i TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU, PHÂN TÍCH GENOTYPE VÀ SỰ TƯƠNG ĐỒNG KHÁNG NGUYÊN CỦA VIRUS CARE Ở VIỆT NAM CNĐT: LÊ HUỲNH THANH PHƯƠNG 9718 HÀ NỘI – 2013 ii MỤC LỤC Phần I 1 MỞ ĐẦU 1 Phần II 6 NỘI DUNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 6 I. NỘI DUNG 6 II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 6 2.1. Phương pháp quan sát, thống kê sinh học 6 2.2. Phương pháp mổ khám 7 2.3. Phương pháp làm tiêu bản bệnh lý 7 2.4. Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch 9 2.5. Phương pháp nuôi cấy tế bào 11 2.6. Phương pháp phân lập virus Care trên tế bào tổ chức 12 2.7. Phương pháp xác định hiệu giá virus (TCID 50 ) 13 2.8. Phương pháp xác định đường biểu biễn sự nhân lên của virus 14 2.9. Phương pháp tách chiết RNA 15 2.10. Phương pháp tiến hành phản ứng RT – PCR 15 2.11. Phương pháp giải trình tự gene 17 2.12. Phương pháp xử lý số liệu, xây dựng cây sinh học phân tử 18 2.13. Phương pháp tinh chế kháng nguyên virus và định lượng protein 18 2.14. Phương pháp chế tạo kháng thể 19 2.15. Phương pháp ELISA 20 2.16. Phương pháp tinh chế kháng thể 21 2.17. Phương pháp thực hiện phản ứng trung hòa virus 23 Phần III 25 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1. Kết quả thu thập mẫu chó mắc bệnh Care và nghiên cứu các đặc điểm bệnh lý, chẩn đoán bệnh Care bằng phương pháp nhuộm tiêu bản vi thể và hóa mô miễn dịch 25 3.2. Kết quả phân lập virus trên môi trường tế bào, xác định một số đặ c tính sinh học của virus 32 3.2.1. Kết quả phân lập virus Care trên môi trường tế bào Vero-DST 32 iii 3.2.2 Khả năng gây bệnh tích tế bào (CPE) và hiệu giá của các chủng virus Care phân lập được 35 3.3. Kết quả giải trình tự gene của một số chủng virus Care phân lập tại Việt Nam và virus vacxin 42 3.3.1 Kết quả phản ứng RT- PCR 42 3.3.2 Kết quả giải trình tự gene của virus Care 46 3.4. Kết quả xác định sự tương đồng gene của các chủng virus Care phân l ập tại Việt Nam với các chủng virus trên thế giới và chủng virus vacxin 61 3.4.1. Kết quả so sánh trình tự nucleotide trong gene của các chủng virus Care nghiên cứu và chủng virus vacxin 61 3.4.2. Kết quả so sánh trình tự axitamin của đoạn gene P và đoạn gene H của các chủng virus nghiên cứu với chủng virus vacxin 63 3.4.3. Kết quả cây sinh học phân tử 69 3.4.4. Sự tương đồng về nucleotide và axitamin giữa các chủng virus Care nghiên cứu: 70 3.5. Kết quả chế tạo kháng thể đa dòng tương ứng với các chủng virus Care phân lập được ở Việt Nam và chủng virus vacxin để dùng cho phản ứng trung hòa 72 3.5.1. Kết quả tinh chế kháng nguyên virus 72 3.5.2. Kết quả tạo kháng thể qua chuột 74 3.6. Kết quả xác định sự tương đồng kháng nguyên giữa các chủng virus Care phân lập và chủng virus vacxin 78 Phần IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 87 4.1. Kết luận: 87 4.2. Đề nghị: 88 Phần V. TÀI LIỆU THAM KHẢO 94 5.1. Tài liệu tiếng Việt 94 5.2. Tài liệu tiếng Anh 94 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Hồ sơ của các mẫu thu thập 25 Bảng 3.2. Bệnh tích đại thể của chó nghi mắc Care 26 Bảng 3.3. Bệnh tích vi thể của chó nghi mắc bệnh Care 28 Bảng 3.4. Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch để xác định chó bị mắc bệnh Care 30 Bảng 3.5. Nguồn gốc của các chủng virus Care được lựa chọn cho nghiên cứu 34 Bảng 3.6. Kết quả nghiên cứu khả năng gây b ệnh tích tế bào của các chủng virus Care 36 Bảng 3.7. Hiệu giá và đặc tính nhân lên của các chủng virus Care phân lập . 39 Bảng 3.8. Các chủng virus Care được lựa chọn nghiên cứu quy luật nhân lên 40 Bảng 3.9. Hiệu giá virus của chủng CDV1-P trong và ngoài tế bào qua thời gian. 41 Bảng 3.10. Hiệu giá virus của chủng CDV2-H trong và ngoài tế bào qua thời gian . 41 Bảng 3.11. Kết quả phản ứng RT- PCR với gene H 43 Bảng 3.12. Kết quả RT-PCR với gene P 45 Bảng 3.13. So sánh tương đồng nucleotide và axit amin đoạn gene H 70 Bảng 3.14. So sánh tương đồng nucleotide và axit amin đoạn gene P 71 Bảng 3.15. Kết quả tinh chế kháng nguyên virus 73 Bảng 3.16. Biến đổi bệnh lý của chuột gây miễn dịch 74 Bảng 3.17. Kết quả thu huyết thanh có chứa kháng thể kháng virus Care 77 Bảng 3.18. Kết quả phản ứng ELISA kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng virus Care 77 Bảng 3.19. Kết quả xác định chỉ số trung hòa của chủng virus CDV1P 79 B ảng 3.20. Kết quả xác định chỉ số trung hòa của chủng virus CDV6H 80 Bảng 3.21 Kết quả xác định chỉ số trung hòa của chủng virus CDV13R 81 Bảng 3.22. Kết quả xác định chỉ số trung hòa của chủng virus CDV16H 82 Bảng 3.23. Kết quả xác định chỉ số trung hòa của chủng virus CDV19P. 83 Bảng 3.24. Kết quả xác định chỉ số trung hòa của chủng virus CDV VX. 84 Bảng 3.25. Kết quả sự tương đồng kháng nguyên giữa các chủng virus Ca rê phân lập và chủng virus vacxin 85 v DANH MỤC HÌNH Ảnh 2.1. Hoá miễn dịch dương tính Ảnh 2.2. Hoá miễn dịch âm tính 11 Hình 1. Phổi viêm, gan hóa 27 Hình 2. Phổi viêm dính với thành ngực 27 Hình 3. Đại não sung huyết, xuất huyết 27 Hình 4. Hạch lympho màng treo ruột sưng, tụ máu 27 Hình 5. Ruột xuất huyết, chứa hơi căng phồng 27 Hình 6. Xuất huyết niêm mạc ruột 27 Hình 7. Phế nang đứt nát, lòng phế nang chứa nhiều dịch phù (HE x10) 29 Hình 8. Phế nang thâm nhiễ m tế bào viêm(HE x40) 29 Hình 9. Lông nhung ruột đứt nát (HE x10) 29 Hình 10. Viêm cầu thận, xuất huyết (HE x40) 29 Hình 11.Hạch lympho xuất huyết, nang lympho teo (HE x10) 29 Hình 12. Hạch lympho xuất huyết, số lượng lymphocytes giảm (HE x40) 29 Hình 13. Hóa miễn dịch dương tính ở phổi (IHCx10) 31 Hình 14. Hóa miễn dịch dương tính tại ruột (IHCx10) 31 Hình 15. Hóa miễn dịch dương tính tại thận (IHCx10) 31 Hình 16. Hóa miễn dịch dương tính tại hạch lympho (IHCx10) 31 Hình 17. CPE do CDV-4H gây ra sau 24 giờ gây nhiễm (10X) 38 Hình 18. CPE do Onderstepoort (virus vacxin) gây ra sau 36 giờ gây nhiễm (10X) 38 Hình 19. CPE do CDV-4H gây ra sau 48 giờ gây nhiễm (10X) 38 Hình 20. Tế bào Vero –DST bình thường (10X) 38 Hình 21. Kết quả phản ứng RT- PCR 44 Hình 22. Kết quả phản ứng RT-PCR 45 Hình 23. Giản đồ giải trình tự tự động thành phần nucleotide của đoạn gene Haemagglutinin của virus Care 47 Hình 24. So sánh trình tự nucleotide của đoạn gene H của các chủng virus Care nghiên cứu 57 vi Hình 25. Giản đồ giải trình tự tự động thành phần nucleotide của đoạn gene Phospho protein của virus Care. 58 Hình 26. So sánh trình tự nucleotide của đoạn gene P của các chủng virus Care nghiên cứu 60 Hình 27. So sánh trình tự axitamin của đoạn gene H của các chủng virus Care nghiên cứu 66 Hình 28. So sánh trình tự axitamin của đoạn gene P của các chủng virus Care nghiên cứu 67 Hình 29. Cây sinh học phân tử của các ch ủng virus Care nghiên cứu 69 Hình 30. Chuẩn bị kháng nguyên tinh chế 72 Hình 31. Tạo gradient đường saccarose 72 Hình 32. Chuẩn bị mẫu cho siêu ly tâm 72 Hình 33. Máy siêu ly tâm 72 Hình 34. Nuôi động vật thí nghiệm 76 Hình 35. Chuẩn bị kháng nguyên 76 Hình 36. Tiêm động vật thí nghiệm 76 Hình 37. Bệnh tích ngoài da sau khi tiêm 76 Hình 38. Chuẩn bị mổ chuột 76 Hình 39. Lấy máu tim chuột 76 vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BSA : Bovine Serum Albumin cDNA : CompleDMEMtary DNA CDV : Canine distemper virus CPE : Cytophathogeneic Effect DAB : 3,3-diaminobenzidine DMEM : Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid ELISA : Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay FBS : Fetal Bovine Serum HE : Haematoxilin – Eosin IHC : Immunohistochemistry MOI : Multiplicity Of Infection Ond : Onderstepoort PBS : Phosphate buffered saline RNA : Ribonucleic acid RT-PCR : Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction TBP : TATA-binding protein TCID 50 : 50% Tissue Culture Infective Dose TMB : 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine 1 Phần I MỞ ĐẦU Virus Care ở chó được phát hiện từ thế kỷ XVIII, được tìm thấy ở Peru thuộc Châu Á, bệnh phân bố khắp thế giới. Năm 1905, căn bệnh được bác sĩ thú y người Pháp tên là Henri Carré phân lập được từ nước mũi của chó bệnh lọc qua giấy lọc vi khuẩn gây bệnh thực nghiệm cho chó, cũng vẫn gây được bệnh, ông cho rằng nguyên nhân bệnh là virus (Carré, 1905). Vì vậy, bệnh này được gọi là bệnh Care (theo tên nhà khoa học) (David T. Smith, 1979). B ệnh Care được phát hiện trên toàn thế giới. Gần đây, bệnh được công bố ở các nước châu Á như Nhật Bản (Lan và cs, 2006), Thái Lan (Keawcharoen và cs, 2005), Hàn Quốc (An và cs, 2008) và Ấn Độ (Latha và cs, 2007). Bệnh Care là một bệnh lây nhiễm cao ở chó, gây tổn thương lớn ở hệ tiêu hóa, dạ dày, ruột, hệ thần kinh trung ương và hệ hô hấp theo Hồ Đình Chúc (1993), Trần Thanh Phong (1996), Vương Đức Chất và cs, (2004), Lê Thị Tài (2006), Tô Du và Xuân Giao (2006), Nguyễn Văn Thanh (2007), Nguyễn Thị Lan và Tr ần Trung Kiên (2010), Nguyễn Hữu Nam (2011). Năm 1923, Putoni lần đầu tiên chế vacxin nhược độc tuy nhiên độc lực của virus vẫn còn cao. Sau năm 1948 với sự phát triển mạnh mẽ của virus học nhiều vacxin phòng bệnh Care có hiệu quả ra đời. Virus Care giống như virus sởi về hình thái và cấu trúc. Một số công trình nghiên cứu khác cho rằng có sự liên quan về kháng nguyên giữa virus Care, virus sởi và dịch tả trâu bò (Sidery và cs, 1996), virus gây bệnh trên động vật nhai lại nhỏ, virus gây bệnh trên động vật có vú dưới nước (cá heo, hải cẩu) (Griffin, 2001; Murphy, 1999). Virus Care (Canine distemper virus) thuộc họ paramyxoviridae và có mối liên quan gần gũi về tính kháng nguyên, sinh lý với virus sởi của người và virus dịch tả trâu bò của loài nhai lại. Ba 2 virus này cùng một nhóm với nhau trong giống Morbillivirus. Morbillivirus là một virus tương đối lớn (đường kính 150 – 250 nm) với sự đối xứng hình xoắn ốc, chúng có một lớp vỏ lipoprotein (Kennedy và cs, 1989). Cấu trúc của hạt virus bao gồm: Nucleocapside chứa ARN một sợi không phân đoạn gần 1600 nucleotide mã hóa thành 6 protein cấu trúc và 1 protein không cấu trúc (Diallo, 1990). N: Nucleocapsid, khối lượng phân tử 60 – 62 Kda bao quanh và phòng vệ cho hệ gene của virus, nhạy cảm với những chất phân giải protein. P: Phosphoprotein, khối lượng phân tử 73 – 80 Kda, nhạy c ảm với những yếu tố phân giải protein, đóng vai trò quan trọng trong sự sao chép của RNA (Sidhu và cs, 1993) M: Matrix, khối lượng phân tử 34 – 39 Kda, đóng vai trò quan trọng trong sự trưởng thành của virus và nối nucleocapsid với những protein vỏ bọc. F: Fusion là glycoprotein trên bề mặt của vỏ bọc, khối lượng phân tử 59 – 62 Kda, đóng vai trò trong sự kết hợp virus với thụ thể màng tế bào, dẫn đến kết hợp nhiều tế bào cảm nhiễm (h ợp bào). H: Protein ngưng kết hồng cầu (Haemagglutinin) hay yếu tố kết dính, là glycoprotein thứ hai của vỏ bọc, khối lượng phân tử 76 – 80 kda, thể hiện tính chuyên biệt của loài virus. Ở virus Care, protein này không hấp phụ hồng cầu cũng không ngưng kết hồng cầu. L: Large protein có khối lượng phân tử lớn 200 kda, chưa rõ chức năng (Nguyễn Vĩnh Phước và cs; Bell và cs, 1992). Protein không cấu trúc (C) được mã hóa từ một khu đọc mở khác ở gene P (Lamb và Kolakofsky, 2001). Ch ức năng thực tế của protein C trong sinh học của virus là không rõ ràng. Mặc dù có những sự khác biệt nhỏ về kháng nguyên giữa các chủng CDV khác nhau nhưng nó thường được chấp nhận là chỉ có một serotype. Tuy nhiên, có sự khác biệt đáng kể trong khả năng gây bệnh của các chủng virus 3 phân lập và các type ở các khu vực địa lý khác nhau đã được nói tới. Các type của CDV bao gồm: Asia 1 (Nhật Bản, Trung Quốc), Asia 2 (chỉ có ở Nhật Bản), Bắc Cực, động vật hoang dã châu Âu, USA 1 và 2, CDV cổ điển (Onderstepoort, Convac, Rockborne và Snyder Hill) (Haas và cs, 1997; 1999; Harder và Osterhaus, 1997; Martella và cs, 2006; 2007; Yoshida và cs, 1998). Bên cạnh đó, dựa trên trình tự nucleotide của đoạn gene mã hóa cho protein H, Lan NT và cs, (2008) đã chia ra thành 5 type virus lớn được phân lập từ những vùng địa lý khác nhau: type Châu Âu, cổ điển (Classic type), Asia 1, Asia 2 và USA. Mặc dù các nước trên thế giớ i đã dùng vacxin nhược độc để phòng bệnh nhưng gần đây tỷ lệ chó mắc Care đã tăng một cách đáng kể ở một số nước như Nhật, các nước châu Âu (Appel và cs, 1987; Blixenkrone và cs, 1993; Shin và cs, 1995; Lan và cs, 2005). Rất nhiều chó đã được tiêm phòng vacxin phòng mà vẫn mắc bệnh (Blixenkrone và cs, 1993; Lan và cs, 2006). Yoon SH, Park JY, (2008) đã xác định trình tự gene quy định kháng nguyên hemagglutinin (H) từ bốn chó mắc virus Care phân lập được tại Hàn Quốc. Những trình tự này được đưa vào phân tích cây phát sinh loài c ủa các chủng virus Care (là EU1, EU2, EU3, NA1, NA2, 1 Châu Á, Châu Á 2 và vacxin). Phân tích này cho thấy ba trong số các phân lập Hàn Quốc nằm trong nhóm 2 Châu Á chủng còn lại nằm trong nhóm 1 của Châu Á. Như vậy ngay trong một quốc gia đã lưu hành hai chủng virus Care khác nhau. Roger và cs, (2003) nghiên cứu một trường hợp mà trong đó hàng trăm con chó trong một thị trấn Alaska (Mỹ) đã chết trong một ổ dịch Care. Virus Care đã được tìm thấy trong bàng quang, lá lách, phổi, và tuyến nước bọt của các chó bị bệnh. Kháng thể huỳnh quang trự c tiếp kiểm tra cho kết quả dương tính (Mô miễn dịch cho thấy sự hiện diện của virus trong lá lách, phổi, và tuyến nước bọt). Trong nghiên cứu này kỹ thuật RT-PCR cũng đã được sử dụng để xác nhận sự hiện diện của virus Care. RNA virus được phát hiện bằng RT-PCR trong não, lá [...]... bệnh vẫn xảy ra điều này cho thấy virus không ngừng biến đổi và cần nghiên cứu đầy đủ về đặc điểm di truyền cũng như tính kháng nguyên của các chủng virus Care lưu hành ở từng quốc gia để có chiến lược phòng bệnh hiệu quả 4 Nghiên cứu và phân tích sự biến đổi về gene và sự tương đồng gene, cũng như sự tương đồng kháng nguyên của các chủng virus Care đang lưu hành ở Việt Nam là vô cùng cần thiết Nó không... Care phân lập tại Việt Nam với các chủng virus trên thế giới và chủng virus vacxin - Chế tạo kháng thể đa dòng tương ứng với các chủng virus Care phân lập được ở Việt Nam và chủng virus vacxin để dùng cho phản ứng trung hòa - Nghiên cứu khả năng phản ứng chéo giữa chủng virus vacxin với một số chủng virus Care phân lập được ở Việt Nam II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Để tiến hành nghiên cứu và thực hiện được... PHÁP NGHIÊN CỨU I NỘI DUNG - Thu thập mẫu chó mắc bệnh Care và nghiên cứu các đặc điểm bệnh lý, Chẩn đoán bệnh Care bằng phương pháp nhuộm tiêu bản vi thể và hóa mô miễn dịch - Phân lập virus trên môi trường tế bào, xác định một số đặc tính sinh học của virus - Giải trình tự gene của một số chủng virus Care phân lập tại Việt Nam và virus vacxin - Xác định sự tương đồng gene của các chủng virus Care phân. .. nghiệm + Chuẩn bị kháng nguyên (virus) : Kháng nguyên gây miễn dịch là protein kháng nguyên của virus CDV đã được tinh chế và định lượng (gồm các chủng virus phân lập được: CDV1P, CDV6H, CDV13R, CDV16H, CDV19P, CDVVX Kháng nguyên gốc được pha loãng trong dung dịch PBS) + Chuẩn bị hỗn hợp kháng nguyên và nhũ dầu: Phối trộn kháng nguyên và nhũ dầu theo tỷ lệ 1/1,5 Mix hỗn hợp kháng nguyên và nhũ dầu bằng... và chính xác về các nhóm virus Care đang lưu hành tại Việt Nam, thấy được sự tương đồng kháng nguyên giữa các nhóm virus này mà còn là cơ sở khoa học để lựa chọn chủng virus Care thích hợp phục vụ việc chế vacxin phòng bệnh, là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo như tái tổ hợp virus, chế tạo KIT chẩn đoán hay vacxin phòng bệnh Care Phạm vi nghiên cứu: Một số chủng virus gây bệnh Care trên chó ở Việt. .. gan, phổi và thận Xác định trình tự nucleotide và phân tích phát sinh loài của một đoạn gene P 540-bp của chủng Alaska với trình tự tương ứng của 2 vacxin và 7 chủngvirus Care phân lập tự nhiên cho thấy virus Care gây nên các ổ dịch đã liên quan chặt chẽ đến một chủng virus Care độc lực cao ở Siberia Như vậy có sự sai khác rất lớn về tính gây bệnh của các chủng virus Care tự nhiên cũng như sự khác nhau... hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể và gồm các bước cơ bản như sau: 20 Bước 1: Phủ kháng nguyên lên đĩa ELISA Kháng nguyên được pha loãng theo cơ số 10 trong dung dịch PBS, nồng độ pha loãng tuỳ theo hàm lượng kháng nguyên nhiều hay ít Phủ 50ul kháng nguyên đã pha loãng lên các giếng của đĩa ELISA, ủ ở nhiệt... tính kháng nguyên của chủng virus Care tự nhiên và chủng được sử dụng làm vacxin Benetka, (2009) nghiên cứu phát sinh loài thông qua phân tích trình tự genee haemagglutinin (H) trên 14 chó khác nhau ở Áo (từ năm 2003 đến 2007) cho thấy có dòng lưu thông virus Care khác nhau ở Áo Đa số các chủng phát hiện thuộc dòng châu Âu Một virus Care ở Áo phát hiện vào năm 2003 có mối quan hệ mật thiết với chủng virus. .. nhận và xác định sự tương đồng về nucleotide của các chuỗi gene tương ứng của virus với các phân đoạn gene thu được trong nghiên cứu Thành phần aminoaxit của kháng nguyên virus được thu nhận bằng cách sử dụng bộ mã của vi sinh vật bậc thấp (Bộ mã vi khuẩn – bacterial code) có trong ngân hàng gene và so sánh thông qua chương trình Geneetyx Xác định nguồn gốc phả hệ phát sinh chủng loại trên cơ sở trình... giá kháng thể (phương pháp ELISA), thử nghiệm chất lượng của kháng thể sản xuất ra Chuột thí nghiệm là chuột lang không có kháng thể kháng virus Care, không có mang virus Care Phân lô chuột thí nghiệm: Chia lô để tiến hành tiêm kháng nguyên, gây miễn dịch cho chuột thí nghiệm sau đó theo dõi biểu hiện bệnh lý, cuối cùng là lấy máu chuột thí nghiệm, chắt huyết thanh và thu kháng thể kháng virus Care . số chủng virus Care phân lập tại Việt Nam và virus vacxin. - Xác định sự tương đồng gene của các chủng virus Care phân lập tại Việt Nam với các chủng virus trên thế giới và chủng virus vacxin quả. 5 Nghiên cứu và phân tích sự biến đổi về gene và sự tương đồng gene, cũng như sự tương đồng kháng nguyên của các chủng virus Care đang lưu hành ở Việt Nam là vô cùng cần thiết. Nó không. NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU, PHÂN TÍCH GENOTYPE VÀ SỰ TƯƠNG ĐỒNG KHÁNG NGUYÊN CỦA VIRUS CARE Ở VIỆT NAM CNĐT: LÊ HUỲNH THANH PHƯƠNG