TBL 79 6.1 Phương pháp khảo sát in vitro khả năng kháng viêm bằng tác dụng ức chế biến tính albumin 79 6.2 Kết quả khảo sát in vitro knăng kháng viêm bằng tác dụng ức chế biến tính albumin do nhiệt 80 Chương 7: PHÂN LẬP HỢP CHẤT HÓA HỌC TỪ TBL 88 7.1 Phương pháp phân lập hợp chất hóa học từ TBL 88 7.1.1 Sắc ký nhanh – cột khô 90 7.1.2 Sắc ký cột cổ điển 91 7.1.3 Sắc ký lớp mỏng điều chế 91 7.1.4 Phân tích hợp chất đã cô lập 92 7.2 Kết quả phân lập hợp chất từ TBL 92 7.2.1 Kết quả sắc ký nhanh – cột khô 93 7.2.2 Kết quả sắc ký cột cổ điển 96 7.2.3 Kết quả SKLM điều chế 99 7.2.4 Kết quả phổ chất 1 100 Chương 8: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 101 8.1 Kết luận 101 8.1.1 Thực vật học 101 [...]... - Khảo sát khả năng kháng khuẩn, kháng viêm và chống oxy hóa của Tứ Bạch Long làm cơ sở khoa học cho việc sử dụng loại dược liệu này - Khảo sát thành phần hóa học của Tứ Bạch Long 3 Nội dung: (đối chiếu với hợp đồng đã ký): Công việc dự kiến Công việc đã thực hiện Khảo sát đặc điểm vi học TBL - Khảo sát đặc điểm vi học gồm vi phẫu và bột dược liệu TBL, bao gồm các bộ phận rễ, thân và lá Khảo sát thành. ..8.1.2 Hóa học 101 8.1.3 Hoạt tính sinh học 101 8.2 Đề nghị 102 TÀI LIỆU THAM KHẢO 104 PHỤ LỤC PHẦN MỞ ĐẦU 1 Tên đề tài/dự án: “KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN, CHỐNG OXY HÓA VÀ KHÁNG VIÊM CỦA CÂY TỨ BẠCH LONG (BLEPHARIS MADERASPATENSIS (L.) ROTH)” Chủ nhiệm đề tài: ThS Văn Đức Thịnh Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học &... các chủng khuẩn và nấm thông dụng - Định lượng MIC của 2 phân đoạn đáp ứng kháng khuẩn tốt nhất (phân đoạn ethyl acetat và chloroform) Khảo sát khả năng chống oxy hóa của - Đánh giá năng lực khử của các dạng cao chiết TBL - Khảo sát khả năng quét gốc tự do (DPPH và hydroxyl tự do) của các dạng cao chiết Khảo sát khả năng kháng viêm của Tứ - Bạch Long Đánh giá in vitro khả năng kháng viêm của các dạng... rễ, thân và lá Khảo sát thành phần hóa học thực vật - Đánh giá các chỉ số hóa lý (độ ẩm, độ tro toàn phần, tro không tan trong TBL acid) của nguyên liệu và các dạng cao chiết - Khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật của nguyên liệu tươi và các phân đoạn cao chiết Khảo sát khả năng kháng khuẩn của - 1 Định tính khả năng kháng khuẩn của TBL cao chiết cồn, cao chiết nước và các phân đoạn dịch chiết bằng... Bacillus subtilis và Staphyllococcus sp Kết quả cho thấy cả thân và rễ TBL đều có khả 6 năng kháng khuẩn; mạnh nhất là cao chiết aceton và methanol; khả năng kháng khuẩn thể hiện mạnh nhất trên chi Staphylococcus Tuy nhiên, nghiên cứu không đề cập đến nồng độ mẫu thử trong khảo sát kháng khuẩn và khảo sát chỉ mang tính định tính khả năng kháng của TBL trên các chủng thử nghiệm [40] - Hoạt tính hạ lipid... được công bố bởi Devi và Meera (2010) Công trình này thiên về phân tích đặc điểm hình thái học thực vật và sơ bộ thành phần hóa thực vật của lá TBL được thu thập từ Ấn Độ Kết quả thu được chủ yếu là các thông số hình thái học bên ngoài của TBL, nghiên cứu hóa học thực vật chỉ ở mức khảo sát sơ bộ Theo kết quả nghiên cứu thành phần hóa thực vật được công bố, lá TBL có các thành phần chủ yếu như sau:... chiết bằng phương pháp ức chế biến tính albumin do nhiệt Phân lập và xác định cấu trúc hợp chất - Phân tách được một hỗn hợp chất từ cao chiết ethyl acetat của TBL, tuy hóa học có trong Tứ Bạch Long nhiên còn chưa tinh khiết Công bố 01 bài báo khoa học về nộ - dung nghiên cứu của đề tài Đã công bố bài báo khoa học “Bước đầu khảo sát tác dụng sinh học của dược liệu Tứ Bạch Long (Blepharis maderaspatensis... đó là saponin (9,2%) và alkaloid (5,5%), ngoài ra còn có flavonoid, tannin và chlorophil chiếm tỉ lệ ít hơn [30] Mohan và cộng sự (2010) cũng đã công bố về đặc điểm vi học và thành phần hóa thực vật của toàn cây TBL Theo kết quả nghiên cứu này cho thấy, thành phần hóa học của toàn cây TBL gồm: alkaloid, terpenoid, coumarin, tannin, saponin, flavonoid, quinon, anthraquinon, phenol và glycosid [54] Nghiên... saponin, flavonoid, quinon, anthraquinon, phenol và glycosid [54] Nghiên cứu sâu hơn về các hoạt tính sinh học của TBL cũng ghi nhận được những kết quả sau: - Hoạt tính kháng sinh: Jeyachandran và cộng sự (2010) khảo sát hoạt tính kháng khuẩn các dạng cao chiết ether dầu hỏa, ethanol, methanol, aceton của thân và rễ TBL trên 10 chủng khuẩn: Escherichia coli, Salmonella typhi, Klebsiella pneumoniae, Serratia... về thực vật, cây thuốc Việt Nam của Phạm Hoàng Hộ, Võ Văn Chi cũng chỉ đề cập tới TBL như một loài cỏ mọc hoang dại phân bố từ nam Khánh Hòa vào bắc Bình Thuận [11], [12] 8 Chương 2: KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC CỦA TBL 2.1 Phương pháp nghiên cứu thực vật học 2.1.1 Khảo sát đặc điểm hình thái Khảo sát đặc điểm hình thái của cây TBL trồng tại Bộ môn Tài nguyên – dược liệu, Trung tâm Sâm và Dược liệu . 1 PHẦN MỞ ĐẦU 1. Tên đề tài/dự án: “KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN, CHỐNG OXY HÓA VÀ KHÁNG VIÊM CỦA CÂY TỨ BẠCH LONG (BLEPHARIS MADERASPATENSIS (L.) ROTH)”. Khảo sát khả năng kháng khuẩn, kháng viêm và chống oxy hóa của Tứ Bạch Long làm cơ sở khoa học cho việc sử dụng loại dược liệu này. - Khảo sát thành phần hóa học của Tứ Bạch Long. 3. Nội dung:. năng kháng khuẩn bằng phương pháp MIC 53 Chương 5: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA CỦA TBL 57 5.1 Phương pháp khảo sát hoạt tính chống oxy hóa 57 5.1.1 Khảo sát năng lực khử 57 5.1.2 Khảo sát