SỞ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH Báo cáo nghiệm thu đề tài: XÂY DỰNG VÀ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ ĐỂ XÁC ĐỊNH KIỂU GENE VIRÚT VIÊM GAN SIÊU VI C Chủ nhiệm đề tài: TS. BS. Phạm Hùng Vân PGS. TS. Nguyễn Thanh Bảo Cộng tác viên: CN. Võ Đức Xuyên An CN. Trần Quốc Việt BS. Hoàng Hiếu Ngọc ThS. Lê Thuý Quyên ( Bảng báo cáo đã được chỉnh sửa theo ý kiến của hội đồng nghiệm thu Ngày 11 tháng 08 năm 2008 ) TP. HCM 04/2008 1 TÓM TẮT ĐỀ TÀI Tên đề tài: XÂY DỰNG VÀ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ ĐỂ XÁC ĐỊNH KIỂU GENE VIRÚT VIÊM GAN SIÊU VI C Chủ nhiệm đề tài: TS. BS. PHẠM HÙNG VÂN PGS. TS. NGUYỄN THANH BẢO Cơ quan chủ trì: ĐẠI HỌC Y DƯC TP. HỒ CHÍ MINH Cơ quản quản lý: SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ MÔI TRƯỜNG Thời gian thực hiện: 07/2006 – 07/2007 Tổng kinh phí được duyệt: 190.000.000 VNĐ Kinh phí đã cấp: Lần 1: 120.000.000 VNĐ Lần 2: MỤC TIÊU ĐỀ TÀI 1. Xây dựng kỹ thuật RT-PCR để khuếch đại được đoạn gen nằm trên vùng không mã hoá 5’ NC mà trình tự của chúng có liên quan mật thiết đến kiểu gen của HCV 2. Xây dựng được kỹ thuật giải trình tự để giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR khuếch đại từ đoạn gen trên 3. Xây dựng được phương pháp so sánh với ngân hàng gen HCV để từ đó xác đònh kiểu gen của HCV (qua blast search trên internet hay trên ngân hàng dữ liệu thu thập được) 4. Phân tích tần số kiểu gen HCV trên các bệnh nhân nhiễm HCV đã và đang được điều trò đặc hiệu 2 NỘI DUNG ĐỀ TÀI ¤ Nội dung 1: Xây dựng kỹ thuật RT-PCR phát hiện HCV dựa trên vùng 5’-NC có những trình tự đặc hiệu cho kiểu gene tương tự như trình tự mà Trugene và LIPA đã nghiên cứu. ¤ Nội dung 2: Xây dưng kỹ thuật giải trình tự sản phẩm PCR của nội dung 1 trên máy giải trình tự CEQ 8000 hiện nay đang được trang bò tại công ty Nam Khoa ¤ Nội dung 3: Xây dựng thư viện các trình tự của các kiểu gene HCV từ gene bank ¤ Nội dung 4: Đònh kiểu gene các trình tự đã giải bằng các xác đònh phần trăm tương đồng với các trình tự của các kiểu gene lưu trong thư viện. So sánh kết quả đònh kiểu gene bằng thư viện đã xây dựng với kết quả đònh kiểu gene khi blast search trên thư viện HCV kiểu gene của NCBI ¤ Nội dung 5: So sánh kết quả ghi nhận được với với kết quả đònh kiểu gene HCV bằng kỹ thuật HCV-LIPA và/hay kỹ thuật giải trình tự TRUGENE của Bayer. ¤ Nội dung 6: Workshop hay seminar để phổ biến kết quả nghiên cứu và khi có yêu cầu, đưa vào áp dụng một phần tại các phòng thí nghiệm có máy PCR và áp dụng toàn diện tại các phòng thí nghiệm có máy PCR và máy sequencer TIẾN ĐỘ DỰ KIẾN THỰC HIỆN ĐỀ TÀI Nội dung 1 Nội dung: Xây dựng kỹ thuật RT-PCR phát hiện HCV dựa trên vùng 5’-NC có những trình tự đặc hiệu cho kiểu gene tương tự như trình tự mà Trugene và LIPA đã nghiên cứu. Sản phẩm: Là kit RT-PCR phát hiện HCV dựa trên vùng 5’NC dùng cho giải trình tự HCV. Thực hiện tại phòng nghiên cứu và phát triển công ty Nam Khoa phối hợp với Bộ Môn Vi Sinh, Khoa Y, ĐHYD TP. HCM Thời gian: Giai đoạn này dự kiến thực hiện trong 1 tháng (tháng 7/2006 đến 8/2006) Nội dung 2 Nội dung: Xây dưng kỹ thuật giải trình tự sản phẩm PCR của nội dung 1 trên máy giải trình tự CEQ 8000 hiện nay đang được trang bò tại công ty Nam Khoa Sản phẩm: Là mồi đặc hiệu cho phản ứng giải trình tự và qui trình giải trình tự. Thực hiện tại phòng nghiên cứu và phát triển công ty Nam Khoa, nơi có máy giải trình tự CEQ 8000 Thời gian: Giai đoạn này thực hiện trong 1 tháng (tháng 8/2006 đến 9/2006) 3 Nội dung 3 Nội dung: Xây dựng thư viện các trình tự của các kiểu gene HCV từ gene bank Sản phẩm: là thư viện cơ bản và sau đó là hoàn chỉnh HCV kiểu gene. Thực hiện tại phòng nghiên cứu và phát triển công ty Nam Khoa và Bộ Môn Vi Sinh Khoa Y, Đại Học Y Dược TP. HCM. Thời gian: Giai đoạn này thực hiện trong 2 tuần để có dữ liệu cơ bản, sau đó liên tục nhập dữ liệu mới trong suốt thời gian nghiên cứu (2 tuần cuối tháng 10/2006) Nội dung 4 Nội dung: Đònh kiểu gene các trình tự đã giải bằng cách xác đònh phần trăm tương đồng với các trình tự của các kiểu gene lưu trong thư viện. So sánh kết quả đònh kiểu gene bằng thư viện đã xây dựng với kết quả đònh kiểu gene khi blast search trên thư viện HCV kiểu gene của NCBI Sản phẩm: Sản phẩm chính là dữ liệu hoàn chỉnh cho thư viện kiểu gene HCV. Thực hiện tại phòng nghiên cứu và phát triển công ty Nam Khoa và Bộ Môn Vi Sinh Khoa Y, Đại Học Y Dược TP. HCM. Thời gian: Giai đoạn này thực hiện liên tực trong ít nhất 10 tháng (từ tháng 11/2006 tháng 8/2007) với ít nhất 200 mẫu Nội dung 5 Nội dung: So sánh kết quả ghi nhận được với với kết quả đònh kiểu gene HCV bằng kỹ thuật HCV-LIPA và/hay kỹ thuật giải trình tự TRUGENE của Bayer. Sản phẩm: Sản phẩm chính là qui trình hoàn chỉnh đònh kiểu gene HCV băng kỹ thuật giải trình tự. Thực hiện tại phòng nghiên cứu và phát triển công ty Nam Khoa Thời gian: Giai đoạn này được thực hiện rải rác trong suốt thời gian nghiên cứu Nội dung 6 Nội dung: Workshop hay seminar để phổ biến kết quả nghiên cứu và khi có yêu cầu, đưa vào áp dụng một phần tại các phòng thí nghiệm có máy PCR và áp dụng toàn diện tại các phòng thí nghiệm có máy PCR và máy sequencer Sản phẩm: Sản phẩm chính là phổ biến và chuyển giao. Thực hiện tại sở Khoa Hoc công Nghệ TP. HCM Thời gian: Nội dung này dự kiến thực hiện vào tháng 6 năm 2007 trước khi kết thúc đề tài 4 KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI Xây dựng và áp dụng kỹ thuật giải trình tự để xác đònh kiểu gene virút viêm gan C Đặt vấn đề Xác đònh kiểu gene virút viêm gan C (HCV) là một chỉ đònh rất cần thiết trước khi bác só điều trò tiến hành cho chỉ đònh điều trò đặc hiệu viêm gan C vì thời gian điều trò kéo dài bao lâu là tuỳ thuộc vào type virút viêm gan C mà bệnh nhân đang nhiễm [1] . Hiện nay, trên thế giới có 2 phương pháp xác đònh kiểu gene viêm gan C dựa vào phân tích một vùng đặc trưng trên vùng 5’NC của bộ gen HCV đã được nhiều nhà nghiên cứu cũng như lâm sàng chấp nhận và được thực hiện tại các phòng thí nghiệm lâm sàng, đó là phương pháp lai trên vạch dò đặc hiệu kiểu gene C (HCV-InoLIPA) [2] và phương pháp giải trình tự trên máy Trugene [3] . Tuy nhiên vì hai phương pháp này phải dựa trên các hệ thống thiết bò và thuốc thử phụ thuộc hoàn toàn vào các nhà sản xuất (chúng ta thường gọi là hệ thống kín) nên có giá thành khó có thể được chỉ đònh sử dụng rộng rãi dù tại Việt Nam tỷ lệ lưu hành HCV là khá cao trên thế giới (5-8% người bình thường có nhiễm HCV) [4,5] và dó nhiên đi kèm theo đó là số lượng bệnh nhân bò viêm gan mạn tính cần phải được điều trò và theo dõi điều trò khá cao do nhiễm HCV có thể dẫn đến một tỷ lệ khá cao bò xơ gan và ung thư gan (4%) [6] . Để có thể giúp các nhà lâm sàng có thể cho chỉ đònh xác đònh kiểu gene HCV dễ dàng hơn, việc tìm kiếm một kỹ thuật xác đònh kiểu gene HCV mà không phải sử dụng kỹ thuật giải trình tự của Trugene và kỹ thuật InoLIPA với giá thành thấp hơn mà vẫn đạt độ chính xác và nhạy cảm cao là một việc làm rất cần thiết và đây cũng mục tiêu chính của đề tài nghiên cứu này của chúng tôi. Tổng quan Virút viêm gan C (HCV) là một loại virút RNA sợi đơn, dương, có kích thước 50nm (hình 1), thuộc gia đình Flaviviridae, giống Hepacivirút. Về cấu trúc, virút có dạng hình cầu, có vỏ bọc là lipid chèn trên đó hai loại glycoprotein là E1 và E2 [7] (hình 2). Bộ gene của virút là một RNA sợi đơn dài khoảng 9600bp [8] . Hai đầu 5’ và 3’ của sơi đơn RNA của virút không mã hoá thông tin di truyền và được gọi là vùng UTR (un-translated region) hay NC (non coding). Giữa hai đầu không mang thông tin di truyền này là vùng mang các gene mã hoá các protein cấu trúc C cho proteine tạo nucleocapsid của cirút, E1 và E2 cho glycoproteine của vỏ bọc; và các protein không cấu trúc NS1 và NS2 cho các proteine xuyên màng, NS3 cho các protease và Hình 1: Hình chụp qua KHV điện t virút viêm gan C ử 5 RNA helicase, NS4A và NS4B cho các protein đồng yếu tố, NS5A cho các protein kháng interferon, và NS5B cho RNA polymerase (hình 3). Hình 3: Cấu trúc bộ gene của virút viêm gan C Hình 2: Hình vẽ mô tả cấu trúc của HCV Virút viêm gan C xâm nhập vào cơ thể người bệnh qua đường máu, tình dục. Sau khi xâm nhập và cơ thể, HCV sẽ bám vào các thụ thể CD81 và SR-BI (scavenger receptor class B1) trên tế bào để xâm nhập vào tế bào gan (hình 4). Sau khi xâm nhập, virút sẽ bắt đầu quá trình nhân bản bằng cách trước tiên sẽ dòch mã từ bộ gene của nó để tổng hợp một protein đầu tiên 3011AA, rồi proteine sẽ được các protease của tế bào chủ và của virút phân cắt thành 3 loại proteine cấu trúc (C và E) và 7 loại proteine không cấu trúc (NS). Sau đó virút hoàn chỉnh sẽ được thành lập từ các thành phần đã được tổng hợp và quá trình hoàn chỉnh virút được xãy ra trong lưới nội sinh chất và bộ golgi của tế bào để cuối cùng các virút hoàn chỉnh được liên tục phóng thích khỏi tế bào nhiễm virút để tiếp túc xâm nhập và các tế bào gan mới [9] . Virút một khi đã xâm nhập vào cơ thể thì sẽ có khả năng nhân bản khá cao, có thể đến 3 tỷ được nhân bản trong mỗi ngày. Hình 4: Hình mô tả quá trình xâm nhập và nhân bản tron g tế bào g an Dựa trên sự khác biệt về di truyền, virút viêm gan C được phân biệt thành 6 kiểu gene với nhiều subtype cho mỗi kiểu gene [10] . Ngoài ra, đối với từng subtype HCV lại có thể được phân thành các quasi-species do sự đa dạng về di truyền của trình tự gene của virút do sự nhân bản của virút không có cơ chế sửa sai (proof reading) trên men RNA polymerase của virút. Chính điều này đã giúp virút trốn thoát được các cơ chể miễn dòch loại trừ của cơ thể. 6 Nhiễm virút viêm gan C là một vấn đề rất cần được quan tâm hiện nay, đặc biệt tại Việt Nam. Theo ghi nhận về tình hình nhiễm viêm gan C thì tỷ lệ người bình thường ở Việt Nam nhiễm virút viêm gan C là khoảng 5-10% [11] , xem như là thuộc nhóm các quốc gia có tỷ lệ nhiễm virút viêm gan C cao thứ nhì trên thế giới. Khác với nhiễm viêm gan B với đa số các trường hợp người nhiễm tạo được kháng thể bảo vệ loại trừ được virút hay là một số ít hơn trở thành người lành mang trùng; có đến 85% người nhiễm viêm gan virút C bò diễn tiến đến viêm gan mạn tính rồi đến xơ gan với 20% trong số đó có nguy cơ diễn tiến đến ung thư gan [12] . Do vậy mà dù tỷ lệ người nhiễm viêm gan C tại Việt Nam thấp hơn nhiễm viêm gan B nhưng tình trạng bệnh tật do nhiễm virút viêm gan C mang lại là khá cao, không thua mà thậm chí còn hơn viêm gan B. Nguy hiểm như vậy nhưng bệnh viêm gan C mạn tính lại là một bệnh mà dưới ánh sáng của y học hiện đại lại là một bệnh có thể chữa khỏi được hoàn toàn với xác suất thành công có thể đến 60%. Tuy nhiên, để có thể cho được chỉ đònh điều trò đặc hiệu viêm gan C mạn tính, theo hội nghò đồng thuận của các nhà chuyên môn vào năm 2002 (biểu đồ 1), bác só cần phải xác đònh là bệnh nhân đang mang virút viêm gan C trong máu bằng xét nghiệm đònh tính HCV-RNA [1,13] vì xét nghiệm anti-HCV chỉ là xét nghiệm sàng lọc trong cho và truyền máu chứ không phải là xét nghiệm trong chẩn đoán lâm sàng, hơn nữa một người có kếtquả anti-HCV [+] vẫn có thể không mang virút viêm gan C mà chỉ là kết quả của tình trạng nhiễm mầm bệnh trước đó và nay đã khỏi. Sau khi xác đònh được người bệnh dương tính HCV-RNA, trước khi cho chỉ đònh điều trò bác só cần phải làm thêm hai xét nghiệm nữa là đònh lượng HCV-RNA [1,13] và đònh genotype của virút [1,13] . Lý do là vì bác só cần phải đánh giá hiệu quả điều trò mà mình đã cho trên bệnh nhân sau 3 tháng điều trò và phương pháp đánh giá là đònh lượng lại HCV-RNA. Nếu kết quả đònh lượng cho thấy lượng virút giảm trên 100 lần (trên hay bằng 2 log) thì điều trò đã cho là hiệu quả và có thể tiếp tục. Nếu lượng virút không giảm quá 2 log thì có thể phương pháp điều trò đã cho trên bệnh nhân là không hiệu quả và cần phải cân nhắc để điều chỉnh (dùng loại interferon α khác có dược động và dược lực tốt hơn, bắt buộc bệnh nhân phải tuân thủ hơn ). Để quyết đònh thời gian điều trò là bao lâu thì bác só cần phải biết genotype của HCV trên bệnh nhân [1,13] , nếu là genotype 1 thì cần phải duy trì thời gian điều trò là 48 tuần hay hơn, còn nếu thuộc genotype khác thì thời gian điều trò có thể ngắn hơn là 24 tuần. Sau khi hoàn tất thời gian cần phải điều trò trên bệnh nhân, trước khi quyết đònh ngưng điều trò, bác só cần phải xác đònh xem bệnh nhân đã sạch HCV-RNA chưa bằng xét nghiệm đònh tính HCV-RNA và chỉ ngưng điều trò khi HCV-RNA hoàn toàn âm tính. Sau khi đã ngưng điều trò, vì bệnh nhân đã sạch virút, bác só vẫn phải khuyến cáo bệnh nhân làm xét nghiệm đònh đính HCV-RNA mỗi 3 tháng một lần để theo dõi xem bệnh nhân có bò tái phát không. Bất cứ lúc nào HCV-RNA dương tính lại thì đó là dấu Biểu đồ 1: Biểu đồ hướng dẫn chỉ đònh và theo dõi hiệu quả điều trò đặc hiệu bệnh nhân viêm g an virút C mạn tính 7 hiệu tái phát và khi ấy có thể bác só phải xem xét điều trò lại cho bệnh nhân và cũng phải theo thực hiện lại qui trình xét nghiệm như trên. Như vậy, chúng ta thấy rằng hai xét nghiệm đònh lượng và đònh kiểu gene HCV là hai xét nghiệm rất cần thiết phải được bác só chỉ đònh trên bệnh nhân nhiễm HCV trước khi quyết đònh điều trò đặc hiệu. Để đònh lượng HCV-RNA, hiện nay có rất nhiều kit xét nghiệm đã được thương mại hoá dựa trên kỹ thuật PCR (Roche Amplicor) [14] , hay real-time PCR (Cobas taqman của Roche) [15] , bDNA (của Bayer) [16] . Đối với kỹ thuật real-time PCR, nhờ là hệ thống mở nên đã có nhiều nhà khoa học trong nước (Đại Học Y Dược, Công ty Nam Khoa, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên ) phát triển được kỹ thuật này áp dụng trong phát hiện và đònh lượng HCV-RNA, và chính nhờ vậy mà xét nghiệm đònh lượng HCV-RNA hiện đang được triển khai sử dụng rộng rãi tại nhiều phòng thí nghiệm trong nước có trang bò real-time PCR (Meid, Hoàn Mỹ, Đại Học Y Dược, BV. Bạch Mai, Bệnh viện 108, Học viện quân y 103, phòng thí nghiệm NK-Biotek ). Đối với xét nghiệm đònh kiểu gene HCV, hiện nay chỉ có hai kit được thương mại hoá là kit InoLIPA dựa trên kỹ thuật lai trên vạch tẫm các mẫu dò đặc hiệu [2] và kit Trugene dựa trên kỹ thuật giải trình tự một đoạn đặc hiệu trên vùng 5’NC của bộ gene virút [3] . Ngoài ra cũng có những phương pháp tiếp cận khác được các nhà khoa học thử nghiệm như phương pháp giải trình tự vùng NS5B [17] , phương pháp real-time PCR [18] , hay phương pháp PCR với mồi đặc hiệu. Tuy nhiên các phương pháp này chỉ trong phạm vi nghiên cứu và chỉ giới hạn trong giá trò học thuật chứ chưa được ứng dụng rộng rãi vì có những hạn chế nhất đònh, đặc biệt là độ nhạy. Tại Việt Nam hiện nay, cả hai phương pháp giải trình tự và InoLIPA đều đã được triển khai thực hiện tại một số rất ít các phòng thí nghiệm để đáp ứng với yêu cầu xét nghiệm xác đònh kiểu gene của HCV. Tuy nhiên do giá thành của các xét nghiệm này khá đắt nên các bác só cũng rất hạn chế sử dụng. Nguyên do gía thành đắt là vì các xét nghiệm này phải được thực hiện trên các bộ thử nghiệm thương mại khá đắt tiền. Do vậy phương án để có thể triển khai xét nghiệm đònh kiểu gene HCV phục vụ cho nhu cầu lâm sàng hiện nay tại Việt Nam là phải áp dụng một hệ thống mở, và giải trình tự vùng 5’-NC tương tự hệ thống Trugene nhưng không thực hiện trên máy giải trình tự với chương trình và thuốc thử kín của Trugene mà thực hiện trên hệ thống PCR mở và máy giải trình tự mở là một tiếp cận mà chúng ta hoàn toàn có thể làm được. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện với nhiều giai đoạn, chúng tôi xin trình bày lần lượt các vật liệu và phương pháp ngiên cứu được dùng trong các giai đoạn này: Giai đoạn 1 (1) Thiết kế cho được một cặp mồi đặc hiệu được một trình tự trên vùng 5’-NC của HCV để từ đó xây dựng kỹ thuật RT-PCR cho được sản phẩm PCR tương thích với phản ứng giải trình tự CLIP của qui trình giải trình tự xác đònh kiểu gene HCV của hệ thống Trugene Để thực hiện được các nội dung của bước này, trước hết chúng tôi tham khảo một số trình tự HCV đã được giải bởi Trugene, và đồng thời tải về một số trình tự vùng 5’-NC của các kiểu gene HCV tham chiếu rồi dùng phần mềm ClustalX để so chuỗi các trình tự này với nhau từ đó làm cơ sở để thiết kế một cặp mồi phù hợp có nhiệt độ bắt cặp đích tối ưu là 58oC khuếch đại được đoạn sản phẩm PCR tương thích với mồi giải trình tự của phản ứng CLIP 8 thực hiện với kit của Trugene. Lý do chúng tôi muốn mồi có nhiệt độ bắt cặp đích là 58oC là để sau này dễ dàng cho việc xây dựng qui trình real-time PCR dùng taqman probe. Từ cặp mồi thiết kế được này, chúng tôi nghiên cứu xây dựng kỹ thuật RT-PCR phát hiện HCV dựa trên vùng 5’-NC có những trình tự đặc hiệu cho kiểu gene tương tự như trình tự mà Trugene đã nghiên cứu. Kỹ thuật RT-PCR này bao gồm các bước sau: (1) Tách chiết RNA toàn bộ từ các mẫu thử là huyết thanh hay huyết tương người bệnh bò nhiễm HCV. Phương pháp tách chiết là sử dụng bộ thuốc thử tách chiết RNA tên là RNAPREP do công ty Nam Khoa sản xuất. Bộ thuốc thử này hoạt động dựa trên nguyên tắc dùng guanidine 14M và urea, phối hợp với phenol và các chất tẩy khác để làm các chất gây biến tính các protein, kết quả là các protein bò vón lại, DNA tan trong phenol, còn RNA thì nằm lại trong phase nước và sẽ được tách ra khỏi phase phenol nhờ thêm vào chloroform và quay ly tâm lắng tách. RNA trong phase nước sau đó sẽ được kết tủa nhờ isopropanol với sự hổ trợ của tRNA và glycogen. (2) Thực hiện phiên mã ngược để tổng hợp toàn bộ các RNA tách chiết được thành cDNA. Phương pháp RT là sử dụng bộ thuốc thử tổng hợp cDNA do công ty Nam Khoa sản xuất. Bộ thuốc thử này hoạt động theo nguyên tắc sử dụng mồi ngẫu nhiên 6 nucleotides (Random hexaner primers) mà không cần dùng mồi đặc hiệu để tổng hợp toàn bộ RNA từ mẫu thử thành cDNA từ RNA nhờ men Reverse Transcriptase, sau đó cắt bỏ RNA bò bắt cặp vào cDNA sau khi phiên mã ngược thành cDNA bằng men RNAse H. (3) Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồiđã thiết kế. Phương pháp là cho 5ul cDNA vào HCV-PCR mix được pha trong PCR master mix 1.5mM Mg ++ có dUTP và UNG do công ty Nam Khoa sản xuất bổ sung thêm hai mồi trên với hàm lượng 50pm/thể tích phản ứng 50ul. Sau đó chạy chương trình PCR như sau: 40 o C/10’, 95 o C/5’, 40 chu kỳ 94 o C/15”-60 o C/30”-72 o C/1’, và cuối cùng là 72 o C/7’. Kết quả sản phẩm PCR được phát hiện bằng điện di trên thạch 2%. Để đánh giá qui trình này có khuếch đại trình tự vùng 5’NC của HCV-RNA như thiết kế mồi hay không, chúng tôi sẽ thử qui trình trên một mẫu huyết thanh HCV-RNA dương tính đã được xác đònh và lưu trữ ở điều kiện -70oC có trong phòng thí nghiệm của chúng tôi. Nếu kết qủa có sản phẩm khuếch đại đúng như thiết kế thì qui trình này có thể được xem là thành công trong khuếch đại trình tự ở vùng 5’-NC như thiết kế mồi. Để đánh giá qui trình này có cho được sản phẩm PCR tương thích với phản ứng giải trình tự CLIP của qui trình giải trình tự xác đònh kiểu gene HCV của hệ thống Trugene hay không, chúng tôi sẽ thử sản phẩm PCR của qui trình này có thể đưa vào thực hiện phản ứng giải trình tự CLIP của hệ thống Trugene hay không? Nếu được thì chứng tỏ qui trình được thiết lập không chỉ tương thích với phản ứng CLIP của Trugene mà còn có thể dùng để tạo ra sản phẩm PCR để từ đó có thể xác đònh được kiểu gene của HCV nhờ giải trình tự trực tiếp sản phẩm này và so sánh trình tự giải được với thư viện trình tự các kiểu gene HCV có sẵn. Qui trình RT-PCR sau khi nghiên cứu thành công sẽ được cung cấp cho phòng thí nghiệm DNA của Trung Tâm MEDIC sử dụng để xác đònh kiểu gene HCV trên hệ thống Trugene mà không cần phải sử dụng kit Amplicor của Roche. Kết quả sử dụng qui trình trên hệ thống Trugene để xác đònh kiểu gene HCV từ Trung Tâm Medic sẽ được ghi nhận. (2) Sau khi nghiên cứu thành công qui trình RT-PCR trên, chúng tôi sẽ nghiên cứu tiếp xem thử qui trình này có thể áp dụng cho kit InoLIPA đònh kiểu gene HCV Để có thể thực hiện được nghiên cứu này, chúng tôi sẽ gắn biotin vào mồi ngược (R) để tạo được sản phẩm PCR đánh dấu biotin rồi tiến hành lai sản phẩm này với các vạch dò đặc hiệu gắn trên que inoLIPA. Chúng tôi sẽ thử trên một số mẫu huyết thanh bệnh nhân [+] HCV-RNA đã được lưu trử ở -70oC tại phòng thí nghiệm. Kết quả lai trên các vạch dò của 9 InoLIPA xác đònh kiểu gene HCV sẽ được ghi nhận. Nếu kết quả cho được các kiểu vạch lai dương tính giúp xác đònh được kiểu gene mà không có kiểu vạch lai nào không xác đònh được kiểu gene HCV thì chứng tỏ qui trình nghiên cứu thành công được khi áp dụng trên kit InoLIPA xác đònh kiểu gene HCV. (3) Từ qui trình RT-PCR đã nghiên cứu được, nghiên cứu xây dựng qui trình RT real-time PCR dùng taqman probe Mục tiêu của nghiên cứu này là sử dụng đúng mồi đã thiết kế và sẽ thiết kế một taqman probe (HCV-probe) để nhờ đó biến RT-PCR đònh tính thành RT real-time PCR đònh lượng HCV-RNA. Probe sẽ được thiết kế có đầu 5’ gắn FAM và đầu 3’ gắn TAMRA bắt cặp rất gần mồi xuôi và cách đầu 3’ của mồi xuôi không quá 10bases. Probe này sẽ có chiều dài không quá 28bp và có nhiệt độ bắt cặp tối hảo ở 60oC. Cách thiết kế taqman probe này cũng là so chuỗi các trình tự của các kiểu gene tham chiếu để tìm trình tự bảo tồn đáp ứng được các tiêu chí đề ra ở trên. Ngoài ra, bằng một qui trình đặc biệt, chúng tôi cũng sẽ thiết kế và tạo dòng trong plasmid pGEMT-easy một chứng nội tại dùng chung mồi (IC-HCV) nhưng cho sản phẩm khuếch đại có chiều dài 40-50bps khác biệt với sản phẩm PCR đích và đã có sẵn taqman probe đặc hiệu chứng nội tại này (IC-probe) khác biệt hoàn toàn với taqman probe đích. Ngoài ra chúng tôi cũng sẽ tạo chứng nội tại là RNA (IC-HCVRNA) bằng cách phiên mã từ IC-HCV nhằm mục đích cho chứng nội tại RNA này vào với mẫu chứng [-] là huyết thanh được xác đònh [-] HCV-RNA để được tách chiết RNA, tổng hợp cDNA và khuếch đại real-time cùng với các mẫu huyết thanh thử nghiệm nhờ vậy chứng minh được toàn bộ qui trình không có bò ngoại nhiễm nếu trong chứng [-] này chỉ có tín hiệu khuếch đại của chứng nội tại, và đồng thời kiểm soát được độ nhạy các quá trình tách chiết-tổng hợp cDNA và khuếch đại real-time. Taqman probe cho chứng nội tại này đã có sẵn với đầu 5’ gắn màu huỳnh quang HEX và đầu 3’ gắn BHQ1 với các tiêu chí thích hợp cho taqman probe đã nói ở trên. Qui trình thực hiện RT-realtime PCR do chúng tôi xây dựng này cũng sẽ bao gồm các bước tách chiết RNA, tổng hợp cDNA như qui trình RT-PCR đã trình bày ở trên. Nhưng khi thực hiện real-time PCR thì sau khi cho 5ul cDNA vào HCV-realtime PCR mix (được pha như HCV-PCR mix ở trên, nhưng bổ sung thêm HCV-probe với hàm lượng 3pm và IC-probe với hàm lượng 2pm và thêm Mg++ để đạt 6mM), cho thêm 5ul chứng nôi tại (IC-HCV được pha loãng đến nồng độ LOD). Sau đó chạy chương trình realtime PCR như sau: 40oC/10’, 95oC/5’, 40 chu kỳ 94oC/15”-60oC/30” trong đó lấy tín hiệu realtime ở giai đoạn 60oC với hai kênh màu FAM và HEX. Trong kỹ thuật này, chúng tôi cũng đã xây dựng được chuẩn là sản phẩm PCR đích được dòng hoá vào plasmid và được đònh lượng số copies sau khi đã tách chiết. Để đánh giá qui trình real-time có thành công như mong muốn hay không, chúng tôi sẽ thử nghiệm trên một số mẫu huyết thanh [+] HCV-RNA và [-] HCV-RNA được lưu trữ ở -70oC có trong phòng thí nghiệm. Tiêu chí xác đònh qui trình thành công là đường chuẩn xây dựng với 5 nồng độ chuẩn đạt R>0.990 và E nằm trong khoảng 90-105%. Ngoài ra mẫu [+] phải cho biểu diễn khuếch đại với kênh màu FAM, còn mẫu [-] không có biểu diễn khuếch đại với kênh màu FAM nhưng phải cho biểu diễn khuếch đại với kênh màu HEX. Giai đoạn 2 Xây dựng kỹ thuật giải trình tự sản phẩm RT real-time PCR trên máy giải trình tự CEQ 8000 hiện nay đang được trang bò tại công ty Nam Khoa để xác đònh kiểu gene HCV 10 [...]... ggcctggaggctgtacgacactcatactaacgccatggctagac actactcggctagcagtctcgcgggggcacgcccaaatctccaggcattgagcgggttgatccaagaaag gacccggtcgtcctggcaattccggtgtactcaccggttccgcagaccactatggctctcccgggaggggg ggtcctggaggctgcacgacactcatactaacgccatggctagacgctt tcgcgctagcagtctcgcgggggcacgcccaaatctccaggcattgagcgggttgatccaagaaaggac ccggtcgtcctggcaattccggtgtactcaccggttccgcagaccactatggctctccggagggggggtcct ggaggctgcacgacactcatactaacgccatggctagacgctttctgca... ggaggctgcacgacactcatactaacgccatggctagacgctttctgca actactcggctagcagtcttgcgggggcacgcccaaatctccagagcattgagcgggtgaatccaagaaa ggacccggtcgtcctggcaattccggtgtactcaccggttccgcagaccactatggctctcccgggagggg gggtcctggaggctgcacgacactcatactaacgccatggctagacgctt tcggctagcagtcttgcgggggcacgcccaaatctccaggcatgtgagcgggtttgatccaatggaaagg acccggtcatcctggcaattccggtgtactcaccggttccgcagaaccactatggctctcccgggaggggg gggcctggaggctgtacgacactcatactaacgccatggctaaacgcttt... gggcctggaggctgtacgacactcatactaacgccatggctaaacgcttt gctactcggctagcagtctgcgggggcacgcccaaatctccaggcattgagcgggtttgatccaatggaa aggacccggtcatcctggcaattccggtgtactcaccggttccgcagaccactatggctctcccgggaggg gggggcctggaggcgtgtacgacactcatactaactccatggctagacgcttt tctcgcgggggcacgcccaaatctccaggcatgtgagcgggtgtttatccaagaaaggacccggtcgtcct ggcaattccggtgtactcaccggttccgcagaccactatggctctcccgggagggggggtcctggaggct gcacgacactcatactaacgccatggcta cgggggcacgcccaaatgaccggaacattagagtgggtttatccaagaaaggacccagtctttccggcaa... (Trugene) 1 2a 2 2a 3 1b 4 1b 5 1c 6 6a 7 6a 8 1a 9 2b 10 3a Kiểu gene (blast search) gctagcagtcttgcgggggcacgcccaaatggccgggcatagagtgggtttatccaagaaaggacccag tcttcccggcaattccggtgtactcaccggttccgcagaccactatggctctcccgggaggggggggcctg gaggctgtacgacactcatactaacgccatggctagacgctt ctactcggctagcagtcttgcgggggcacgcccaaatggccgggcatagagtgggtttatccaagaaagg acccagtcttcccggcaattccggtgtactcaccggttccgcagaccactatggctctcccgggagggggg... gcacgacactcatactaacgccatggcta cgggggcacgcccaaatgaccggaacattagagtgggtttatccaagaaaggacccagtctttccggcaa ttccggtgtactcaccggttccgcagaccactatggctctcccgggaggggggggcctggaggctgtacg acactcatactaacgccatggctagacgct ctcggctagtgatctcgcgggggcacgcccaaatttctgggtattgagcgggttgttccaagaaaggaccc ggtcaccccagcgattccggtgtactcaccggttccgcagaccactatggctctcccgggagggggggtc ctggaggctgcacgacactcgtactaacgccatggctagacgct 19 2a 2a 1b 1b 1c 6a 6a 1a 2b 3a Hình... Trugene Giai đoạn 3 Xây dựng thư vi n c c trình tự c a c c kiểu gene HCV từ gene bank Để th c hiện nội dung này, chúng tôi vào genebank để load trình tự c a phần 5’NC c a HCV genome tham chiếu rồi đưa vào thư vi n local blast c a phần mềm Bioedit Thư vi n nay sẽ liên t c đư c cập nhật với c c trình tự mà chúng tôi giải đư c và đònh kiểu gene đư c Giai đoạn 4 Thử độ chính x c c a vi c sử dụng thư vi n... Thư vi n hiện nay c ng đang đư c liên t c đư c cập nhật với c c trình tự mà chúng tôi giải đư c và đònh kiểu gene đư c nếu gặp những kiểu gene kh c biệt với c c kiểu gene thường gặp trên Giai đoạn 4 Thư vi n kiêu gen HCV trong thu m c Database c a Bioedit 21 Hình 14: Thư vi n c c kiểu gene HCV trong thư m c database c a Bioedit Đã chứng minh độ chính x c c a vi c sử dụng thư vi n c c kiểu gene HCV đã... Trugene và cho giải trình tự tr c tiếp tất c sản phẩm PCR c a 10 mẫu trên bằng qui trình giải trình tự với mồi giải trình tự đã thiết kế Sau khi c trình tự c a 10 mẫu sản phẩm PCR, chúng tôi sẽ làm blast search trên thư vi n kiểu gene HCV để x c đònh kiểu gene HCV c a c c mẫu thử Kết quả đư c xem là đạt khi kiểu gene HCV thu nhận đư c từ blast search trùng khớp với kiểu gene HCV đã x c đònh đư c nhờ... đư c B c Só lâm sàng cho chỉ đònh xét nghiệm để đư c điều trò đ c hiệu Tổng kết c c kết quả để biết tỷ lệ phân bố c c kiểu gene HCV trên c c bệnh nhân này Kết quả nghiên c u Giai đoạn 1 (1) Đã thiết kế đư c một c p mồi đ c hiệu đư c một trình tự trên vùng 5’-NC c a HCV để từ đó xây dựng kỹ thuật RT-PCR cho đư c sản phẩm PCR tương thích với phản ứng giải trình tự CLIP c a qui trình giải trình tự x c. .. chương trình thích hợp cho sản phẩm PCR đoạn ngắn và với chế độ phân tích là giải trình tự (5) Đònh kiểu gene HCV trình tự giải đư c: Để c đư c một trình tự chuẩn nhất, trình tự giải đư c từ máy sẽ đư c phân tích bằng c ch chọn chế độ phân tích đoạn PCR kích thư c ≤200bp và triming 2 đầu Kết quả đư c xuất qua chế độ report để từ đó dễ dàng copy sang đònh dạng MS Trình tự đư c copy sẽ đư c blast search . ctactcggctagcagtcttgcgggggcacgcccaaatggccgggcatagagtgggtttatccaagaaagg acccagtcttcccggcaattccggtgtactcaccggttccgcagaccactatggctctcccgggagggggg ggcctggaggctgtacgacactcatactaacgccatggctagac 2a 3 1b actactcggctagcagtctcgcgggggcacgcccaaatctccaggcattgagcgggttgatccaagaaag gacccggtcgtcctggcaattccggtgtactcaccggttccgcagaccactatggctctcccgggaggggg ggtcctggaggctgcacgacactcatactaacgccatggctagacgctt. actactcggctagcagtctcgcgggggcacgcccaaatctccaggcattgagcgggttgatccaagaaag gacccggtcgtcctggcaattccggtgtactcaccggttccgcagaccactatggctctcccgggaggggg ggtcctggaggctgcacgacactcatactaacgccatggctagacgctt 1b 4 1b tcgcgctagcagtctcgcgggggcacgcccaaatctccaggcattgagcgggttgatccaagaaaggac ccggtcgtcctggcaattccggtgtactcaccggttccgcagaccactatggctctccggagggggggtcct ggaggctgcacgacactcatactaacgccatggctagacgctttctgca. gctagcagtcttgcgggggcacgcccaaatggccgggcatagagtgggtttatccaagaaaggacccag tcttcccggcaattccggtgtactcaccggttccgcagaccactatggctctcccgggaggggggggcctg gaggctgtacgacactcatactaacgccatggctagacgctt 2a 2 2a ctactcggctagcagtcttgcgggggcacgcccaaatggccgggcatagagtgggtttatccaagaaagg acccagtcttcccggcaattccggtgtactcaccggttccgcagaccactatggctctcccgggagggggg ggcctggaggctgtacgacactcatactaacgccatggctagac