Đang tải... (xem toàn văn)
bài tập tiểu luận môn các phương pháp phân tích hiện đại khoa hoá sinh viên trường đại học sư phạm hà nội 2 SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO ĐỂ PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ VITAMIN B TRONG SỮA
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA HÓA HỌC BÀI TIỂU LUẬN : SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO ĐỂ PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ VITAMIN B TRONG SỮA Sinh viên thực hiện: Trần Thị Ngà Nguyễn Thị Hạnh A Đoàn Thị Lan Nguyễn Thị Phượng Nguyễn Thị Thảo CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về sữa Sau sữa mẹ ,sữa bò là thực phẩm chứa các chất dĩnh dưỡng đầy đủ và cân đối nhất .các sữa từ trâu,dê,ngựa cũng có các chất dinh dưỡng khác nhau do điều kiện về giốn, điều kiện tự nhiên,hay điều kiện chăn nuôi. Mặc dù ở nước ta chăn nuôi trâu sữa,dê sữa đã có từ khá lâu nhưng chất lượng sản phẩm thấp. Vì vậy cho đến nay nguyên liệu chủ yếu cho nghành sữa Viêt Nam vẫn là sữa bò. Các sản phẩm sữa có thể ở dạng rắn như các phomats ,dạng hạt đơn điệu như trong các sữa bột,dạng đặc mịn màng đôi khi có thêm hương sắc của hoa trái như trong các sữa chua, dạng lỏng như trong các sữa cô đặc có đường, các loại sữa tươi có đường từ nguyên liệu sữa bò người ta đã chế tác ra vô vàn các sản phẩm có cấu trúc trạng thái hương vị khác nhau. Trong sữa có các thành chính là: nước , gluxit, chất béo ,hợp chất nito, chất khoáng ,chất khô tổng số, các chất khác( các chất xúc tác sinh học như vitamin A,D,K,B1 các khí hòa tan ,enzyme). Trong đó vitamin B chiêm một hàm lượng nhất định nhưng rất quan trong.ví dụ trong 100g sữa bột vitamin B1,B2 có khoảng 600-780μg,vitamin B6 chiếm khoảng 1200μg,vitamin B12 chiếm khoảng 2,5μg. 1.2 Giới thiệu về vitamin B Khái niệm vitamin:Vitamin là hợp chất hữu cơ ,phần lớn có phân tử tương đối nhỏ. Bản chất hóa học , lý học của các vitamin rất khác nhau. Nhóm chất hữu cơ này có một đặc điểm chung là đặc biệt cần thiết cho mọi hoạt động sinh sống bình thường của các cơ thể sinh vật dị dưỡng. Các vitamin B giúp duy trì sức khỏe của thần kinh, da, thị lực, tóc, gan và miệng, cũng như làm săn chắc các cơ thuộc đường tiêu hóa và liên quan đến các chức năng não bộ khác. 1.2.1.Quá trình phát hiện vitamin B. Khoảng giữa thế kỷ XVII, Jacob de Bondt (1598-1631), một thầy thuốc làm việc tại Batavia ở miền đông Ấn Độ thuộc Hà Lan đã viết cuốn sách “Y học Ấn Độ”, trong đó mô tả một căn bệnh phổ biến ở dân cư vùng này: Người ốm mất trương lực bàn tay, cánh tay, cơ chi dưới suy yếu kèm viêm dây thần kinh ngoại vi. Nhưng mãi đến năm 1642 (nghĩa là sau khi Bondt qua đời 11 năm), gia đình mới phát hiện và cho xuất bản cuốn sách. Sau đó, nhiều thầy thuốc ở vùng Viễn Đông cũng thông báo một số trường hợp có những dấu chứng tương tự và gọi tên là beri beri, dựa theo thuật ngữ “beri” của dân cư Sri Lanka (có nghĩa là mỏi mệt, suy nhược). Năm 1881, Erwin Von Balcz (1849-1913) xác nhận dạng bệnh suy nhược cơ chi khá phổ biến ở nhiều vùng dân cư Nhật. Trong suốt 4 năm (1882-1885), Kanehiro Takaki (1849-1915), Tổng Giám đốc Y khoa Hải quân Nhật đã loại trừ dạng bệnh này trong thủy quân Nhật nhờ áp dụng chế độ ăn gạo cám, hoa quả tươi. Năm 1890, Christian Eijkman (1858-1890), thầy thuốc ngoại khoa và vệ sinh học người Hà Lan, làm việc tại một trại giam ở Java, nhận xét thấy phần lớn các tù nhân đều có dấu hiệu bệnh beri beri làm suy nhược cơ, tê phù, liệt chân. Qua theo dõi một thời gian dài, ông nhận ra nguyên nhân là do tù nhân ăn loại gạo xay xát quá kỹ. Ông dùng loại gạo đó nuôi dưỡng cho cả đàn gà của trại giam và lần đầu tiên gây được bệnh beri beri thực nghiệm. Sau đó, ông quyết định cho cả tù nhân lẫn đàn gà dùng chế độ ăn gạo chứa nhiều cám thì thấy hết hẳn các dấu hiệu bệnh. Năm 1906, nhà hóa sinh học người Anh Gowland Hopkins (1861 – 1947), đã tiến hành những thử nghiệm với các chế độ ăn khác nhau trên súc vật. Cuối cùng sau 6 năm nghiên cứu, ông kết luận: Nhiều thể bệnh (như scorbut, beri beri…) đều do các chế độ ăn thiếu hụt một chất rất cần thiết (dù với số lượng rất nhỏ) cho sự phát triển cơ thể sinh vật. Năm 1911, sau khi gây bệnh beri beri thực nghiệm ở chim câu, Funk đã dùng một liều lượng nhỏ 20mg chất phân lập từ bột cám và điều trị khỏi bệnh này, từ đấy mở đường cho việc tìm hiểu đầy đủ về vitamin B. Năm 1929, giải Nobel Y học được trao tặng cho hai nhà khoa học Eijkman và Hopkins để ghi nhận công lao phát hiện vai trò của vitamin nhóm B. 1.2.2.Tìm hiểu về vitamin nhóm B: Vitamin B hoạt động như là các coenzyme, giúp các enzyme (chất men) phản ứng hóa học với các chất khác, và có liên quan đến quá trình tạo năng lượng. Nhóm vitamin này còn có hữu ích trong việc làm giảm bớt chứng trầm cảm và lo âu. Bổ sung đủ vitamin nhóm B rất quan trọng đối với người có tuổi bởi vì các chất này rất khó hấp thụ khi tuổi càng cao. Có nhiều trường hợp được chẩn đoán mắc chứng Alzheimer có nguyên nhân là do sự thiếu hụt vitamin B12 với các vitamin B khác. Các vitamin B nên luôn luôn sử dụng chung hơn là riêng lẻ bới vì chúng hoạt động cùng với nhau. Do đó, thiếu hụt vitamin B này cho thấy các vitamin B khác cũng đang thiếu hụt. Mặc dù các Vitamin nhóm B là một nhóm, chúng ta sẽ tìm hiểu riêng từng vitamin: Vitamin B1 (Thiamine): Vitamin B1 tăng cường tuần hoàn máu và hỗ trợ trong việc hình thành máu, quá trình trao đổi chất carbohydrate , và trong sản xuất hydrochloride acid (HCl), chất quan trọng trong hệ tiêu hóa bình thường. Thiamine còn tối ưu hóa các hoạt động liên quan đến nhận thức cũng như các chức năng não bộ. Sinh tố này còn có các tác động tích cực đối với năng lượng cơ thể, sự tăng trưởng, sự ngon miệng, khả năng học hỏi, và còn cần thiết cho sự làm chắc các cơ bắp của bộ máy tiêu hóa, tim, bao tử. Thiamine còn hoạt động như là chất chống oxi hóa, bảo vệ cơ thể khỏi các dấu hiệu tuổi tác do quá trình lão hóa, uống rượu bia, và hút thuốc. Bệnh phù thũng (beriberi), bệnh liên quan đến hệ thần kinh hiếm gặp ở các nước phát triển, có nguyên nhân do thiếu hụt thiamine. Các triệu chứng khác có thể có nguyên nhân từ thiếu thiamine bao gồm táo bón, phù, gan to, mệt mỏi, hay quên, tê bàn tay và bàn chân, đau, nhạy cảm, định hướng kém, cảm giác ngứa ran, cơ bắp đau và yếu, giảm cân nghiêm trọng. Benfotiamine là dạng tan trong chất béo của vitamin B1. Trong tự nhiên được tìm thấy ở tỏi, hành, tỏi tây, hẹ nghiền. Benfotiamine tích trữ trong cơ thể lâu hơn, mang lại các lợi ích điều trị mà vitamin B1 không có khả năng. Dạng này hiệu quả hơn thiamine trong việc kiểm soát các tác hại do tiểu đường gây ra, vì có khả năng kích hoạt enzyme transketolase tốt hơn Vitamin B1. Enzyme này giúp các hợp chất có nguồn gốc từ glucose ra khỏi các mạch máu khỏe mạnh và các tế bào thần kinh. Lượng bổ sung hằng ngày là 150 đến 600 mg, dưới sự hướng dẫn của bác sỹ. Các nguồn thực phẩm giàu vitamin B1 được tìm thấy trong các thực phẩm sau: gạo nâu, lòng đỏ trứng, cá, các loại đậu, gan, thịt heo, gia cầm, cám gạo, mầm lúa mì, ngũ cốc nguyên cám… Vitamin B2 (Riboflavin): Vitamin B2 rất cần thiết trong quá trình hình thành hồng cầu, sản xuất kháng thể, tế bào hô hấp, và phát triển cơ thể. Nó làm giảm bớt chứng mỏi mắt và rất quan trọng trong phòng tránh và chữa trị chứng đục thủy tinh thể. Nó hỗ trợ quá trình trao đổi chất carbohydrates, chất béo, và đạm.Cùng với vitamin A, nó duy trì và cải thiện màng dính cho đường tiêu hóa. Riboflavin còn tạo điều kiện thuận lợi cho các mô của da, tóc, móng sử dụng khí oxi; loại bỏ gàu; giúp hấp thụ sắt và vitamin B6 (pyridoxine). Tiêu thụ một lượng đủ riboflavin rất quan trọng trong quá trình mang thai, bởi vì nếu thiếu hụt vitamin này có thể gây nguy hại cho sự phát triển của thai nhi ngay cả khi thai phụ không có dấu hiệu gì về sự thiếu hụt này. Riboflavin còn cần cho sự trao đổi chất của axit amin tryptophan—có chức năng chuyển hóa thành niacin trong cơ thể. Hội chứng Nghẽn ống cổ tay (carpal tunnel syndrome) có thể có biểu hiện tốt nếu điều trị bao gồm riboflavin và vitamin B 6 . Các dấu hiệu cho thấy thiếu hụt vitamin B2 bao gồm nứt và loét ở mép miệng, rối loại thị giác, viêm ở miệng và lưỡi, tổn thương da. Một số triệu chứng khác có thể có là viêm da, choáng, rụng tóc, mất ngủ, nhạy ánh sáng, tiêu hóa kém, chậm phát triển, phản ứng chậm. Các nguồn thực phẩm giàu vitamin B2 được tìm thấy trong các thực phẩm sau: phô mai, lòng đỏ trứng, cá, các loại đậu, thịt, sữa, gia cầm, rau bina, ngũ cốc nguyên cám, và yogurt. Ngoài ra còn có măng tây, trái bơ, bông cải xanh, phúc bồn tử, nấm, rau mùi tây… Riboflavin dễ bị phá hủy nếu tiếp xúc với ánh sáng, kháng sinh, tác dụng của rượu bia. Sử dụng quá nhiều riboflavin (trên 50 mg) có thể gây hại tới thủy tinh thể và điểm vàng của mắt. Vitamin B3 (Niacin, Nicotinic Acid, Niacinamide): Vitamin B3 cần thiết cho tuần hoàn máu và một làn da khỏe mạnh. Nó hỗ trợ các chức năng của hệ thần kinh; chuyển hóa carbohydrate, chất béo, và protein; và trong sản xuất hydrochloric acid (HCl) cho hệ tiêu hóa. Vitamin B3 có đóng vai trò trong bài tiết mật, dịch tiêu hóa và tổng hợp các hooc-môn tình dục. Niacin (Nicotinic acid) hạ cholesterol và tăng cường tuần hoàn. Nó hữu ích cho điều trị bệnh tâm thần phân liệt (schizophrenia), các chứng bệnh trí óc khác, và cũng tăng cường trí nhớ. Bệnh tháo bì (nứt da, Pellagra) có nguyên nhân do thiếu niacin. Các triệu chứng khác do thiếu niacin bao gồm: nhiệt miệng, mất trí, trầm cảm, tiêu chảy, choáng váng, mệt mỏi, mất ngủ,… Niacin và niacinamide được tìm thấy nhiều trong gan bò, men bia, bông cải xanh, cà rốt, phô mai, trứng, cá, sữa, bột bắp, khoai tây… Các thảo dược có chưa niacin bao gồm cỏ linh lăng (alfalfa), chi Ngưu bàng (burdock root), Chi Hoa phổi (mullein), bạc hà (peppermint)… Một ly cà-phê cung cấp 3mg niacin. Vitamin B5 (Pantothenic Acid): Được biết đến như là vitamin chống stress, pantothenic acid đóng vai trò trong sản xuất hooc-môn adrenal và hình thành của kháng sinh, hỗ trợ hấp thụ vitamin, giúp chuyển hóa chất béo, carbohydrates và protein thành năng lượng. Pantothenic acid cần thiết cho tất cả các tế bào trong cơ thể và được tập trung trong các cơ quan. Nó còn liên quan tới sản xuất các chất dẫn truyền thần kinh (neurotransmitters). Vitamin này còn là thành phần thiết yếu của Coenzyme A–một chất hóa học quan trọng trong cơ thể có liên quan tới nhiều chức năng của chuyển hóa năng lượng. Pantothenic acid giúp tăng cường sức bền, chống loại các dạng của bệnh thiếu máu. Nó cần thiết cho các chức năng bình thường của đường tiêu hóa và có thế hữu ích trong điều trị trầm cảm và lo lắng. Thiếu hụt Pantothenic acid gây nên mệt mõi, đau đầu, ngứa ran ở tay, buồn nôn. Pantothenic acid còn cần thiết cho các chức năng bình thường của tuyết thượng thận (adrenal glands). Các thực phẩm sau có chứa pantothenic acid: trái bơ, thịt bò, men bia, trúng, rau tươi, thận, các loại đậu, gan, tôm hùm, nấm, hạt, thịt heo, sữa ong chúa, cá biển. Vitamin B6 (Pyridoxine): Pyridoxine có liên quan nhiều đến các chức năng trong cơ thể hơn hầu hết các chất dinh dưỡng đơn nào khác. Nó ảnh hưởng tới cơ thể cả sức khỏe thế chất lẫn tinh thần. Nếu cơ thể bị thủy thũng (sưng do nước) thì sử dụng pyridoxine sẽ có lợi. Nó còn cần thiết cho quá trình sản xuất hydrochlorid acid (HCl) và sự hấp thụ chất béo và protein. Pyridoxine còn hỗ trợ duy tìn sự cân bằng giữa Natri và Kali, thúc đẩy sự hình thành các tế bào hồng cầu .Pyridoxine cần thiết cho hệ thần kinh và các chức năng bình thường của não. Hơn nữa, nó còn cần cho sự tổng hợp các acid nucleic ADN và ARN – cần thiết cho sự tái sản xuất của tất cả tế bào và cho sự phát triển bình thường của tế bào. Nó kích hoạt nhiều enzyme và hỗ trợ trong sự hấp thụ của vitamin B 12 , trong chức năng hệ miễn dịch, và trong sản xuất kháng thể. Vitamin B 6 góp một vai trò trong đề kháng ung thư và hỗ trợ chống xơ cứng động mạch. Nó chống lại sự hình thành của một chất độc hóa học tên homocysteine – gây hại cho cơ tim và tập trung cholestorol xung quanh cơ tim. Pyridoxine hoạt động như là chất lợi tiểu, giảm các triệu chứng của tiền kinh nguyệt. Puridoxine còn có lợi trong phòng tránh sỏi thận calcium oxalate, trong chữa trị dị ứng, đau khớp, và hen suyễn. Thiếu hụt vitamin B6 biểu hiện thiếu máu, động kinh, đau đầu, buồn nôn, loét lưỡi, tróc da, ói mữa. Các dấu hiệu khác của thiếu hụt vitamin B6 là mụn, biếng ăn, đau khớp, viếm kết mạc (conjunctivitis), trầm cảm, chống mặt, mệt mõi, vết thương không lành, vấn đề thính giác, đơ cứng, da mặt dầu, rụng tóc, mất trí, ngứa ran. Hội chứng ống cổ tay cũng liên quan tới sự thiếu hụt vitamin B 6 Tất cả nguồn thực phẩm đều cung cấp vitamin B 6; tuy nhiên, các thực phẩm sau có lượng cao: men bia, cà rốt, gà, trứng, cá , thịt, đậu, rau bina, hạt hướng dương, quả óc chó (walnuts). Các nguồn khác bao gồm bơ, chuối, đậu, bông cải xanh, gạo nâu, cải bắp. Cỏ linh lăng cũng có chứa Vitamin B 6. Vitamin B12 (Methylcobalamin): Vitamin B12 tham gia phản ứng tổng hợp thymidylate, một thành phần trong phân tử ADN, cung cấp nguyên liệu để tổng hợp ADN, góp phần vào quá trình phân chia tế bào và trưởng thành tế bào trong cơ thể. Thiếu vitamin B12 gây ảnh hưởng rõ rệt lên những dòng tế bào có sự phân bào nhiều như các tế bào máu, tế bào biểu mô (nhất là ở niêm mạc đường tiêu hóa). Vitamin B tan trong nước, cần thiết cho quá trình trao đổi chất, hình thành tế bào hồng cầu và duy trì hệ thống thần kinh trung ương. Có trường hợp mắc bệnh thiếu máu ác tính không thể hấp thụ vitamin B12 từ đường ruột. Những người ăn chay trường cung có thể hơi thiếu vitamin B12. Nếu để cơ thể thiếu vitamin B12 lâu dài có thể gây ra bệnh hiếu máu, tê ngứa chân tay, suy nhược thần kinh và rối loạn tiền đình. Mỗi người cần bổ sung khoảng 6 microgam vitamin B12 mỗi ngày. - Thiếu vitamin B12 gây suy thoái chất myelin, một chất béo và là thành phần quan trọng của tế bào thần kinh, gây ra những triệu chứng thần kinh. - Vitamin B12 do vi khuẩn tổng hợp từ thiên nhiên, sau đó mới đi vào chu trình thức ăn của các động vật, chủ yếu từ các động vật ăn cỏ. Ðộng vật và thực vật không tự tổng hợp được vitamin B12. - Vitamin B12 trong thức ăn đều ở dạng phức hợp với protein. Trong chế biến, vitamin B12 khá bền vững với nhiệt độ, trừ khi trong môi trường kiềm và nhiệt độ quá 1000C. Thịt luộc ở 1700C trong 45 phút mất 30% B12. Sữa nấu sôi 2-5 phút mất 30% B12. Khi có sự hiện diện của vitamin C, B12 trở nên ít bền vững với nhiệt độ hơn và có thể bị phá hủy những lượng đáng kể vì 0,5g vitamin C. - Sự hấp thu vitamin B12 cần có yếu tố nội tại (một protein do tế bào thành của niêm mạc dạ dày tiết ra) và enzyme phân hủy protein của tụy. Vitamin B12 được hấp thu bởi đoạn cuối ruột non. - Nhiều người, thậm chí cả những người trong ngành y và dược thích chích B12 vì cho rằng đó là thuốc bổ máu, nhất là những khi thấy người mệt mỏi, da dẻ không được hồng hào. Có lẽ màu đỏ của thuốc cũng ảnh hưởng một phần, làm người ta tin tưởng ở tính chất “bổ máu” của nó. Tuy nhiên, như đã trình bày, hầu như tất cả các trường hợp này đều không thiếu vitamin B12. Cho đến nay, chắc chắn việc dùng vitamin B12 cho những người như vậy sẽ không đem lại bất kỳ lợi ích nào. Trái lại, chỉ tạo thêm nguy cơ bị phản ứng bất lợi do thuốc và tốn kém vì nhiều loại thuốc chứa vitamin B12 có giá khá cao. Nguồn cung cấp vitamin B12: Vitamin B có nhiều trong trứng, thịt, thịt gia cầm, đồ biển, sữa và các sản phẩm từ sữa. 1.3. GIỚI THIỆU VỀ SẮC KÍ LỎNG HIỆU NÂNG CAO (HPLC) 1.3.1. Khái niệm cơ bản Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp tách hóa lý dựa vào ái lực khác nhau của các chất khác nhau với hai pha luôn tiếp xúc và không đồng tan với nhau ,một pha động và một pha tĩnh . Pha động là một chất lỏng chảy trong cột với một tốc độ nhất định còn pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phhur lên một chất mang rắn hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hóa học cới các nhóm hữu cơ .Qúa trình sắc ký xảy ra do các cơ chế : hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc rây phân tử. Trong HPLC sắc kí lỏng cột là một trong những nhánh của phân tích công cụ phát triển nhanh nhất, đuợc áp dụng cho nhiều loại mẫu hơn bất kì kỹ thuật tách nào và có khả năng phân tích những hỗn hợp mẫu cực kì phức tạp trong hóa học và trong sinh học. Nghiên cứu kỹ thuật tách bằng LC là cần thiết vì nó sẽ tiếp tục dóng một vai trò quan trọng trong tất cả những linh vực của phân tích hóa học, mặc dù có những tiến bộ hon nữa trong các thuốc thử chọn lọc và những cải tiến trong các kỹ thuật vật lí do luờng. Với sự phát triển trong suốt những thập niên qua về thiết bị và sự nhồi cột, sắc kí lỏng hiệu nang cao (HPLC) nổi lên nhu một phuong pháp duợc ua thích cho kỹ thuật tách và phân tích dịnh luợng của rất nhiều loại mẫu. Phân tích HPLC nhanh, hiệu quả và có thể dò tìm luợng mẫu nhỏ dến 200 pg. Những co hội áp dụng HPLC hầu nhu không giới hạn do HPLC dã trở thành một công cụ không thể thiếu trong khoa học và công nghiệp. Sắc kí lỏng dựa trên hiện tuợng: duới cùng một diều kiện, mỗi cấu tử trong một hỗn hợp tuong tác với môi truờng xung quanh khác với tất cả các cấu tử khác. Khi duợc sử dụng nhu một công cụ phân tích, LC có thể xác dịnh các cấu tử trong một hỗn hợp và luợng của chúng trong mẫu. Khi kết hợp với những kỹ thuật phân tích kháthì có thể nhận diện dịnh tính các cấu tử trong mẫu. Phép tách duợc dòi hỏi khi: › Một hỗn hợp quá phức tạp cho việc phân tích trực tiếp ví dụ do phổ. ›Các chất phân tích rất giống nhau ví dụ các dồng phân. › Sự cần thiết phải diều chế một chất có dộ tinh khiết cao. › Xác dịnh luợng của của một chất nào dó. Sắc kí cột mở, sắc kí bản mỏng duợc sử dụng trong những truờng hợp tách tương đối đơn giản, còn HPLC là kỹ thuật tách những hỗn hợp phức tạp và có khả nang tách với dộ phân giải cao dể giải quyết những vấn dề nhanh hon và tốt hơn. Trong HPLC nhiều thông số phải duợc xác dịnh và thiết lập truớc khi mẫu duợc cho vào trong máy. Vì thế dể thành công với HPLC, cần thời gian dể thiết lập chế dộ và diều kiện hoạt dộng thích hợp cho máy trong mỗi phép phân t ích. Ðiều ny cú th mt hng gi hoc ngy tựy theo kinh nghim v kin thc ca ngui phõn tớch. 1.3.2. Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC Để thực hiện việc tách một hỗn hợp chất bằng kỹ thuật phân tích HPLC, chúng ta phải có các hệ thống trang thiết bị về kỹ thuật này. Hệ thống trang thiết bị của kỹ thuật HPLC, về cơ bản (đơn giản và đủ để làm việc đ ợc theo kỹ thuật HPLC) bao gồm 5 bộ phận chính sau đây: 1. Bơm cao áp: Để bơm pha động vào cột tách, thực hiện quá trình sắc ký, rửa giải chất tan ra khỏi cột sắc ký. Bơm này phải điều chỉnh đợc áp suất (0 - 400 bar) để tạo ra đợc những tốc độ nhất định của pha động qua cột tách phù hợp cho quá trình sắc ký, phải có tốc độ nằm trong vùng 0,5 - 5 mL/phút. 2. Van bơm mẫu: Để bơm mẫu phân tích vào cột tách theo những lợng mẫu nhất định không đổi trong một quá trình sắc ký. Đó là các van 6 chiều có chứa vòng mẫu có thể tích xác định (ví dụ 20, 50 hay 100L). Van 6 chiều chỉ có một vòng mẫu, nhng van 10 chiều thì có 3 vòng mẫu. 3. Cột tách: Là cột chứa pha tĩnh, trái tim của quá trình tách sắc ký, nó là một yếu tố quyết định hiệu quả sự tách sắc ký của một hỗn hợp chất mẫu. Cột tách có nhiều cỡ khác nhau, tuỳ thuộc vào mức độ sắc ký (bảng 1.1). Nói chung, các cột tách phân tích thờng có kích thớc chiều dài từ 10 - 25 cm; đờng kính trong từ 2 - 5 mm. 4. Trang bị phát hiện chất phân tích. Đây thờng là các loại Detector dựa theo các tính chất của chất phân tích, ví dụ : - Detector hấp thụ quang phân tử,vùng phổ UV hay UV-VIS, - Detector phổ phát xạ nguyên tử (AES, ICP-AES), - Detector phổ hấp thụ nguyên tử (AAS), - Detector phổ huỳnh quang phân tử, - Detector điện hoá (đo dòng, cực phổ, độ dẫn, điện lợng), - Detector chiết suất, - Detector đo độ dẫn nhiệt, - Detecor diode phát quang và diode mảng, - Detector phổ khối lợng (khối phổ: MS, ICP-MS), v.v. Tất nhiên phải tuỳ theo mỗi loại chất phân tích mà chọn loại detector nào cho phù hợp để đạt đ ợc độ nhạy cao khi phát hiện các chất, cũng nh đo định lợng chúng tốt nhất. Trong các loại trên, thì detector hấp phụ quang phân tử vùng phổ UV hay UV-VIS hiện nay đang đợc dùng phổ biến nhất. Vì nó thích hợp cho nhiều loại chất, và lại không quá đắt. 5. Trang bị ghi và hiện thị kết quả: Trang bị chỉ thị kết quả có nhiều loại, nhng đơn giản và phổ biến nhất là các máy tự ghi (recorder) để ghi tín hiệu đo dới dạng các pic của các chất, rồi đến bộ tích phân kế (Intergrator), sau đó máy tính kèm theo để xử lý kết quả và may in để in các kết quả tách. Đó là 5 bộ phận chính cần thiết tối thiểu phải có của một hệ thống máy HPLC. Hình 1.2 là sơ đồ khối về hệ thống này. Tất nhiên những hệ thống máy HPLC hoàn chỉnh, hiện đại, ngày nay còn có thêm 4 phần sau: 6. Bộ chơng trình gradient dung môi (pha động), 7. Bộ bơm mẫu tự động và pha loãng mẫu, 8. Bộ gia nhiệt và ổn nhiệt độ cho cột tách sắc ký, 9. Máy tính và các chơng trình (phần mềm) điều khiển, kiểm soát toàn bộ hệ thống HPLC và xử lý kết quả tách, lập báo cáo và in các kết quả sắc kí. Một cách tổng quát chúng ta có thể mô phỏng cấu hình nguyên tắc của chúng theo hình di õy : CHNG 2: NI DUNG NGHIấN CU. 2.1. Phân tích định lợng 2.1.1. Phơng trình cơ bản để định lợng Trong kỹ thuật HPLC, để định lợng một chất, ngời ta dựa theo hai phơng trình cơ bản sau đây về mối quan hệ giữa pic sắc ký (diện tích, hay chiều cao) của chất phân tích với nồng độ C của chúng đợc bơm vào cột tách. H = k.C b (4.1a) S = k.C b (4.1b) Trong đó: + H : Chiều cao pic sắc ký của chất. + S : Diện tích pic sắc ký của chất. + k : Hằng số của điều kiện thực nghiệm tách sắc ký. + b : Hằng số bản chất, nó nhận giá trị trong vùng: 0 < b < = 1. Nh vậy, khi b=1, thì mối quan hệ giữa H-C và S-C là tuyến tính. Trong 2 mối quan hệ này, thì quan hệ S C có vùng tuyến tính rộng hơn. Mối quan hệ của hai phơng trình trên đợc thể hiện trong hình 4.2. Trong thực tế phân tích ngời ta chỉ sử dụng vùng tuyến tính. [...]... Xác định chiều cao H hay diện tích S của pic sắc ký trong tất cả các mẫu chuẩn và mẫu phân tích (bảng 2.1) Dựng đờng chuẩn theo quan hệ Hi - Ci hay Si - Ci Sau đó từ các giá trị Hx hay Sx của mẫu phân tích áp vào đờng chuẩn tơng ứng chúng ta sẽ phát hiện đợc nồng độ của chất trong các mẫu phân tích đã đợc bơm vào cột tách sắc ký Bảng 2.1 Dẫy mẫu chuẩn và mẫu phân tích Các chất Co C1 C2 C3 C4 C5 Chất... các điều kiện sắc ký đã chọn (quy trình phân tích) , để định lợng một chất chúng ta phải làm nh sau: Pha chế (chuẩn bị) một dẫy mẫu chuẩn của chất phân tích Xi có nồng độ là từ C 0, C1, C2, C3, C4, C5 và các mẫu phân tích Cx1, Cx2, trong cùng điều kiện phù hợp (bảng 2.1) Với C0 là mẫu trắng Chọn các điều kiện (quy trình chạy sắc ký) để chạy sắc ký và ghi sắc đồ của dẫy mẫu chuẩn và các mẫu phân tích. ..Để phân tích định lợng các chất theo kỹ thuật HPLC, chúng ta có thể dùng một trong hai phơng pháp chuẩn hoá là phơng pháp đờng chuẩn và phơng pháp thêm tiêu chuẩn Việc chọn phơng pháp nào là tuỳ thuộc vào loại mẫu phân tích và hàm lợng chất phân tích Nồng độ chất, CX Hình 2.1 Mô tả mối quan hệ : H = f(C) và S = f(C) Trong nghiờn cu ny chỳng ta s dng ch yu l phng phỏp ng chun 2.1.2 Phơng pháp đờng... k1, k2 là các hằng số thực nghịệm, nó phụ thuộc vào các điều kiện sắc ký của hệ pha Trong hai mối quan hệ này, quan hệ Si - Ci theo biểu thức (b) có vùng tuyến tính rộng hơn quan hệ H i - Ci theo biểu thức (a) Nhng trong thực nghiệm, việc đo chiều cao pic H i là dễ hơn đo diện tích S i Vì thế trong phân tích lợng nhỏ (nồng độ nhỏ) ngời ta thờng đo chiều cao pic H Do đó nguyên tắc của phân tích định... S5 Phơng pháp đờng chuẩn có u việt là rất thích hợp để xác định hàng loạt một loại mẫu cùng đối tợng Nó đơn giản, nhanh và dễ thực hiện Hơn nữa trong một quá trình sắc ký, chúng ta có thể xác định (định l ợng) cùng một lúc trong một sắc đồ nhiều chất có trong một mẫu đồng thời Nhng khi mẫu phân tích có thành phần phức tạp, chúng ta không thể pha chế đợc một dẫy mẫu chuẩn phù hợp với mẫu phân tích về... thì thời gian l u của chất là đại lợng đặc trng để định tính (phát hiện) các chất Còn chiều cao của pic sắc ký H hay diện tích S của pic là có liên quan chặt chẽ đến nồng độ của chất Trong một vùng nồng độ nhất định và không lớn (b=1), thì chúng ta luôn có biểu thức xác định mối quan hệ đó là: Hi = k1.Ci Si = k2.Ci (a) và (b) Trong đó: + Hi và Si là chiều cao và diện tích của pic sắc ký của chất i... chúng ta không thể pha chế đợc một dẫy mẫu chuẩn phù hợp với mẫu phân tích về thành phần nền, thành phần hoá học và vật lý, thì sẽ bị mắc sai số lớn, do ảnh hởng của thành phần mẫu Nhất là xác định lợng vết các chất Trong trờng hợp này để loại trừ yếu tố Matrix Effect của mẫu, tốt nhất là dùng phơng pháp thêm tiêu chuẩn 2.2.X lý mu v o mu tht 2.2.1.X lý mu - i vi mu rn phi nghin hoc xay nh v ng nht k úng . TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA HÓA HỌC BÀI TIỂU LUẬN : SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO ĐỂ PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ VITAMIN B TRONG SỮA Sinh viên thực hiện: Trần Thị. thành phân dinh dưỡng quan trọng trong sữa đó là vitamin B. Có nhiều phương pháp để xác định hàm lượng vitamin trong sữa nhưng một trong những phương pháp hiện đại được sử dụng đó là phương pháp. chung, các cột tách phân tích thờng có kích thớc chiều dài từ 10 - 25 cm; đờng kính trong từ 2 - 5 mm. 4. Trang bị phát hiện chất phân tích. Đây thờng là các loại Detector dựa theo các tính