Đang tải... (xem toàn văn)
Đặt vấn đề MỞ ĐẦU Trong khí quyển, nitơ chiếm gần 80% thể tích, tuy nhiên chúng tồn tại ở dạng khí N với liên kết cộng hóa trị rất bền vững (N≡N), thực vật không thể sử dụng trực tiếp được. Để sử dụng được nguồn đạm dồi dào này thì cần phải phá vỡ liên kết bền vững trong phân tử N 2 , tạo ra các loại đạm mà cây trồng có thể hấp thu được. Trong công nghiệp sản xuất phân bón hóa học, để phá vỡ liên kết này người ta thực 2 hiện các phản ứng hóa học dưới điều kiện nhiệt độ, áp suất rất cao và có sự tham gia của nhiều chất xúc tác, do dó, việc sản xuất phân bón bằng phương pháp này sẽ gây tốn kém, gây ô nhiễm môi trường và tác động xấu đến sức khỏe của con người. Ngày nay với sự phát triển của công nghệ sinh học trong nông nghiệp, thì việc nghiên cứu và tìm ra cách chuyển hóa để biến nguồn đạm dồi dào từ trong khí quyển vào trong đất mà không tác động đến môi trường và sức khỏe con người đã được nghiên cứu. Một trong những hướng quan trọng và hiệu quả là việc sử dụng vi sinh vật có khả năng cố định đạm nhờ hệ enzyme nitrogenase. Azotobacter là giống vi sinh vật cố định đạm tự do có khả năng làm giàu nguồn đạm trong đất - nguồn đạm cây trồng sử dụng được. Chúng có khả năng này là nhờ quá trình cố định nitơ sinh học, quá trình khử N 2 trong không khí thành NH dưới tác dụng của enzyme nitrogenase. Ngoài ra chúng còn kích thích hấp thu các chất dinh dưỡng khoáng của thực vật (NO 3 - , PO 4 3- , K + , Fe 2+ ), sản sinh ra các chất có khả năng điều hòa sinh trưởng ở thực vật (indole 3-acetic acid, indole- lactic acid…). Loài vi sinh vật trên phân bố rộng rãi trong đất và nước nhưng sự phân bố trên không đồng đều và số lượng hiện diện quá ít không đem lại hiệu quả cao. Do đó, việc phân lập, tuyển chọn chủng giống có hoạt tính cố định đạm cao để bổ sung vào đất trồng trọt là một trong những khâu quan trọng nhằm nâng cao năng suất cây trồng. Với những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu các đặc tính tăng trưởng, cố định đạm của vi khuẩn Azoterbacter – Thử nghiệm trên cây trồng”.
ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC **** ĐỖ HOÀNH QUÂN PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH TĂNG TRƯỞNG, CỐ ĐỊNH ĐẠM CỦA VI KHUẨN AZOTOBACTER – THỬ NGHIỆM TRÊN CÂY TRỒNG LUẬN VĂN THẠC SĨ CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH MÃ NGÀNH: 60.42.30 HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. PHẠM THỊ ÁNH HỒNG THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2011 i Lời cảm ơn Trong khoảng thời gian hơn một năm làm luận văn tốt nghiệp, ngoài những nỗ lực của bản thân, tôi còn nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ phía các thầy cô trong Khoa Sinh học, các thầy cô trong bộ môn Sinh hóa và quý công ty TNHH Gia Tường, giờ đây tôi đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp với rất nhiều cảm xúc khác nhau. Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến: Quý thầy cô trong Khoa Sinh học, Bộ môn Sinh hóa đã nhiệt tình giảng dậy, truyền đạt cho em kiến thức, kinh nghiệm nghiên cứu khoa học, là chìa khóa giúp em trong việc hoàn thành đề tài nghiên cứu tốt nghiệp. PGS. TS. Phạm Thị Ánh Hồng, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và định hướng cho em trong suốt thời gian em thực hiện đề tài tốt nghiêp. ThS. Nguyễn Như Nhứt, Trưởng chi nhánh Công ty TNHH Gia Tường – Bình Dương, người luôn giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Cảm ơn các anh chị và các bạn trong Chi nhánh Công ty TNHH Gia Tường luôn bên cạnh động viên giúp đỡ tôi sớm hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Con xin tỏ lòng thành kính, biết ơn sâu sắc đến cha, mẹ và gia đình luôn tạo mọi điều kiện tốt nhất để con được học hành và là điểm tựa vững chắc cho con vượt qua mọi khó khăn trong cuộc sống. Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 7 năm 2011 Đỗ Hoành Quân ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT A. Azotobacter IAA Indol acetic acid ATP Adenosin triphosphate ADP Adenosin diphosphate rH 2 Lưu lượng khí hydrogen pO 2 Áp suất khí oxygen PCR Polymerase chain reaction OD Optical density CFU Colony froming units TB Giá trị trung bình SD Độ lệch chuẩn thực nghiệm. iii DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1.1. Các con đường cung cấp đạm cho đất trong chu trình chuyển hóa nitơ 4 Bảng 1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của một số loài thuộc chi Azotobacter 11 Bảng 3.3. Giá trị pH của các mẫu đất 44 Bảng 3.4. Đặc điểm và hình dạng khuẩn lạc của các chủng phân lập được 45 Bảng 3.5. Một số đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của 20 chủng phân lập 51 Bảng 3.6. Hàm lượng nitơ cố định được (mg/l) của 20 chủng Azotobacter phân lập trên môi trường Ashby 52 Bảng 3.7. Mật độ tế bào (CFU/ml) của hai chủng Az 03 và Az 07 trên các môi trường nuôi cấy khác nhau 59 Bảng 3.8. Hàm lượng nitơ cố định được (mg/l) của hai chủng Az 03 và Az 07 cố định được trên các môi trường nuôi cấy khác nhau 61 Bảng 3.9. Mật độ tế bào (CFU/ml) của hai chủng Az 03 và Az 07 khi nuôi cấy ở các giá trị pH khác nhau 62 Bảng 3.10. Hàm lượng nitơ cố định được (mg/l) của hai chủng Az 03 và Az 07 cố định được khi nuôi cấy ở các giá trị pH khác nhau 63 Bảng 3.11. Mật độ tế bào (CFU/ml) của hai chủng Az 03 và Az 07 khi nuôi cấy trên các loại đường với các nồng độ khác nhau 65 Bảng 3.12. Hàm lượng nitơ cố định được (mg/l) của hai chủng Az 03 và Az 07 khi nuôi cấy trên các loại đường với các nồng độ khác nhau 68 Bảng 3.13. Mật độ tế bào (CFU/ml) của hai chủng Az 03 và Az 07 khi nuôi cấy trên môi trường cố bổ sung ion Mn 2+ và ion Cu 2+ ở các nồng độ khác nhau 70 Bảng 3.14. Hàm lượng nitơ cố định được (mg/l) của hai chủng Az 03 và Az 07 khi nuôi cấy trên môi trường cố bổ sung ion Mn 2+ và ion Cu 2+ ở các nồng độ khác nhau 71 Bảng 3.15. Mật độ tế bào (CFU/ml) của hai chủng Az 03 và Az 07 khi nuôi cấy ở tốc độ lắc khác nhau 74 Bảng 3.16. Hàm lượng nitơ cố định được (mg/l) của hai chủng Az 03 và Az 07 khi nuôi cấy ở tốc độ lắc khác nhau 75 iv Bảng 3.17. Mật độ tế bào (CFU/ml) của hai chủng Az 03 và Az 07 khi nuôi cấy trong môi trường có các nguồn đạm khác nhau 77 Bảng 3.18. Hàm lượng nitơ cố định được (CFU/ml) của hai chủng Az 03 và Az 07 khi nuôi cấy trong môi trường có các nguồn đạm khác nhau. 79 Bảng 3.19. Mật độ tế bào (CFU/ml) của hai chủng Az 03 và Az 07 tại các thời điểm nuôi cấy khác nhau 81 Bảng 3.20. Hàm lượng nitơ tổng cố định được (mg/l) của hai chủng Az 03 và Az 07 tại các thời điểm nuôi cấy khác nhau 82 Bảng 3.21. Hàm lượng nitơ cố định được và sự tồn tại của các chủng Azotobacter trong đất sau 45 ngày 84 Bảng 3.22. Ảnh hưởng của hỗn hợp hai chủng Az 03 và Az 07 lên sự phát triển của cây cải xanh 85 v DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ Biểu đồ 3.1. Hàm lượng nitơ tổng của 20 chủng Azotobacter cố định được trên môi trường Ashby 53 Biểu đồ 3.2. Khả năng tăng trưởng của chủng Az 03 và Az 07 trên các môi trường nuôi cấy khác nhau 60 Biểu đồ 3.3. Khả năng cố định nitơ của chủng Az 03 và Az 07 trên các môi trường nuôi cấy khác nhau 61 Đồ thị 3.1. Ảnh hưởng của pH lên khả năng tăng trưởng của hai chủng Az 03 và Az 07 63 Đồ thị 3.2. Ảnh hưởng của pH lên khả năng cố định nitơ của hai chủng Az 03 và Az 07 64 Đồ thị 3.3. Ảnh hưởng của loại đường và nồng độ đường lên khả năng tăng trưởng của chủng Az 03 66 Đồ thị 3.4. Ảnh hưởng của loại đường và nồng độ đường lên khả năng tăng trưởng của chủng Az 07 66 Đồ thị 3.5. Ảnh hưởng của loại đường và nồng độ đường lên khả năng cố định nitơ của chủng Az 03 68 Đồ thị 3.6. Ảnh hưởng của loại đường và nồng độ đường lên khả năng cố định nitơ của chủng Az 07 69 Đồ thị 3.7. Ảnh hưởng của ion Mn 2+ và ion Cu 2+ ở các nồng độ khác nhau lên khả năng tăng trưởng của chủng Az 03 70 Đồ thị 3.8. Ảnh hưởng của ion Mn 2+ và ion Cu 2+ ở các nồng độ khác nhau lên khả năng tăng trưởng của chủng Az 07 71 Đồ thị 3.9. Ảnh hưởng của ion Mn 2+ và ion Cu 2+ ở các nồng độ khác nhau lên khả năng cố định nitơ của chủng Az 03 72 Đồ thị 3.10. Ảnh hưởng của ion Mn 2+ và ion Cu 2+ ở các nồng độ khác nhau lên khả năng cố định nitơ của chủng Az 07 72 vi Đồ thị 3.11. Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên khả năng tăng trưởng của chủng Az 03 và Az 07 74 Đồ thị 3.12. Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên khả năng cố định nitơ của chủng Az 03 và Az 07 75 Đồ thị 3.13. Ảnh hưởng nồng độ của mỗi loại đạm lên khả năng tăng trưởng của chủng Az 03 77 Đồ thị 3.14. Ảnh hưởng nồng độ của mỗi loại đạm lên khả năng tăng trưởng của chủng Az 07 78 Đồ thị 3.15. Ảnh hưởng nồng độ của mỗi loại đạm lên khả năng cố định nitơ của chủng Az 03 79 Đồ thị 3.16. Ảnh hưởng nồng độ của mỗi loại đạm lên khả năng cố định nitơ của chủng Az 07 80 Đồ thị 3.17. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng tăng trưởng của chủng Az 03 và Az 07 81 Đồ thị 3.18. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng cố định nitơ của chủng Az 03 và Az 07 83 Mở đầu - 1 - MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Trong khí quyển, nitơ chiếm gần 80% thể tích, tuy nhiên chúng tồn tại ở dạng khí N 2 với liên kết cộng hóa trị rất bền vững (N≡N), thực vật không thể sử dụng trực tiếp được. Để sử dụng được nguồn đạm dồi dào này thì cần phải phá vỡ liên kết bền vững trong phân tử N 2 , tạo ra các loại đạm mà cây trồng có thể hấp thu được. Trong công nghiệp sản xuất phân bón hóa học, để phá vỡ liên kết này người ta thực hiện các phản ứng hóa học dưới điều kiện nhiệt độ, áp suất rất cao và có sự tham gia của nhiều chất xúc tác, do dó, việc sản xuất phân bón bằng phương pháp này sẽ gây tốn kém, gây ô nhiễm môi trường và tác động xấu đến sức khỏe của con người. Ngày nay với sự phát triển của công nghệ sinh học trong nông nghiệp, thì việc nghiên cứu và tìm ra cách chuyển hóa để biến nguồn đạm dồi dào từ trong khí quyển vào trong đất mà không tác động đến môi trường và sức khỏe con người đã được nghiên cứu. Một trong những hướng quan trọng và hiệu quả là việc sử dụng vi sinh vật có khả năng cố định đạm nhờ hệ enzyme nitrogenase. Azotobacter là giống vi sinh vật cố định đạm tự do có khả năng làm giàu nguồn đạm trong đất - nguồn đạm cây trồng sử dụng được. Chúng có khả năng này là nhờ quá trình cố định nitơ sinh học, quá trình khử N 2 trong không khí thành NH 3 dưới tác dụng của enzyme nitrogenase. Ngoài ra chúng còn kích thích hấp thu các chất dinh dưỡng khoáng của thực vật (NO 3 - , PO 4 3- , K + , Fe 2+ ), sản sinh ra các chất có khả năng điều hòa sinh trưởng ở thực vật (indole 3-acetic acid, indole- lactic acid…). Loài vi sinh vật trên phân bố rộng rãi trong đất và nước nhưng sự phân bố trên không đồng đều và số lượng hiện diện quá ít không đem lại hiệu quả cao. Do đó, việc phân lập, tuyển chọn chủng giống có hoạt tính cố định đạm cao để bổ sung vào đất trồng trọt là một trong những khâu quan trọng nhằm nâng cao năng suất cây trồng. Với những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu các đặc tính tăng trưởng, cố định đạm của vi khuẩn Azoterbacter – Thử nghiệm trên cây trồng”. Mở đầu - 2 - Mục tiêu của nghiên cứu: Tuyển chọn được chủng Azotobacter có hoạt tính cố định đạm cao từ các chủng phân lập, nghiên cứu các đặc tính tăng trưởng và cố định đạm của các chủng chọn lọc, từ đó ứng dụng trong lĩnh vực trồng trọt. Nội dung thực hiện: - Phân lập chủng Azotobacter từ các mẫu đất ở Hà Nội, Lâm Đồng, Đông Nai, Long An, Tiền Giang, Bến Tre. - Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa của các chủng phân lập. - Tuyển chọn chủng có hoạt tính cố định đạm cao. - Định danh đến loài các chủng chọn lọc bằng phương pháp giải trình tự 16S rRNA. - Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng lên khả năng tăng trưởng và cố định nitơ của chủng chọn lọc. - Thử nghiệm hiệu quả của các chủng chọn lọc trên cây cải xanh (Brassica Juncea). PHẦN 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU [...]... về vi khuẩn cố định nitơ 1.2.1 Phân loại Vi khuẩn cố định nitơ được phân ra thành ba nhóm nhỏ: nhóm vi khuẩn sống cộng sinh, nhóm vi khuẩn sống tự do và nhóm vi khuẩn tương tác với thực vật ký chủ Tuy nhiên, sự phân biệt giữa ba nhóm này, đặc biệt là giữa nhóm vi khuẩn cố định đạm sống tự do và nhóm vi khuẩn cố định đạm tương tác với thực vật thì vẫn chưa được mô tả một cách rõ ràng và một số vi khuẩn. .. định từ vi khuẩn sang cây trồng Một số vi khuẩn tham gia vào quá trình cố định nitơ tương tác điển hình như: Azospirillum, Burkholderia, Enterobacter, Gluconoacetobacter, Herbasspirillum và Klebsiella [10] 1.2.2 Vai trò của vi khuẩn cố định nitơ Vai trò quan trọng nhất của những vi khuẩn cố định nitơ đó là khả năng cố định nitơ cung cấp đạm cho cây trồng Bên cạnh đó, các vi khuẩn cố định nitơ còn được... tác gần giữa vi khuẩn và thực vật, trong đó, vi khuẩn được gọi là sinh vật cộng sinh Hầu hết các vi khuẩn cố định nitơ là vi khuẩn gram âm , có khả năng hình thành nốt sần ở rễ cây họ Đậu, hay là những thành vi n xạ khuẩn thuộc chi Frankia – là vi khuẩn gram dương có khả năng hình thành nốt sần trên cây thân gỗ, cây hai lá mầm và cây bụi Ban đầu, những vi khuẩn cộng sinh với cây họ đậu được phân loại... của NifA, nhưng lại hoạt hóa phiên mã của các gen nif và operon khác dưới điều kiện này (Dixon, 1998) Sự hiện diện của gen nif là đặc điểm của các vi khuẩn cố định đạm (diazotroph) ở Gammaproteobacteria, bao gồm các vi khuẩn cố định đạm quan trong khác của khóa phân loại này như Klebsiella pneumoniae, cũng như A vinelandii – hai loài được nghiên cứu nhiều nhất Gen nif đã không được xác định trong các. .. kiểu di truyền thực vật liên quan đến sự hấp thu và vận chuyển đạm Trên cơ sở của cuộc thảo luận về các nhân tố hệ thống cố định đạm (Quispel, năm 1991; Kennedy và Tchan năm 1992 - những người nghiên cứu cố định nitơ trong ngũ cốc) đã cho một số đề xuất mới liên quan đến các nghiên cứu trong tương lai về sự kết hợp của vi khuẩn cố định đạm và ngũ cốc, sự cố định nitơ sẽ hiệu quả hơn Triplett - 27 - Tổng... cải đường này làm tăng 4-26% năng suất củ cải đường; 2.5 – 5.39% hàm lượng đường và 2 – 24% sản lượng đường kết tinh [27] 1.6 Các nghiên cứu, ứng dụng trong và ngoài nước Trên thế giới cũng đã có nhiều công trình nghiên cứu về chủng Azotobacter và ứng dụng của chúng trong cây trồng Vi c ứng dụng của Azotobacter trên cây trồng đã được thử nghiệm thành công trong phòng thí nghiệm và trên đồng ruộng (Becking,... nghiệp Vi khuẩn Azotobacter được sử dụng cho nghiên cứu cố định nitơ và xâm nhiễm thực vật bởi nó làm tăng tốc độ tăng trưởng và mức độ cố định nitơ cao (Jagnow, 1987; Gouri và Jagasnnatathan, 1995; Maltseva và cộng sự, 1995; Mrkova-ki,1996) Tuy nhiên, các dữ liệu thực nghiệm liên quan đến vi khuẩn Azotobacter kích thích phát triển thực vật, các cơ chế hoạt động mà vi khuẩn Azotobacter làm tăng cường tăng. .. (không khí bão hòa) và sự hình thành sinh khối sẽ giảm khi tăng pO2 lên (Sabra et al., 1999) Trong một nghiên cứu khác (Pena et al., 2000), cho thấy khi tăng cả nồng độ oxy hòa tan và tốc độ khuấy sẽ làm tăng mật độ tế bào của vi khuẩn cố định đạm Azotobacter [8] Tuy nhiên sự cố định đạm của vi khuẩn lại bị ưc chế bởi oxy Ở vi khuẩn hiếu khí, sự cố định N2 xẩy ra khi có sự hiện diện của oxy trong tế bào,... Sari và cộng sự (1988), nó có thể được giả định rằng mối liên hệ giữa một kiểu gen thực vật và một chủng vi khuẩn phụ thuộc vào các đặc tính các thành phần trong hệ thống bao gồm [27]: - Thành phần định lượng và chất lượng các dịch tiết ở rễ của kiểu gen thực vật - Các đặc trưng trao đổi chất của chủng vi sinh vật - Khả năng của chủng vi sinh vật và các kiểu gen thực vật để tổng hợp các hormon tăng. .. triển của vi khuẩn cố định nitơ bên trong bắp có khả năng thành công nhất với sự phát triển của cây bắp mà không cần bón phân đạm cho phát triển và năng suất tối ưu [27] Khả năng của một số chủng vi khuẩn Azotobacter sống ở vùng rễ cây củ cải đường và hoạt động nitrogenase trong nghiên cứu giống củ cải đường lai có tương quan với chuyển động của các tế bào Azotobacter đối với gốc cây (Mrkova-ki và cộng . Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu các đặc tính tăng trưởng, cố định đạm của vi khuẩn Azoterbacter – Thử nghiệm trên cây trồng . Mở đầu - 2 - Mục tiêu của nghiên cứu: Tuyển chọn được. **** ĐỖ HOÀNH QUÂN PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH TĂNG TRƯỞNG, CỐ ĐỊNH ĐẠM CỦA VI KHUẨN AZOTOBACTER – THỬ NGHIỆM TRÊN CÂY TRỒNG LUẬN VĂN THẠC SĨ CHUYÊN. được chủng Azotobacter có hoạt tính cố định đạm cao từ các chủng phân lập, nghiên cứu các đặc tính tăng trưởng và cố định đạm của các chủng chọn lọc, từ đó ứng dụng trong lĩnh vực trồng trọt.