ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH ĐOÀN TP. HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ  *  BÁO CÁO NGHIỆM THU KHẢO SÁT CÁC KIỂU TÁI SẮP XẾP GEN IG/TCR TRÊN BỆNH NHÂN BẠCH CẦU CẤP DÒNG LYMPHO B BẰNG KỸ THUẬT PCR TẠI BỆNH VIỆN TRUYỀN MÁU HUYẾT HỌC TP.HCM CAO SỸ LUÂN CƠ QUAN CHỦ TRÌ: TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 09/ 2014 I TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Bạch cầu cấp dòng lympho (BCCDL) là một bệnh lý ác tính về máu thường gặp ở trẻ em. Kỹ thuật PCR dựa vào vùng nối của sự tái sắp xếp (TSX) gen Ig/TCR là một trong 3 kỹ thuật được khuyến cáo sử dụng để theo dõi bệnh BCCDL. Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành khảo sát 19 kiểu TSX gen Ig/TCR trên 90 mẫu BN BCCDL-B tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP. HCM. Kết quả xác định được tần suất biểu hiện đặc trưng cho BN BCCDL-B của 19 kiểu TSX gen Ig/TCR. Với 19 kiểu TSX gen Ig/TCR, chúng tôi có thể theo dỗi điều trị được 86,67% BN BCCDL-B nếu sử dụng một kiểu TSX gen Ig/TCR, còn sử dụng 2 kiểu TSX gen thì theo dõi điều trị được 51,11% BN BCCDL-B. Từ kết quả trên chúng tôi đã xác định được một số kiểu TSX gen Ig/TCR có giá trị trong theo dõi điều trị BCCDL-B như: Vd2-Dd3 là kiểu TSX có mức độ biểu đặc trưng cho BCCDL-B chiếm tỷ lệ cao nhất (46,67%), kế tiếp là VkI-Kde (21,11%), VkII-Kde (15,56%), VgIV-Jg1.1/2.1 (13,33%), In-Kde (12,22%), VgI-Jg1.1/2.1 (11,11%), VgI- Jg1.3/2.3 (10,00%), VkIII-Kde và VgII-Jg1.3/2.3 đều chiếm 8,89%. Sự tương đồng giữa kết quả đánh tồn lưu tế bào ác tính (TLTBAT) bằng PCR bán định lượng và định lượng bằng RQ-PCR sử dụng SYBR Green khảo sát các kiểu TSX gen Ig/TCR với kết quả RT-PCR các tổ hợp gen (E2A/PBX1, MLL/AF4, BCR/ABL và TEL/AML1) và kỹ thuật dấu ấn miễn dịch đã khẳng định giá trị theo dõi điều trị bệnh của các kiểu TSX gen Ig/TCR trên BN BCCDL-B. Từ đó, bước đầu đánh giá TLTBAT bằng kỹ thuật PCR bán định lượng và định lượng bằng RQ-PCR sử dụng SYBR Green khảo sát các kiểu TSX gen Ig/TCR. Kỹ thuật PCR dựa trên các kiểu TSX gen Ig/TCR đơn giản, độ nhạy cao và chuyên biệt bệnh nhân. Vì vậy, có thể sử dụng kỹ thuật PCR khảo sát các kiểu tái sắp xếp gen Ig/TCR giúp chọn lọc được những kiểu tái sắp xếp gen Ig/TCR đặc trưng cho BCCDL-Bvà RQ-PCR sử dụng SYBR Green để đánh giá TLTBAT, góp phần theo dõi điều trị bệnh BCCDL-B tại Việt Nam được tốt hơn. II ABSTRACT Purpose: To detect common Ig/TCR gene rearrangements which are used to monitor minimal residual disease (MRD) in childhood B-cell acute lymphoblastic leukemia (B-ALL) Vietnamese patients. The junctional regions of Ig/TCR gene rearrangements contain unique sequences owing to the deletion and random insertion of nucleotides during the rearrangement process. Since an ALL is derived from a single transformed lymphoid precursor cell, all ALL cells of a patient in principle have the same Ig/TCR gene rearrangements with identical junctional region sequences that can be regarded as leukemia-specific fingerprints. Methods: In this study, 19 common Ig/TCR gene rearrangements were analyzed in 90 bone marrow samples from childhood B-ALL patients and 10 healthy control samples at Blood Transfusion and Hematology hospital of Ho Chi Minh City. Initially, expressions of Ig/TCRs rearrangements are evaluated by semiquantitative PCR. Result: Seventy eight of 90 patients (86.67%) strongly expressed one or more Ig/TCR rearrangements. The strong expression of Ig/TCR rearrangements were Vd2-Dd3 (46,67%), VkI-Kde (21,11%), VkII-Kde (15,56%), VgIV-Jg1.1/2.1 (13,33%), In-Kde (12,22%), VgI-Jg1.1/2.1 (11,11%), VgI-Jg1.3/2.3 (10,00%), VkIII-Kde and VgII- Jg1.3/2.3 (8,89%). Detection of MRD in B-ALL by semi-quantitative PCR and RQ-PCR using SYBR Green of Ig/TCR rearrangements are concordance with result of RT-PCR- based detection of fusion gene transcripts and flow-cytometric immunophenotyping. Conclusion: The results of this study help to select frequent strong expression of Ig/TCR rearrangements in Vietnamese patients. Moreover, our results indicated that and RQ-PCR using SYBR Green of Ig/TCR rearrangements is simple and suitable method for MRD monitoring in childhood B-ALL. Then, these results are the profile to develop real- time PCR technique for monitoring MRD in B-ALL. III DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT THUẬT NGỮ TIẾNG VIẾT BCCDL Bạch cầu cấp dòng lympho BN Bệnh nhân NST Nhiễm sắc thể TSX Tái sắp xếp FAB Hệ thống phân loại French-American-British BCCDT Bạch cầu cấp dòng tủy CD Dấu ấn tế bào EFS Thời gian sống không sự kiện TBAT TLTBAT Tế bào ác tính Tồn lưu tế bào ác tính CR OS PCR tỷ lệ lui bệnh hoàn toàn tỷ lệ sống toàn bộ Phản ứng khuếch đại chuỗi RQ-PCR Ig/TCR Phản ứng PCR định lượng Immunoglobulin/T cell receptor IV DANH MỤC CÁC BẢNG SỐ TÊN BẢNG SỐ LIỆU TRANG Bảng 1.1 Phân loại BCCLD theo miễn dịch tế bào dựa vào các CD 2 Bảng 1.2 Đánh giá tiên lượng BCCDL theo di truyền học phân tử 3 Bảng 1.3 Bảng 2.1 Cấu trúc của các gen Ig/TCR Các mồi sử dụng trong phản ứng PCR khảo sát các kiểu TSX gen Ig/TCR 7 19 Bảng 2.2 Các cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR để khảo sát 19 kiểu TSX gen Ig/TCR và kích thước sản phẩm tương ứng 20 Bảng 2.3 Đánh giá mức độ biểu hiện của các kiểu TSX gen Ig/TCR theo phương pháp PCR bán định lượng 22 Bảng 3.1 Bảng 3.2 Bảng 3.3 Bảng 3.4 Bảng 3.5 Bảng 3.6 Bảng 3.7 Bảng 3.8 Bảng 3.9 Bảng 3.10 Bảng 3.11 Bảng 3.12 Bảng 3.13 Tỷ lệ mức độ biểu hiện của các kiểu TSX gen Ig/TCR trên NBT Mức độ biểu hiện của các kiểu TSX gen Ig/TCR trên một số BN BCCDL-B BN BCCDL-B biểu hiện mạnh các kiểu TSX gen Ig/TCR Tỷ lệ mức độ biểu hiện của các kiểu TSX gen Ig/TCR trên BN BCCDL-B Số lượng BN có ∆C T ≥ 3 của phản ứng RQ-PCR các kiểu TSX gen Ig/TCR ở mức 3 điểm giữa NBT và BN Tỷ lệ các kiểu TSX gen Ig/TCR đặc trưng cho BN BCCDL-B So sánh tỷ lệ của các kiểu TSX gen Ig/TCR đặc trưng cho quần thể TBAT với nghiên cứu khác Mức độ biểu hiện của các kiểu TSX gen Ig/TCR đặc trưng cho BN mã B-ALL-036 trước và sau điều trị Sự thay đổi mức độ biểu hiện của các kiểu TSX gen Ig/TCR đặc trưng cho BN BCCDL-B âm tính với các tổ hợp gen trước và sau điều trị bằng PCR bán định lượng Sự thay đổi mức độ biểu hiện của các kiểu TSX gen Ig/TCR đặc trưng cho BN BCCDL-B dương tính với tổ hợp gen trước và sau điều trị bằng PCR bán định lượng Sự thay đổi giá trị C T của phản ứng RQ-PCR các kiểu TSX gen Ig/TCR đặc trưng cho BN BCCDL-B trước và sau điều trị Kết quả theo dõi điều trị bằng RQ-PCR Ig/TCR và PCR các tổ hợp gen thường gặp ở BCCDL trên nhóm BN dương tính với các tổ hợp gen Kết quả theo dõi điều trị bằng RQ-PCR Ig/TCR và Dấu ấn miễn dịch trên BN âm tính với các tổ hợp gen thường gặp 23 25 26 27 28 30 31 32 33 35 36 37 39 V DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ SỐ TÊN HÌNH ẢNH TRANG Hình 1.1 Tỷ lệ các bất thường NST thường gặp trên BCCDL trẻ em 4 Hình 1.2 Cấu trúc gen IgH 8 Hình 1.3 Cấu trúc gen IgK 9 Hình 1.4 Cấu trúc của gen IgL 9 Hình 1.5 Cấu trúc của gen TCRA và TCRD 10 Hình 1.6 Hình 1.7 Hình 1.8 Hình 1.9 Cấu trúc của gen TCRB Cấu trúc của gen TCRG Cấu trúc các trình tự tín hiệu tái tổ hợp của đoạn gen V và J trên gen Igλ, Igκ và IgH Quá trình TSX của các gen Ig/TCR 10 11 12 13 Hình 2.1 Thang điểm đánh giá mức độ biểu hiện của các kiểu TSX gen Ig/TCR dựa trên độ đậm của sản phẩm PCR điện di trên gel agarose 21 Hình 3.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose của kiểu TSX gen VkI-Kde trên NBT 24 Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose với kiểu TSX gen VkI-Kde trên BN BCCDL-B 25 Hình 3.3 Tỷ lệ BN có các kiểu TSX gen Ig/TCR đặc trưng cho quần thể TBAT 29 Hình 3.4 Hình 3.5 Hình 3.6 Hình 3.7 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose của 2 kiểu TSX gen Vd2-Dd3 và VgII-Jg1.1/2.1 trên BN BCCDL-B Kết quả điện di sản phẩm PCR bán định lượng của kiểu TSX gen Vd2-Dd3 và VgIV-Jg1.1/2.1 trên BN mã B-ALL-036 Kết quả điện di sản phẩm PCR bán định lượng của kiểu TSX gen Vd2-Dd3 trên BN mã B-ALL-038 và B-ALL-042 Kết quả điện di sản phẩm PCR bán định lượng của kiểu TSX gen Vd2-Dd3 và VgIV-Jg1.1/2.1 trên BN mã B-ALL-034 30 33 34 34 VI PHẦN MỞ ĐẦU 1. Đề tài: Khảo sát các kiểu tái sắp xếp gen Ig/TCR trên bệnh nhân Bạch cầu cấp dòng lympho B bằng kỹ thuật PCR tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP.HCM Chủ nhiệm: ThS. Cao Sỹ Luân Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ Thời gian thực hiện: 12 tháng (từ tháng 12/2013 đến tháng 12/2014) Kinh phí được duyệt: 80.000.000 VNĐ Kinh phí đã cấp: VNĐ theo TB số: TB-SKHCN ngày 2. Mục tiêu: Khảo sát các kiểu TSX gen Ig/TCR trên bệnh nhân BCCDL-B bằng kỹ thuật PCR tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học Tp. Hồ Chí Minh. - Xác định tần suất của 19 kiểu TSX gen Ig/TCR đặc trưng cho quần thể tế bào ác tính trên bệnh nhân BCCDL-B Việt Nam. - Xác định các kiểu TSX gen Ig/TCR có giá trị trong chẩn đoán TLTBAT trên bệnh nhân BCCDL-B Việt Nam. VII 3. Nội dung: STT Nội dung đăng ký Nội dung đã thực hiện 1 Thu thập bệnh phẩm là tủy xương của bệnh nhân BCCDL-B trẻ em lúc chẩn đoán và sau điều trị và mẫu máu ngoại vi của người bình thường Thu thập được 122 mẫu 2 Thực hiện tách chiết genomic DNA từ tủy xương và máu ngoại vi bằng kit của SIGMA Thực hiện thành công trên 122 mẫu 3 Tần suất biểu hiện của 19 kiểu TSX gen Ig/TCR đặc trưng cho quần thể tế bào ác tính trên bệnh nhân BCCDL-B Việt Nam Xác định được tần suất biểu hiện của 19 kiểu TSX gen Ig/TCR trên bệnh nhân BCCDL-B Việt Nam 4 Các kiểu TSX gen Ig/TCR có giá trị trong chẩn đoán TLTBAT trên bệnh nhân BCCDL-B Việt Nam Thiết lập lưu đồ theo dõi điều trị BCCDL-B dựa trên các kiểu TSX gen Ig/TCR 5 Báo cáo chuyên đề: Các kỹ thuật xác định TLTBAT trong BCCDL Hoàn thành báo cáo chuyên đề 6 Bài báo khoa học được đăng trên các tạp chí chuyên ngành trong nước Bài báo khoa học đăng trên tạp chí Y học Việt Nam 2012 7 Viết báo cáo nghiệm thu Báo cáo nghiệm thu đầy đủ nội dung nghiên cứu MỤC LỤC Trang Tóm tắt nội dung nghiên cứu I Danh sách các chữ viết tắt III Danh sách bảng IV Danh sách hình V PHẦN MỞ ĐẦU VI ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1 2 CHƯƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 19 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 PHỤ LỤC 48 1 CHUYÊN ĐỀ BỆNH BẠCH CẦU CẤP DÒNG LYMPHO VÀ CÁC KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH TỒN LƢU TẾ BÀO ÁC TÍNH [...]... TRONG B NH B CH CẦU CẤP DÒNG LYMPHO < /b> 2.1 Kỹ thuật tế b o dòng < /b> chảy 16 2.2 Kỹ thuật PCR xác định các < /b> tổ hợp gen < /b> b t thƣờng 17 2.3 Kỹ thuật PCR khảo < /b> sát < /b> các < /b> kiểu < /b> TSX gen < /b> Ig/TCR 18 2 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT THUẬT NGỮ TIẾNG VIẾT BCCDL B ch < /b> cầu < /b> cấp < /b> dòng < /b> lympho < /b> BN B nh < /b> nhân < /b> NST Nhiễm sắc thể TSX Tái < /b> sắp < /b> xếp < /b> FAB Hệ thống phân loại French-American-British BCCDT B ch < /b> cầu < /b> cấp < /b> dòng.< /b> .. Tuy nhiên BCCDL cũng gặp ở ngƣời trƣởng thành và chiếm khoảng 20% b nh < /b> b ch < /b> cầu < /b> cấp < /b> gặp ở ngƣời lớn [11] Ở Việt Nam hiện nay, tỷ lệ 13 trẻ em mắc b nh < /b> BCCDL cũng chiếm tỷ lệ khá cao trong các < /b> b nh < /b> ung thƣ ở trẻ em Tại B nh < /b> viện Nhi Trung ƣơng, b ch < /b> cầu < /b> cấp < /b> chiếm 45% số BN ung thƣ nhập viện Tại B nh < /b> viện Truyền máu huyết học Tp HCM, mỗi năm có khoảng 120 ca b nh < /b> mới đƣợc chẩn đoán BCCDL Về kiểu < /b> hình... thích hợp) [28] Hiện tại có 3 kỹ thuật có thể đáp ứng các < /b> tiêu chuẩn trên < /b> đƣợc dùng để xác định TLTBAT là: 15 - Kỹ thuật tế b o dòng < /b> chảy - Kỹ thuật RT -PCR sử dụng các < /b> tổ hợp gen < /b> để xác định các < /b> b t thƣờng NST - Kỹ thuật PCR khảo < /b> sát < /b> các < /b> kiểu < /b> TSX gen < /b> Ig/TCR Cả 3 kỹ thuật trên < /b> đều có độ nhạy cao (từ 10-3 - 10-6 tế b o), có thể ứng dụng cho hầu hết BN, có sự chuyên biệt với tế b o b ch < /b> cầu < /b> ác tính, có thể... NST thường gặp trên < /b> BCCDL trẻ em 8 Hình 2.1: Biểu đồ phân tích đường cong nóng chảy sản phẩm PCR để phân biệt giữa sản phẩm PCR chuyên biệt và không chuyên biệt 22 4 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN VỀ B NH B CH CẦU CẤP DÒNG LYMPHO < /b> 1.1 Khái niệm B ch < /b> cầu < /b> cấp < /b> dòng < /b> lympho < /b> (BCCDL) là một loại ung thƣ của các < /b> lympho < /b> b o không trƣởng thành, đƣợc gọi là các < /b> nguyên b o lympho < /b> hoặc các < /b> tế b o non BCCDL là kết... TỔNG QUAN VỀ B NH B CH CẦU CẤP DÒNG LYMPHO < /b> 1.1 Khái niệm 5 1.2 Phân loại 5 1.3 Các < /b> yếu tố nguy cơ gây b nh < /b> 7 1.4 Các < /b> b t thƣờng nhiễm sắc thể trong b ch < /b> cầu < /b> cấp < /b> dòng < /b> lympho < /b> 9 1.5 Phƣơng pháp chẩn đoán 10 1.6 Phƣơng pháp điều trị 11 1.7 Tình hình b nh < /b> b ch < /b> cầu < /b> cấp < /b> dòng < /b> lympho < /b> 13 CHƢƠNG II: CÁC KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH TỒN LƢU TẾ B O ÁC TÍNH... hóa máu: kiểm tra chức năng đông máu, creatinin máu, acid uric, LDH, men gan, các < /b> loại HLA, kháng nguyên kháng b nh < /b> b ch < /b> cầu,< /b> nồng độ globuline,  Huyết đồ: kiểm tra số lƣợng các < /b> tế b o máu và thành phần các < /b> loại b ch < /b> cầu < /b> Giảm 3 dòng < /b> tế b o máu thƣờng gặp ở BN BCCDL mới chẩn đoán Trong đó hồng cầu,< /b> hemoglobin, hồng cầu < /b> lƣới đều giảm, số lƣợng b ch < /b> cầu < /b> có thể thấp, b nh 10 thƣờng hoặc tăng cao, đặc biệt... tăng nguyên b o lympho,< /b> giảm b ch < /b> cầu < /b> hạt trung tính và giảm số lƣợng tiểu cầu < /b> [13,33]  Tủy đồ: đây là xét nghiệm chủ yếu để chẩn đoán BCCDL vì khoảng 10% BN không có tế b o blast lƣu hành trong máu ngoại biên ở thời điểm chẩn đoán Tủy xƣơng thƣờng giàu tế b o và có hiện tƣợng các < /b> dòng < /b> tế b o tủy b áp đảo b i các < /b> nguyên b o dòng < /b> lympho < /b> Để chẩn đoán b nh < /b> b ch < /b> cầu < /b> cấp < /b> phải có trên < /b> 20% nguyên b o trong... nữa của kỹ thuật RT -PCR các < /b> tổ hợp gen < /b> là không cho biết lƣợng tế b o ác tính còn lại mà đánh giá TLTBAT thông qua mức độ biểu hiện gen < /b> của các < /b> tổ hợp gen < /b> b t thƣờng 2.3 Kỹ thuật PCR khảo < /b> sát < /b> các < /b> kiểu < /b> TSX gen < /b> Ig/TCR Các < /b> gen < /b> Ig/TCR đƣợc cấu trúc b i nhiều vùng V, D và J khác nhau và có nhiều cách TSX các < /b> vùng V, D và J với nhau để tạo ra rất nhiều dòng < /b> tế b o B và T mang các < /b> kiểu < /b> TSX gen < /b> Ig/TCR khác nhau... mỗi tế b o lympho < /b> hay dòng < /b> tế b o lympho,< /b> cũng nhƣ mỗi dòng < /b> tế b o lympho < /b> ác tính Vì vậy, mỗi dòng < /b> tế b o lympho < /b> ác tính sẽ đƣợc đặc trƣng b i một vùng nối duy nhất Nếu khảo < /b> sát < /b> vùng nối của sự TSX gen < /b> Ig/TCR b ng kỹ thuật PCR nhằm xác định TLTBAT thì có thể theo dõi điều trị đƣợc cho hơn 95% BN BCCDL [6,16] Trong đó, các < /b> kiểu < /b> TSX gen < /b> ở BCCDL -B là IgH (95%, chủ yếu liên quan tới các < /b> kiểu < /b> TSX gen < /b> VH-JH),... tế b o b ch < /b> cầu < /b> ác tính mà hiếm khi có ở tế b o b ch < /b> cầu < /b> b nh thƣờng Chẳng hạn nhƣ, sự biểu hiện quá mức CD10, biểu hiện các < /b> kiểu < /b> hình miễn dịch của dòng < /b> tủy trong BCCDL -B hay sự đồng biểu hiện của TdT và các < /b> kiểu < /b> hình miễn dịch của tế b o T trên < /b> BCCDL-T, một sự kết hợp mà b nh thƣờng chỉ xảy ra trong tuyến ức [17] Sự biểu hiện của các < /b> kiểu < /b> hình miễn dịch trên < /b> tế b o ác tính sẽ đƣợc so sánh với tế b o . PHẦN MỞ ĐẦU 1. Đề tài: Khảo sát các kiểu tái sắp xếp gen Ig/TCR trên b nh nhân B ch cầu cấp dòng lympho B bằng kỹ thuật PCR tại B nh viện Truyền máu Huyết học TP.HCM Chủ nhiệm: ThS CÁO NGHIỆM THU KHẢO SÁT CÁC KIỂU TÁI SẮP XẾP GEN IG/TCR TRÊN B NH NHÂN B CH CẦU CẤP DÒNG LYMPHO B B NG KỸ THUẬT PCR TẠI B NH VIỆN TRUYỀN MÁU HUYẾT HỌC TP.HCM CAO SỸ LUÂN . hình b nh b ch cầu cấp dòng lympho 13 CHƢƠNG II: CÁC KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH TỒN LƢU TẾ B O ÁC TÍNH TRONG B NH B CH CẦU CẤP DÒNG LYMPHO 2.1 Kỹ thuật tế b o dòng chảy 16 2.2 Kỹ thuật PCR xác định các