ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu) ỨNG DỤNG KỸ THUẬT QF-PCR VÀO CHẨN ĐOÁN NHANH TRƯỚC SINH RỐI LOẠN SỐ LƯỢNG NHIỄM SẮC THỂ Ở NGƯỜI CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI (Ký tên) NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN PHÙNG NHƯ TOÀN CƠ QUAN QUẢN LÝ CƠ QUAN CHỦ TRÌ SỞ KH&CN TP.HCM BỆNH VIỆN TỪ DŨ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) (Ký tên/đóng dấu xác nhận) THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 8/2013 CÁM ƠN Để thực hiện thành công đề tài này, nhóm nghiên cứu đã nhận được sự tham gia, hỗ trợ và giúp đỡ quý báu của các bệnh nhân, đồng nghiệp và các tổ chức. Nhóm nghiên cứu xin trân trọng cám ơn: - Sở Khoa học và Công nghệ đã cấp một phần kinh phí để thực hiện đề tài. - Ban Giám đốc và các đồng nghiệp ở Đơn vị Chẩn đoán trước sinh, Khoa Khám bệnh, các khoa chuyên môn và các phòng chức năng của Bệnh viện Từ Dũ đã tạo điều kiện mọi mặt để đề tài được triển khai và đạt kết quả tốt. - Giáo sư Bác sĩ The-Hung Bui và Bệnh viện Karolinska, Stockholm, Thụy Điển đã giúp đỡ về mặt kỹ thuật và các tài liệu tham khảo. - Đặc biệt cám ơn vì sự hiểu biết và tham gia của các gia đình bệnh nhân, yếu tố quyết định cho sự thành công của đề tài. TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Lệch bội là nguyên nhân quan trọng gây ra sẩy thai và dị tật bẩm sinh. QF- PCR là kỹ thuật mới trong chẩn đoán trước sinh nhằm phát hiện và can thiệp sớm thai bị các bất thường này. Mục tiêu của nghiên cứu này là: (1) lựa chọn các locus STR thích hợp cho phản ứng QF-PCR để phát hiện các trường hợp lệch bội nhiễm sắc thể 21, 18, 13, X, Y; (2) xác định tỉ lệ hiện diện của các alen, độ dài và mức độ dị hợp tử của các locus STR được lựa chọn; (3) xác định độ tương hợp kết quả QF-PCR với kết quả karyotype tế bào dịch ối và xác định độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương và tiên đoán âm của phương pháp QF-PCR. Đối tượng và phương pháp của nghiên cứu là 400 trường hợp thai có nguy cơ cao bị rối loạn nhiễm sắc thể đã được tầm soát phát hiện qua tiền căn sinh con dị tật bẩm sinh, xét nghiệm và siêu âm sẽ được chọc ối và chẩn đoán trước sinh nhiễm sắc thể 13, 18, 21, X, Y bằng kỹ thuật QF-PCR và so sánh kết quả với kỹ thuật tiêu chuẩn vàng là karyotype. Kết quả nghiên cứu đã xác định được các locus STR thích hợp cho phản ứng QF-PCR để phát hiện các trường hợp lệch bội nhiễm sắc thể số 13 (D13S252, D13S305, D13S634, D13S742, D13S800), số 18 (D18S386, D18S535, D18S976, D18S978, D18S1002, D18S1364, GATA178F11), số 21 (D21S11, D21S1411, D21S1435, D21S1442, D21S1444, D21S2055) và nhiễm sắc thể giới tính (DXYS267 DXS1187 DXS981 XHPRT DXS2390). Đây là các locus STR có từ 5 đến 30 loại alen với tỉ lệ dị hợp tử cao trên 70%. Mức độ tương hợp giữa kết quả bình thường và bất thường của kỹ thuật QF-PCR với kết quả karyotype là 100%. Kỹ thuật QF-PCR có độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương, giá trị tiên đoán âm đều đạt 100%. Khả năng trả lời kết quả cho các mẫu xét nghiệm bằng QF-PCR là 99,5% với thời gian trung bình từ 36 đến 48 giờ. SUMMARY OF RESEARCH CONTENT Aneuploidy is an important issue causing miscarriage and congenital abnormalities. QF-PCR is a new method in prenatal diagnosis of those disorders. Objectives of the study were (1) to chose appropriate STR loci for QF-PCR to detect aneuploidy of chromosome 21, 18, 13, X, Y; (2) to explore the rate and size of alleles and heterozygosity of chosen STR loci; (3) to evaluate the concordance between QF-PCR and karyotype of amniocyte and the sensitivity, specificity, positive predictive value and negative predictive value of QF-PCR. The study included 400 pregnancies detected at high risk of chromosome disorders via history of congenital abnormalities or biochemistry and ultrasound screening were performed amniocentesis and analysed chromosome 13, 18, 21, X and Y with QF-PCR and compared to gold standard karyotype. The study has identified appropriate STR loci for QF-PCR to detect aneuploidy of chromosome 13 (D13S252, D13S305, D13S634, D13S742, D13S800), 18 (D18S386, D18S535, D18S976, D18S978, D18S1002, D18S1364, GATA178F11), 21 (D21S11, D21S1411, D21S1435, D21S1442, D21S1444, D21S2055) and sex chromosomes (DXYS267 DXS1187 DXS981 XHPRT DXS2390). Those STR loci had 5 to 30 types of allele with heterozygosity higher than 70%. Either normal or abnormal results were 100% concordant between QF- PCR and karyotype. The specificity, positive predictive value and negative predictive value of QF-PCR were 100%. QF-PCR could produce conclusion in 99.5% of cases with average turn around time 36 to 48 hours. THÔNG TIN TÓM TẮT ĐỀ TÀI 1. Tên đề tài: Ứng dụng kỹ thuật QF-PCR vào chẩn đoán nhanh trước sinh rối loạn số lượng nhiễm sắc thể ở người. 2. Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Khắc Hân Hoan và Phùng Như Toàn. 3. Cơ quan chủ trì: Bệnh viện Từ Dũ. 4. Thời gian thực hiện đề tài: 8/2010 – 6/2013. 5. Kinh phí được duyệt: 320.000.000 đồng. 6. Kinh phí đã cấp: 288.000.000 đồng. - Cấp đợt 1: 200.000.000 đồng theo thông báo số : 128 /TB-SKHCN ngày 16/8/2010. - Cấp đợt 2: 88.000.000 đồng theo thông báo số: 19 /TB-SKHCN ngày 8/5/2013. 5. Mục tiêu: - Lựa chọn các locus STR thích hợp cho phản ứng QF-PCR để phát hiện các trường hợp lệch bội nhiễm sắc thể 21, 18, 13, X, Y. - Xác định tỉ lệ hiện diện của các alen, độ dài và mức độ dị hợp tử của các locus STR được lựa chọn. - Xác định độ tương hợp kết quả QF-PCR với kết quả karyotype tế bào dịch ối và xác định độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương và tiên đoán âm của phương pháp QF- PCR. 6. Nội dung thực hiện (đối chiếu với hợp đồng đã ký): TT Công việc yêu cầu thực hiện theo HĐ Ghi chú 1 Lựa chọn các locus STR thích hợp cho phản ứng QF-PCR để phát hiện các trường hợp lệch bội nhiễm sắc thể 21, 18, 13, X, Y. Đã thực hiện xong 2 Xác lập quy trình và thực hiện kỹ thuật QF-PCR trên tế bào dịch ối. Yêu cầu: - Quy trình kỹ thuật QF-PCR được Hội đồng khoa học bệnh viện phê duyệt và đưa vào thực hiện thường quy. - Thực hiện kỹ thuật QF-PCR đủ 400 mẫu có kết quả karyotype đạt yêu cầu. Đã thực hiện xong 3 Nuôi cấy tế bào ối và phân tích karyotype để làm cơ sở đối chứng với QF-PCR. Yêu cầu: Thực hiện nuôi cấy tế bào ối và phân tích karyotype đủ 400 mẫu có kết quả đạt yêu cầu. Đã thực hiện xong 4 Thống kê và cập nhật dữ liệu, viết báo cáo chuyên đề: - Xác định tỉ lệ hiện diện của các alen và mức độ dị hợp Đã thực hiện xong tử của các locus STR được lựa chọn; - Thống kê tần suất các loại lệch bội nhiễm sắc thể; - Báo cáo phân tích sự tương quan giữa kỹ thuật QF-PCR và karyotype. 5 Báo cáo nghiệm thu cấp cơ sở (bệnh viện Từ Dũ) Đang thực hiện 6 Báo cáo tổng kết nghiệm thu cấp quản lý Yêu cầu: Báo cáo toàn văn, báo cáo tóm tắt, đĩa CD. Đang thực hiện 7. Sản phẩm của đề tài TT Tên sản phẩm Ghi chú 1 Báo cáo tổng kết (toàn văn và tóm tắt, tài liệu và CD) (được trình bày trong báo cáo này) Theo yêu cầu HĐ 2 Quy trình kỹ thuật QF-PCR trên tế bào dịch ối trong chẩn đoán trước sinh rối loạn nhiễm sắc thể (1 tập tài liệu hướng dẫn chi tiết toàn bộ quy trình). (được trình bày trong phụ lục sản phẩm) Theo yêu cầu HĐ 3 1 báo cáo chuyên đề “Thống kê tần suất các loại lệch bội nhiễm sắc thể”. (được trình bày trong phụ lục sản phẩm) Theo yêu cầu HĐ 4 1 báo cáo chuyên đề “Xác định tỉ lệ hiện diện của các alen và mức độ dị hợp tử của các locus STR được lựa chọn”. (được trình bày trong phụ lục sản phẩm) Theo yêu cầu HĐ 5 1 báo cáo phân tích sự tương quan giữa kỹ thuật QF-PCR và karyotype. (được trình bày trong báo cáo này) Theo yêu cầu HĐ 6 1 bài báo khoa học (Đăng trên tạp chí khoa học và báo cáo tại hội nghị khoa học chuyên ngành). (được trình bày trong phụ lục sản phẩm) Theo yêu cầu HĐ 7 Đào tạo 2 thạc sĩ sinh học chuyên ngành di truyền từ đề tài này. (được trình bày trong phụ lục sản phẩm) Ngoài yêu cầu HĐ 8 Tổ chức 1 hội thảo chuyên đề: Chẩn đoán trước sinh và kỹ thuật QF-PCR. (được trình bày trong phụ lục sản phẩm) Ngoài yêu cầu HĐ I MỤC LỤC Mục lục I Danh sách các chữ viết tắt II Danh sách các bảng III Danh sách các hình VI Danh sách các lưu đồ VI PHẦN MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Các rối loạn nhiễm sắc thể thường gặp 3 1.2. Các phương pháp lấy mẫu chẩn đoán trước sinh 7 1.3. Kỹ thuật di truyền trong chẩn đoán trước sinh 10 1.4. Tình hình nghiên cứu chẩn đoán trước sinh rối loạn nhiễm sắc thể ở Việt Nam 21 CHƯƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1. Đối tượng nghiên cứu 23 2.2. Phương pháp nghiên cứu 24 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 37 3.1. Đặc điểm của các đối tượng nghiên cúu 37 3.2. Các locus str trong phản ứng QF-PCR 38 3.3. Đặc điểm các locus str 42 3.4. Kết quả QF-PCR so với kết quả Karyotype 51 Cùng hợp tử 57 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 59 Tài liệu tham khảo II DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT THUẬT NGỮ TIẾNG VIỆT bp base pair: cặp base CĐTS chẩn đoán trước sinh CGH Comparative Genomic Hybridization: lai bộ gen so sánh CMV Cytomegalovirus DHT dị hợp tử DNA Deoxyribonucleic Acid DTBS dị tật bẩm sinh EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid FBS Fetal Bovine Serum: huyết thanh thai bò FISH Fluorescence in situ Hybridization: lai tại chỗ phát huỳnh quang Hc hội chứng ISCN International System for Human Cytogenetic Nomenclature: Hệ thống quốc tế định danh di truyền tế bào người MLPA Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification NC nguy cơ NCBI National Center for Biotechnology Information: Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia NST Nhiễm sắc thể PCR Polymerase Chain Reaction QF–PCR Quantitative Fluorescence Polymerase Chain Reaction rfu relative fluorescent unit: đơn vị huỳnh quang tương đối STR short tandem repeat VNTR variable number tandem repeat XN xét nghiệm III DANH SÁCH CÁC BẢNG SỐ TÊN BẢNG SỐ LIỆU TRANG 1.1 So sánh một số ưu điểm và nhược điểm chính của các kỹ thuật 17 1.2 Kết quả các nghiên cứu chẩn đoán lệch bội trước sinh bằng QF-PCR 18 1.3 Đặc điểm các các bộ kit QF-PCR chẩn đoán lệch bội phổ biến 20 2.1 Các locus đặc hiệu nhiễm sắc thể được khảo sát trong các phản ứng 31 2.2 Các locus đặc hiệu nhiễm sắc thể được khảo sát thêm khi cần thiết 32 2.3 Đánh giá tỉ số giữa các alen trong cùng một locus 35 3.1 Đặc điểm của các đối tượng nghiên cứu. 37 3.2 Các locus bị loại ra và các locus STR được thêm vào ở phiên bản 2 40 3.3 Độ dài của các locus str so với công bố trên NCBI 43 3.4 Độ dị hợp tử của các locus STR 44 3.5 Tần suất alen của các locus NST 13 46 3.6 Tần suất các loại alen của các locus NST 18 49 3.7 Tần suất alen của các locus NST 21 50 3.8 Tần suất alen của các locus NST giới tính 51 3.9 Kết quả chẩn đoán bằng QF-PCR theo tuổi thai phụ 52 3.10 Kết quả QF-PCR theo chỉ định chọc ối 52 3.11 Sự tương hợp giữa kết quả QF-PCR với kết quả karyotype 54 3.12 So sánh kết quả QF-PCR với kết quả karyotype, 2 mẫu không kết luận được xem là bình thường 57 3.13 So sánh kết quả QF-PCR với kết quả karyotype kết hợp, 2 mẫu không kết luận được xem là bất thường 57 IV DANH SÁCH CÁC HÌNH SỐ TÊN HÌNH ẢNH TRANG 1.1. Karyotype của cá thể nữ bị hội chứng Down 47,XX,+21 4 1.2. Karyotype của cá thể nữ bị hội chứng Edwards 47,XX,+18. 5 1.3 Kỹ thuật chọc hút dịch ối dưới sự hướng dẫn của siêu âm 8 1.4 Biểu diễn kết quả phân tích số lượng NST bằng QF-PCR 14 1.5 Alen 9 của locus STR có tên TH01 có trình tự lõi 4 nucleotide 14 2.1 Một số thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 27 2.2 Vị trí các locus STR trên các NST 13, 18, 21, X, Y và các NST khác 33 3.1 Các locus ở dạng dị hợp tử với tỉ số tín hiệu không kết luận được 39 3.2 Kết quả điện di theo hướng dẫn của nhà sản xuất với IV 2,5 kV, IT 20” 41 3.3 Kết quả điện di theo sau khi tối ưu với IV 2,3 kV, IT 20” 41 3.4 Nhân vi đoạn của locus 13B (D13S634) ở thai và người cha 47 3.5 Kết quả QF-PCR khảo sát đột biến vi nhân đoạt locus 13A (D13S742) ở thai phụ, người cha và thai 48 3.6 Kết quả QF-PCR và karyotype của mẫu 46,XX,dup(18) 55 3.7 Kết quả QF-PCR và FISH trường hợp monosomy X thể khảm 56 3.8 Kết quả QF-PCR mẫu ối nhiễm DNA mẹ trước (a) và sau (b) nuôi cấy 58 [...]... nghiên cứu Ứng dụng kỹ thuật QF- PCR vào chẩn đoán nhanh trước sinh rối loạn số lượng nhiễm sắc thể ở người với các mục tiêu như sau: 1 Lựa chọn các locus STR thích hợp cho phản ứng QF- PCR để phát hiện các trường hợp lệch bội nhiễm sắc thể 21, 18, 13, X, Y 2 Xác định tỉ lệ hiện diện của các alen, độ dài và mức độ dị hợp tử của các locus STR được lựa chọn 3 Xác định độ tương hợp kết quả QF- PCR với kết... hiện ngoại nhiễm DNA mẹ Vì vậy, QF- PCR đã được áp dụng vào chẩn đoán trước sinh hội chứng Down ở một số nước trên thế giới như Anh, Ý, Thụy Điển, Úc, Hồng Kông, Trung Quốc 1 Từ năm 1999, bệnh viện Từ Dũ đã sử dụng kỹ thuật karyotype vào chẩn đoán trước sinh Đến năm 2006 đã triển khai thêm kỹ thuật FISH và MLPA Hiện nay nhu cầu chẩn đoán trước sinh của xã hội ngày càng cao, số lượng chẩn đoán ngày càng... nhiều hạn chế do cần một hệ thống máy đắt tiền, không thể phát hiện ngoại nhiễm DNA từ mẹ, dễ gây dương tính giả và giá thành còn khá cao 1.3.6 Kỹ thuật QF- PCR 1.3.6.1 Nguyên tắc kỹ thuật QF- PCR Từ năm 1993, kỹ thuật QF- PCR đã được Mansfield chứng minh có thể sử dụng để chẩn đoán nhanh và chính xác tình trisomy 21 và các lệch bội NST khác [49] QF- PCR sử dụng các cặp mồi gắn huỳnh quang để khuếch đại các... ngoại nhiễm DNA của mẹ Gần đây, kỹ thuật array-CGH đã được phát triển để khảo sát nhiễm sắc thể, tuy nhiên giá thành còn khá cao Năm 1993, kỹ thuật QF- PCR khảo sát các locus STR đã được phát triển với khả năng áp dụng vào khảo sát nhanh số lượng nhiễm sắc thể QF- PCR có nhiều ưu điểm như thời gian ra kết quả nhanh, độ chính xác và độ nhạy cao, ít công lao động, giá thành thấp, năng suất cao, có thể phát... ưu điểm của mình, QF- PCR hoàn toàn có thể thay thế vai trò của kỹ thuật FISH và karyotype trong phát hiện lệch bội nhiễm sắc thể Tuy nhiên, các bộ chẩn đoán QF- PCR thương mại hiện nay đều dựa trên các locus STR của người da trắng, chưa có báo cáo nào về kỹ thuật này được triển khai ở nước ta, tính đa hình và mức độ dị hợp tử của các locus STR sử dụng trong khảo sát nhiễm sắc thể của người Việt Nam vẫn... nhận ghi lại Kết quả điện di được thể hiện dưới dạng các biểu đồ đỉnh (electrophoregram) Vị trí của đỉnh tương ứng với chiều dài và độ cao của đỉnh tương ứng với nồng độ DNA sản phẩm PCR (hình 1.4) [13] 1.4.6.4 Ưu điểm của kỹ thuật QF- PCR trong chẩn đoán trước sinh Kỹ thuật QF- PCR có nhiều ưu điểm nổi bật hơn các kỹ thuật khác: 15  Có thể sử dụng mẫu khảo sát với khối lượng mẫu rất nhỏ, khoảng 0,5 –... thành công trong việc ứng dụng kỹ thuật FISH phát hiện lệch bội NST trên mẫu gai nhau tại BVTD [9]  Năm 2011, Nguyễn Thúy Huyền và cộng sự tại Học viện Quân Y nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật QF- PCR xác định một số bất thường NST trong CĐTS mở đầu cho việc ứng dụng sinh học phân tử vào CĐTS Tuy nhiên nghiên cứu này thực hiện với số lượng mẫu nhỏ (50 mẫu) và không có đối chứng với kỹ thuật chuẩn khác [5]... hiệu, giá trị tiên đoán dương và tiên đoán âm của phương pháp QF- PCR 2 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÁC RỐI LOẠN NHIỄM SẮC THỂ THƯỜNG GẶP Các nhiễm sắc thể (NST) có thể bị đột biến về số lượng hoặc cấu trúc Bất thường có thể xảy ra trên một hay nhiều NST Các bất thường được gọi là thể đồng nhất hoặc thể thuần khi tất cả các tế bào đều mang nó và được xem là thể khảm khi chỉ một số tế bào có bất thường... tại Đơn vị Chẩn đoán trước sinh bệnh viện Từ Dũ được bác sĩ đánh giá kết quả sàng lọc trước sinh (double test, triple test, siêu âm, khoảng mờ gáy, tiền sử bản thân hoặc gia đình có rối loạn nhiễm sắc thể) Những trường hợp thai có nguy cơ cao  1/250 được bác sĩ tư vấn về chọc ối, xét nghiệm bằng kỹ thuật karyotype như thường quy và tham gia vào xét nghiệm bằng kỹ thuật QF- PCR 24 Sau thủ thuật chọc... [58] [23] [18] [17] [38] [37] [54] [56] [25] QF- PCR là phương pháp đáng tin cậy để phát hiện lệch bội và được đề nghị sử dụng độc lập để thay thế phương pháp karyotype trong nhiều trường hợp Ở Tây Ban Nha và Anh, QF- PCR được sử dụng độc lập để chẩn đoán lệch bội trước sinh mà không cần karyotype [14] Ở Canada và Thụy Điển, QF- PCR được sử dụng để khảo sát nhanh bất thường lệch bội NST 13, 18, 21, X, . nghiên cứu Ứng dụng kỹ thuật QF- PCR vào chẩn đoán nhanh trước sinh rối loạn số lượng nhiễm sắc thể ở người với các mục tiêu như sau: 1. Lựa chọn các locus STR thích hợp cho phản ứng QF- PCR để. hours. THÔNG TIN TÓM TẮT ĐỀ TÀI 1. Tên đề tài: Ứng dụng kỹ thuật QF- PCR vào chẩn đoán nhanh trước sinh rối loạn số lượng nhiễm sắc thể ở người. 2. Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Khắc Hân Hoan. sử dụng kỹ thuật karyotype vào chẩn đoán trước sinh. Đến năm 2006 đã triển khai thêm kỹ thuật FISH và MLPA. Hiện nay nhu cầu chẩn đoán trước sinh của xã hội ngày càng cao, số lượng chẩn đoán