i CHIẾT TÁCH VÀ TINH CHẾ UBIQUINONE Q10 TỪ VI KHUẨN QUANG DƢỠNG TÍA KHÔNG LƢU HUỲNH RHODOPSEUDOMONAS SPP Ubiquinon Q-10 thuộc nhóm chất isoprenoid quinon hiện diện ở mọi tế bào sinh vật. Hàm lƣợng Q-10 trong cơ thể ngƣời sẽ bị giảm dần theo độ tuổi và giảm mạnh do một số bệnh nhƣ tim mạch, ung thƣ, thoái hoá thần kinh, tiểu đƣờng …[25]. Do vậy, hợp chất Q-10 đang đƣợc nghiên cứu mạnh mẽ nhƣ là một nguồn nguyên liệu mới trong lĩnh vực dƣợc phẩm, thực phẩm và mỹ phẩm. Trong nghiên cứu này, tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng nhƣ ánh sáng, nguồn carbon, nguồn nito, vitamin, dịch chiết cà rốt và dịch chiết cà chua đến sự tăng trƣởng tế bào cũng nhƣ sản xuất CoQ10 của các chủng vi khuẩn R. Palustris PN16, PN21 và PN31 đƣợc phân lập tại Việt Nam. Đã khảo sát 4 phƣơng pháp chiết tách CoQ10, trong đó phƣơng pháp 3 và 4 cho hàm lƣợng CoQ10 cao và tạp chất ít hơn 2 phƣơng pháp còn lại SUMMARY EXTRACTING AND REFINING UBIQUINONE Q10 FROM RHODOPSEUDOMONAS SPP IS A PRUPLE NON-SULFUR PHOTOTROPHIC BACTERIA Coenzym Q10 (CoQ10) funtion in the mitochondrial respiratory chain and serves as a lipophic antioxidant. There is an increasing interest in the use of CoQ10 as a nutritional supplement and cosmetic ingredient. It is known that CoQ10 is produced in a wide variety of organisms, from microorganisms such as bacteria and yeast, to higher animals and plant. In this study, bacteria strain R. Palustris PN16, PN21 and PN31 isolated in VietNam produced CoQ10. Optimimization of cultural conditions such as light source, carbon source, vitamins, carrot juice and tomato juice in order to improved the production of CoQ10. Of 4 methods selected for CoQ10 extraction, the method 3 and 4 demonstrated highly effective protocol for extracting CoQ10 from the bacteria. ii TÓM TẮT ĐỀ TÀI Error! Bookmark not defined. MỤC LỤC Error! Bookmark not defined. DANH MỤC HÌNH iiv DANH MỤC BẢNG vi CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1 1.1.ĐẠI CƢƠNG VỀ VI KHUẨN QUANG DƢỠNG TÍA KHÔNG LƢU HUỲNH – HỌ RHODOSPIRILLACEAE 1 1.1.1. Phân loại vi khuẩn quang dƣỡng tía 1 1.1.2. Khái quát về vi khuẩn quang dƣỡng tía không lƣu hùynh 1 1.1.3. Sản phâm từ vi khuẩn quang dƣỡng tía không lƣu huỳnh và ứng dụng 3 1.2. ĐẶC ĐIỂM CỦA VI KHUẨN QUANG DƢỠNG TÍA KHÔNG LƢU HUỲNH RHODOPSEUDOMONAS PALUSTRIS 4 1.2.1. Đặc điểm chung của chi Rhodopseudomonas 4 1.2.2. Vi khuẩn Rhodopseudomonas palustris 4 1.3. TỔNG QUAN VỀ UBIQUINON Q-10 12 1.3.1. Lịch sử nghiên cứu 12 1.3.2. Tính chất vật lý 13 1.3.3. Tính chất hoá học 13 1.3.4. Chức năng sinh lý của Q-10 trong cơ thể sinh vật 15 1.3.5. Sinh tổng hợp ubiquinon Q-10 16 1.3.6. Những ứng dụng của Q-10 trong thực tiễn 20 1.3.7. Các phƣơng pháp sản xuất ubiquinon Q-10 23 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 25 2.2. PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 25 2.2.1. Dụng cụ - thiết bị 25 2.2.2. Hoá chất – Dung môi 26 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.3.1. Nuôi cấy vi khuẩn quang dƣỡng 26 2.3.2. Khảo sát các điều kiện nuôi cấy phù hợp cho vi khuẩn quang dƣỡng tía không lƣu huỳnh Rhodopseudomonas palustris 27 2.3.3. Thu nhận sinh khối vi khuẩn 31 2.3.4. Chiết xuất Q-10 từ vi khuẩn 31 2.3.5. Phân tích sản phẩm thu đƣợc 35 2.3.6. Tinh chế và kết tinh Q-10 37 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 40 iii 3.1. KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY PHÙ HỢP CHO VI KHUẨN QUANG DƢỠNG TÍA KHÔNG LƢU HUỲNH RHODOPSEUDOMONAS PALUSTRIS 40 3.1.1. Nuôi cấy vi khuẩn R. palustris trên môi trƣờng SA 40 3.1.2. Ảnh hƣởng của nguồn carbon lên sự tăng trƣởng của vi khuẩn R. palustri ………………………………………………………………………. .41 3.1.3. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ lên tăng trƣởng của các chủng R. palustris 43 3.1.4. Ảnh hƣởng của nồng độ chất dinh dƣỡng lên sự tăng trƣởng của các chủng vi khuẨn R. palustris 45 3.1.5. Ảnh hƣởng của một số vitamin lên sự tăng trƣởng của vi khuẩn 45 3.2. CHIẾT XUẤT, CÔ LẬP VÀ PHÂN TÍCH HỢP CHẤT Q-10 48 3.2.1. Kết quả cô lập và định tính Q-10 bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng 48 3.2.2. Kết quả định tính Q-10 bằng phƣơng pháp quang phổ 51 3.2.3. Kết quả định lƣợng Q-10 trong các chủng vi khuẩn R. palustris PN16 , PN21 và PN31 bằng phƣơng pháp quang phổ 53 3.3. ẢNH HƢỞNG CỦA CÁC LOẠI VITAMIN LÊN SỰ TỔNG HỢP Q-10 58 3.4. KẾT QUẢ CHIẾT XUẤT VÀ TINH CHẾ HỢP CHẤT Q-10 62 3.4.1. Kết quả tinh chế hợp chất Q-10 bằng phƣơng pháp sắc ký cột 64 3.4.2. Đánh giá tính chất của hợp chất Q-10 67 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 71 iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Vi khuẩn Rhodopseudomonas palustris 4 Hình 1.2. Màng quang hợp của Rhodopseudomonas palustris 5 Hình 1.3. Các phƣơng thức biến dƣỡng ở loài R. palustris 6 Hình 1.4. Những con đƣờng tạo năng lƣợng và chuyển hóa carbon và nitơ ở R. palustris ……………… 6 Hình 1.5. Vị trí các gen liên quan đến quang tự dƣỡng ở R. palustris 7 Hình 1.6. Các gen liên quan đến cố định N 2 ở R. palustris 7 Hình 1.7. Con đƣờng phân giải hợp chất vòng ở R. palustris 8 Hình 1.8. Dòng điện tử trong quang hợp ở R. palustris 10 Hình 1.9. Con đƣờng truyền điện tử trong phức hợp I 11 Hình 1.10. Con đƣờng truyền điện tử trong phức hợp II 11 Hình 1.11. Công thức phân tử coenzym Q-10 14 Hình 1.12. Quá trình sinh tổng hợp para-hydrobenzoat từ tyrosin và 16 phenylalanin 16 Hình 1.13. Con đƣờng axít mevalonic 18 Hình 1.14. Phản ứng hai bƣớc đƣợc xúc tác bởi FPP synthase 19 Hình 1.15. Con đƣờng tổng hợp Ubiquinon từ para-hydroxybenzoat 19 Hình 1.16. Q-10 đƣợc bán tổng hợp từ Solanesol 24 Hình 2.1. Phƣơng pháp chiết xuất Q-10 của Collins 32 Hình 2.2. Phƣơng pháp chiết xuất Q-10 của Paterson & Buddie 33 Hình 2.3. Phƣơng pháp chiết xuất Q-10 của Yoshida 34 Hình 2.4. Phƣơng pháp chiết xuất Q-10 của W Zhong 34 Hình 2.5. Tóm tắt quá trình tinh sạch Q-10 từ phƣơng pháp sắc ký cột 38 Hình 3.1. Hình dạng của vi khuẩn R. palustris dƣới kính hiển vi 40 Hình 3.2. Sinh khối của các loài R. palustris 40 Hình 3.3.Sắc ký đồ dịch chiết vi khuẩn theo phƣơng pháp (I) dƣới ánh sáng thƣờng chủng PN16 (1); PN21 (2), PN31 (3) và dung dịch Q-10 chuẩn. 48 Hình 3.4. Sắc ký đồ dịch chiết vi khuẩn theo phƣơng pháp (I) dƣới UV 254 của chủng PN16 (1); PN21 (2), PN31 (3) và dung dịch Q-10 chuẩn. 49 Hình 3.5. Sắc ký đồ dịch chiết vi khuẩn theo phƣơng pháp (II) dƣới UV 254 của chủng PN16 (1); PN21 (2), PN31 (3) và dung dịch Q-10 chuẩn 49 v Hình 3.6. Sắc ký đồ dịch chiết vi khuẩn theo phƣơng pháp (III) dƣới UV 254 của chủng PN16 (1); PN21 (2), PN31 (3) và dung dịch Q-10 chuẩn 49 Hình 3.7. Sắc ký đồ dịch chiết vi khuẩn theo phƣơng pháp (IV) dƣới UV 254 của chủng PN16 (1); PN21 (2), PN31 (3) và dung dịch Q-10 chuẩn 50 Hình 3.8. Phổ hấp thu tử ngoại của dung dịch Q-10 chuẩn 51 Hình 3.10. Đƣờng chuẩn của nồng độ dung dịch Q-10 theo OD 275 54 Hình 3.11.Đồ thị hàm lƣợng Q-10 trong các chủng vi khuẩn R. palustris đƣợc chiết xuất từ các phƣơng pháp khác nhau 56 Hình 3.12.Đồ thị ảnh hƣởng của các loại vitamin lên sự tăng trƣởng và tổng hợp Q- 10 ở chủng PN16 60 Hình 3.13.Đồ thị ảnh hƣởng của các loại vitamin lên sự tăng trƣởng và tổng hợp Q- 10 ở chủng PN21 60 Hình 3.14. Đồ thị ảnh hƣởng của tiền tố lên sự tổng hợp Q-10 của các chủng R. palustris 62 Hình 3.15.Phân đoạn dịch chiết có chứa Q-10 từ sắc ký cột II (C, chuẩn; các chấm có đánh số tƣơng ứng với các phân đoạn thu nhận trên sắc ký cột II) 65 Hình 3.16.Bột kết tinh Q-10, (a) chiết xuất theo phƣơng pháp III; (b) chiết xuất theo phƣơng pháp IV 65 Hình 3.17. Hình dạng tinh thể Q-10 dƣới kính hiển vi 66 Hình 3.18 Phổ IR của hợp chất Q-10 chiết từ vi khuẩn R. palustris 67 Hình 3.19. Sắc ký đồ của dung dịch Q-10 tinh sạch định lƣợng (C, chuẩn; 2, Q-10 chiết xuất từ PN21 theo phƣơng pháp III; 3, Q-10 chiết xuất từ PN21 theo phƣơng pháp IV) ……………………………………………………………………….69 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1.Ảnh hƣởng của nguồn cung cấp carbon lên sự tăng trƣởng của các chủng vi khuẩn PN16, PN21 và PN31 42 Bảng 3.2.Ảnh hƣởng của các nguồn nitơ lên sự tăng trƣởng của các chủng PN16 , PN21 và PN31 44 Bảng 3.3.Ảnh hƣởng của nồng độ chất tăng trƣởng lên sự tăng trƣởng của các chủng PN16 , PN21 và PN31 45 Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của vitamin lên sự tăng trƣởng của các chủng vi khuẩn R. palustris PN16 , PN21 và PN31 46 Bảng 3.5. Quang phổ hấp thu cực đại mẫu Q-10 chuẩn 52 Bảng 3.6. Quang phổ hấp thu cực đại của các mẫu Q-10 sau khi cô lập 52 Bảng 3.7. Nồng độ Q-10 chuẩn với giá trị OD 275 tƣơng ứng 54 Bảng 3.8.Hàm lƣợng Q-10 trong của chủng vi khuẩn R. palustris PN16 đƣợc chiết xuất từ các phƣơng pháp khác nhau 55 Bảng 3.9 Hàm lƣợng Q-10 trong của chủng vi khuẩn R. palustris PN21 đƣợc chiết xuất từ các phƣơng pháp khác nhau 55 Bảng 3.10. Hàm lƣợng Q-10 trong của chủng vi khuẩn R. palustris PN31 đƣợc chiết xuất từ các phƣơng pháp khác nhau 59 Bảng 3.11.Ảnh hƣởng của vitamin lên sự tổng hợp Q-10 ở các chủng vi khuẩn R. palustris PN16 , PN21 và PN31 60 Bảng 3.12.Ảnh hƣởng của nồng độ vitamin E lên sự tổng hợp Q-10 ở các chủng vi khuẩn R. palustris PN16 , PN21 và PN31 61 Bảng 3.13.Ảnh hƣởng của tiền tố tự nhiên lên sự tổng hợp Q-10 ở các chủng vi khuẩn R. palustris PN16 , PN21 và PN31 61 Bảng 3.14.Thông số sắc ký cột để tinh chế dịch chiết Q-10 từ phƣơng pháp (III) và phƣơng pháp (IV) 64 Bảng 3.15.Một số biện giải về cấu trúc hóa học của Q-10 đƣợc kiểm định bằng phổ IR …………………………………………………………………….68 Bảng 3.16. Hàm lƣợng Q-10 chiết xuất từ phƣơng pháp (III) 68 Bảng 3.17. Hàm lƣợng Q-10 chiết xuất từ phƣơng pháp (IV) 69 vii BẢNG VIẾT TẮT ATP: adenosine triphosphate Bchl (bacteriochlorophull): diệp lục khuẩn Bph: bacteriopheophytin Cyt: cytochrome LH (light harvesting): Phức hợp hấp thu ánh sáng NAD: nicotinamide adenine dinucleotide NADP: nicotinamide adenine dinucleotide phosphate PHB: poly- -hydroxybutyric acid RC (reaction center): trung tâm phản ứng SA: môi trƣờng succinate - acetate SK: sinh khối TLC (thin layer chromatography): phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng UQ, Q-10: hợp chất ubiquinone Q-10 VKQD: vi khuẩn quang dƣỡng 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. ĐẠI CƢƠNG VỀ VI KHUẨN QUANG DƢỠNG TÍA KHÔNG LƢU HUỲNH – HỌ RHODOSPIRILLACEAE 1.1.1. PHÂN LOẠI VI KHUẨN QUANG DƢỠNG TÍA Vi khuẩn tía là một trong ba nhóm chủ yếu của nhóm vi khuẩn quang dƣỡng (VKQD) không sinh oxy do chúng có khả năng dùng các chất có thế khử thấp hơn nƣớc nhƣ các hợp chất khử lƣu huỳnh, hydro phân tử hoặc các hợp chất hữu cơ đơn giản làm chất cho điện tử để tạo NADPH + H + . Chúng có một hệ quang với sắc tố quang hợp là diệp lục khuẩn và rất nhiều loại carotenoid. Các carotenoid là nhóm sắc tố quyết định màu sắc của vi khuẩn tía. Chúng thƣờng có màu nâu, màu hồng, đỏ cam hoặc tím tía. Tế bào chứa chlorophyl a hoặc b, hệ thống quang hợp chứa các màng hình cầu hay hình phiến (lamellar) gắn với màng sinh chất. Để dùng làm nguồn cho điện tử (electron donors) trong quang hợp thƣờng sử dụng chất hữu cơ, đôi khi sử dụng hợp chất lƣu huỳnh dạng khử hoặc H 2 . Có khả năng di động với tiêm mao mọc ở cực, hoặc không di động, một số loài có túi khí (gas vesicles), tỷ lệ G+C là 61-72% [1] . Molish (1970) là ngƣời đầu tiên đã sử dụng sắc tố để phân loại vi khuẩn tía thành bộ Rhodobacteria với hai họ Thiorhodaceae. Pfennig và Truper (1971) thay đổi tên bộ thành Rhodospirillales và tên họ thành Chromatiaceae và Rhodospirillaceae. Imhoff (1984) chia nhóm VKQD tía lƣu huỳnh thành hai họ là Chromatiaceae, Ectithiorhodospiraceae và vi khuẩn tía không lƣu hùynh thành họ Rhodospirillaceae [1] . 1.1.2. KHÁI QUÁT VỀ VI KHUẨN QUANG DƢỠNG TÍA KHÔNG LƢU HÙYNH 2 Họ Rhodospirillaceae rất đa dạng về hình thái, cấu trúc tế bào và đặc tính sinh lý nên chúng là nhóm vi khuẩn phân bố rộng và đa dạng nhất trong VKQD tía nói chung. Có thể tìm thấy các loài VKQD tía không lƣu huỳnh ở nhiều thủy vực khác nhau nhƣ môi trƣờng nƣớc ngọt, nƣớc biển, suối nƣớc nóng, khu vực gần bờ, khu vực trầm tích, hồ ao nƣớc thải và đất ẩm có nhiều ánh sáng [1], [13] . Hình dạng tế bào ở các loài VKQD tía không lƣu huỳnh có tính đặc trƣng loài: Rhodobacter, Rhodopeudomonas có hình dạng thay đổi từ hình cầu, hình oval, đến hình que ngắn; tế bào Rhodospirillum có dạng xoắn; tế bào Rhodocyclus purpureus có hình vòng hay bán vòng đặc trƣng [1] . VKQD tía không lƣu huỳnh có hình thức biến dƣỡng linh động. Vi khuẩn có thể phát triển từ một trong bốn phƣơng cách biến dƣỡng nhƣ quang dị dƣỡng, quang tự dƣỡng, hóa dị dƣỡng và hóa tự dƣỡng phụ thuộc vào điều kiện dinh dƣỡng trong môi trƣờng, đặc biệt là nguồn carbon và điều kiện ánh sáng. Hầu hết các loài VKQD tía không lƣu huỳnh phát triển đƣợc trong điều kiện vi yếm khi đến hiếu khí và chịu đƣợc áp lực của oxy. Một vài chủng rất nhạy cảm với oxy [13]. VKQD tía không lƣu huỳnh sử dụng đƣợc rất nhiều loại carbon hữu cơ khác nhau nhƣ acid hữu cơ, rƣợu, đƣờng, acid béo bão hòa mạch thẳng từ 5-8 carbon, hợp chất hữu cơ có vòng … làm chất cho điện tử và nguồn carbon. Glucose, fructose, acetate, pyruvate và succinate đƣợc sử dụng phổ biến ở nhiều loài và thƣờng đƣợc đồng hóa qua chu trình acid tricarboxylic. Nguồn đạm của hầu hết các vi khuẩn tía không lƣu huỳnh là ammonia, nitơ phân tử và nhiều hợp chất nitơ hữu cơ. Nitrat chỉ đƣợc đồng hóa bởi vài loài và sự tăng trƣởng trên nguồn đạm này thƣờng thấp hơn các nguồn đạm khác. Đồng hóa nitrat là một quá trình đƣợc cảm ứng bởi nitrat nhƣng bị ức chế khi có mặt ammonia và glutamate. Hầu hết các VKQD tía đều có khả năng cố định nitơ [12] . Biotin, thiamin, niacin và p-aminobenzoic là nhân tố tăng trƣởng chính ở nhóm VKQD tía không lƣu huỳnh. Hầu hết VKQD tía không lƣu huỳnh tăng trƣởng mạnh trong môi trƣờng có bổ sung lƣợng nhỏ cao nấm men hay nguồn dinh dƣỡng phức tạp [1], [13] . 3 1.1.3. SẢN PHẨM TỪ VI KHUẨN QUANG DƢỠNG TÍA KHÔNG LƢU HUỲNH VÀ ỨNG DỤNG 1.1.3.1. Sinh khối VKQD tía là nguồn protein có giá trị vì giàu vitamin, carotenoid. VKQD tía có thể dùng làm nguồn dinh dƣỡng bổ sung cho gia súc, phiêu sinh vật, tôm cá và dùng trong phân bón nông nghiệp [1]. 1.1.3.2. Hydro phân tử Trong điều kiện thiếu nitơ phân tử, hầu hết VKQD tía có khả năng sản xuất hydro phân tử nhờ enzym nitrogenase. Hydro phân tử đƣợc xem là một trong những nguồn năng lƣợng có khả năng tái sinh đầy hức hẹn trong tƣơng lai [13]. 1.1.3.3. Các sản phẩm sinh hóa khác Ubiquinon Q-10 (coenzym Q-10) là thành phần quan trọng của chuỗi truyền điện tử trong các hệ quang ở VKQD, là tác nhân chống oxy hóa, tăng cƣờng sức khoẻ và có thể dùng để điều trị bệnh tim mạch. Hợp chất này đã đƣợc chiết tách và thƣơng mại hóa từ Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter sulfidophilus và Rhodospirillum rubrum [1]. Sản xuất carotenoid, diệp lục khuẩn và vitamin B 12 từ Rubrivivax gelatinosa hay Rhodospirillum rubrum [1]. Polysaccharid và acid poly- -hydroxybutyric (PHB) là vật liệu dự trữ trong tế bào của nhiều VKQD tía không lƣu huỳnh. PHB là đơn phân để sản xuất chất dẻo sinh học có thể phân hủy đƣợc bởi vi sinh vật nên có nhiều tiềm, năng ứng dụng trong sản xuất đồ nhựa, dƣợc phẩm, mỹ phẩm, … [1], [13]. [...]...1.2 ĐẶC ĐIỂM CỦA VI KHUẨN QUANG DƢỠNG TÍA KHÔNG LƢU HUỲNH RHODOPSEUDOMONAS PALUSTRIS 1.2.1 ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA CHI RHODOPSEUDOMONAS Rhodopseudomonas là một chi vi khuẩn thộc họ Rhodospirillaceae Là vi khuẩn Gram (-) Chỉ có những loài có tiêm mao mới có khả năng di động Khuẩn lạc thƣờng có màu đỏ, nâu vàng Màng quang hợp nằm bên trong, có dạng túi, dạng ống hoặc dạng... sulfid tạo thành sulfat, sulfur và thiosulfat Vi khuẩn phát triển mạnh ở nhiệt độ 25-35 oC, pH 6,5 – 7,0 Chúng là vi khuẩn quang dƣỡng kỵ khí [1], [32] 1.2.2 VI KHUẨN RHODOPSEUDOMONAS PALUSTRIS 1.2.2.1 Đặc điểm tế bào Hình 1.1 Vi khuẩn Rhodopseudomonas palustris [41] Rhodopseudomonas palustris là trực khuẩn Gram (-), màu tía kích thƣớc 0,5 – 0,9 m x 0,6 - 5 m Có màng quang hợp phía trong, dạng phiến... trong quang hợp Quang dƣỡng là phƣơng thức phát triển ƣu thế ở loài vi khuẩn R palustris Các vi khuẩn quang dƣỡng chỉ có một hệ quang hợp Hệ quang hợp ở vi khuẩn quang dƣỡng có hai phần chủ yếu: - Trung tâm phản ứng – RC (reaction center) Đây là phức hợp protein – sắc tố gắn kết trong màng thực hiện chủ yếu quá trình quang hợp RC có ít nhất ba tiểu đơn vị protein là nhẹ (Light), trung bình (Medium) và. .. TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU Vi khuẩn quang dƣỡng tía không lƣu huỳnh Rhodopseudomonas palustris PN16, PN21 và PN31 đƣợc phân lập tại Vi t Nam từ Trung tâm Sinh học – Đại học Khoa học Tự Nhiên 2.2 PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 2.2.1 DỤNG CỤ - THIẾT BỊ Dụng cụ Micropipet 20, 100, 1000, 10000 l của hãng Laboppet Các dụng cụ thủy tinh: becher, erlen, đũa khuấy, phễu lọc, … Bình chiết. .. SẢN XUẤT UBIQUINON Q-10 Chiết tách từ các nguồn thực phẩm tự nhiên Vì Q-10 hiện diện trong các nguồn thực phẩm tự nhiên với hàm lƣợng rất thấp và khó tinh sạch, do vậy vi c sản xuất Q-10 trên qui mô công nghiệp từ các nguồn thực phẩm tự nhiên không có giá trị thực tiễn Tổng hợp hoá học 23 Vi c tổng hợp hoá học Q-10 đƣợc thực hiện từ nguyên liệu là solanesol, đƣợc chiết tách từ cây họ Cà Solanesol đƣợc... thủy tinh vô trùng trải đều vi khuẩn, đem ủ ở 37oC, 72 giờ, chiếu sáng bằng đèn neon trong điều kiện kỵ khí Đếm số khuẩn lạc trên các hộp có 30-300 khuẩn lạc Tổng số tế bào vi khuẩn có trong 1ml dịch nuôi cấy đƣợc tính bằng trung bình số tế bào ở một độ pha loãng nhất định nhân với độ pha loãng Số vi khuẩn /ml = Số khóm 10số thứ tự hộp +1 2.3.2 KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY PHÙ HỢP CHO VI KHUẨN QUANG. .. do trong dioxane, ether và hexane, tan một phần trong acetone Hầu nhƣ không tan trong nƣớc, methanol và ethanol Hợp chất này bền vững ở nhiệt độ thƣờng khi đƣợc bảo quản trong vật chứa đậy kín và chắn sáng nhƣng bị phân huỷ từ từ và trở nên sẫm màu khi tiếp xúc với ánh sáng, đặc biệt khi ở dạng dung dịch Nhiệt độ nóng chảy của Q-10 là 480C – 520C, bị nhiệt phân (pyrolysis) từ từ khi bị đun lên ở nhiệt... Sỹ) Tủ sấy chân không Shellab (Mỹ) 25 Đèn tử ngoại Vilber Lourmat ở bƣớc sóng 254 nm (Pháp) Máy ly tâm Máy vortex Labnet (USA) Máy đo quang phổ UV-Vis Hitachi U-2010 (Nhật Bản) Máy đo quang phổ hồng ngoại Shimadzu FTIR-8201 PC (Nhật Bản) 2.2.2 HOÁ CHẤT – DUNG MÔI Các dung môi dùng trong chiết xuất là các dung môi kỹ thuật Các dung môi dùng cho sắc ký, phân lập, tinh chế là các dung môi tinh khiết, đạt... chuẩn cho phân tích: Cloroform, n-hexan, Ethylether, Aceton, Methanol, Isopropanol, Acetonitril, chất chuẩn Q-10 (Nishin – Nhật Bản) Các loại vitamin dùng trong thử nghiệm: Vitamin B1, Viatmin B6, Vitamin B12, Vitamin B8, Viatmin E, Vitamin C, Vitamin A là các vitamin nguyên liệu dùng trong sản xuất thuốc Silicagel 60 cỡ hạt 0,015-0,04 mm – Merck (Đức) Silicagel F254-Merck (Đức), loại bản nhôm mỏng... trong môi trƣờng nuôi cấy đều đạt tiêu chuẩn sử dụng trong thí nghiệm 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 NUÔI CẤY VI KHUẨN QUANG DƢỠNG 2.3.1.1 Môi trƣờng nuôi cấy Môi trƣờng nuôi cấy và tăng sinh các chủng VKQD tía không lƣu huỳnh là môi trƣờng SA (natri acetate) do Imhoff và Truper thiết kế (1971) và đƣợc cải tiến bởi Kawasaki (1993) [1] 26 Thành phần môi trƣờng SA Natri acetate 1,0g Natri succinate 1,0g . i CHIẾT TÁCH VÀ TINH CHẾ UBIQUINONE Q1 0 TỪ VI KHUẨN QUANG DƢỠNG TÍA KHÔNG LƢU HUỲNH RHODOPSEUDOMONAS SPP Ubiquinon Q- 10 thuộc nhóm chất isoprenoid quinon hiện diện ở mọi. vi khuẩn quang dƣỡng tía không lƣu hùynh 1 1.1.3. Sản phâm từ vi khuẩn quang dƣỡng tía không lƣu huỳnh và ứng dụng 3 1.2. ĐẶC ĐIỂM CỦA VI KHUẨN QUANG DƢỠNG TÍA KHÔNG LƢU HUỲNH RHODOPSEUDOMONAS. pháp sắc ký lớp mỏng UQ, Q- 10: hợp chất ubiquinone Q- 10 VKQD: vi khuẩn quang dƣỡng 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. ĐẠI CƢƠNG VỀ VI KHUẨN QUANG DƢỠNG TÍA KHÔNG LƢU HUỲNH – HỌ RHODOSPIRILLACEAE