BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG VÀ SINH POLYSACCHARIDE NGOẠI BÀO CỦA CHỦNG NẤM MEN ĐẤT Lipomyces starkeyi PT 5.1 Người hướng dẫn: PGS. TS. Tống kim Thuần Sinh viên thực hiện: Tuấn Thị Thanh Vân Lớp: KSCNSH 0601 – K13 HÀ NỘI – 2010 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Tống Kim Thuần đã tận tình hướng dẫn chỉ bảo, tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành bài khóa luận này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tập thể nghiên cứu khoa học của phòng Công nghệ Vật liệu Sinh học và các phòng, ban khác trong Viện Công nghệ sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận này. Nhân dịp này tôi cũng tỏ lòng cám ơn chân thành tới các thầy, cô trong khoa Công nghệ Sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội đã trang bị kiến thức cho tôi trong quá trình học tập cũng như tạo điều kiện cho tôi được hoàn thành tốt quá trình thực tập. Cuối cùng, tôi xin gửi đến lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và những người thân đã ở bên tôi, tạo điều kiện cả về vật chất lẫn tinh thần để tôi hoàn thành bài khóa luận này. Hà nội, ngày 25 tháng 05 năm 2010 Sinh Viên Tuấn Thị Thanh Vân MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Mở đầu 1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ LIPOMYCES 3 1.1.1. Lịch sử về nghiên cứu giống nấm men Lipomyces 3 1.1.2. Hình thái và sinh sản vô tính của giống nấm men Lipomyces 4 1.1.3. Chu trình sống và quá trình hình thành bào tử của nấm men Lipomyces: 5 1.1.4. Đặc tính sinh hóa của nấm men Lipomyces 6 1.2. Chức năng của màng nhầy của vi sinh vật 7 1.3. Các điều kiện ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và khả năng sinh polysaccharide 8 1.4. Tiềm năng ứng dụng của polysaccharide sinh học này 11 1.5. Các nghiên cứu về polymer sinh học trên thế giới, Việt Nam và các ứng dụng của chúng 12 1.5.1. Trên thế giới 12 1.5.2. Ở Việt Nam 14 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 17 2.1. VẬT LIỆU 17 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 17 2.1.2. Dụng cụ và hoá chất 17 2.1.3. Môi trương nuôi cấy 18 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.2.1. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái 19 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng và sinh polysaccharide của nấm men PT 5.1 19 2.2.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của độ thoáng khí 19 2.2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH 20 2.2.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn nitơ 21 2.2.2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của các nồng độ (NH 4 ) 2 SO 4 21 2.2.2.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn Cacbon 22 2.2.2.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của các nồng độ Saccaroza khác nhau 22 2.2.3. Nghiên cứu động thái sinh trưởng và sinh polysaccharide 23 2.2.4. Phương pháp tách chiết polysaccharide ngoại bào 23 2.2.5. Phương pháp xác định trọng lượng khô của tế bào nấm men 24 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ 25 3.1. Đặc điểm sinh học của chủng nấm men Lipomyces starkeyi PT5.1 (L.starkeyi PT5.1) 25 3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng và sinh polysaccharide của chủng nấm men L.starkeyi PT5.1 25 3.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của độ thoáng khí 26 3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH 27 3.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn Nitơ 30 3.2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của các nồng độ (NH 4 ) 2 SO 4 33 3.2.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn cacbon 34 3.2.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của các nồng độ Saccaroza 36 3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ C : N lên khả năng sinh trưởng và sinh polysaccharide 38 3.4. Nghiên cứu động thái sinh trưởng và sinh polysaccharide 39 3.5. Quy trình thu sinh khối quy mô phòng thí nghiệm từ chủng nấm men L.starkeyi PT 5.1 44 3.6. Nghiên cứu tách chiết polysaccharide ngoại bào của chủng nấm men L.starkeyi PT 5.1 45 3.7. Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi : dịch màng nhầy lên việc thu nhận polysaccharide 46 3.8. Quy trình tách chiết polysaccharide ngoại bào của chủng nấm men L.starkeyi PT 5.1 47 KẾT LUẬN 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 CÁC TỪ VIẾT TẮT OD Mật độ quang (Optical density) v/p Vòng / phút đv/ml Đơn vị / ml VSV Vi sinh vật Tuấn Thị Thanh Vân Lớp KSCNSH 0601 - K13 Khoa Công nghệ Sinh Học Viện Đại Học Mở Hà Nội 1 Mở đầu Lĩnh vực khoa học và công nghệ vật liệu mới đã và đang đem lại những sản phẩm quan trọng, đồng thời tạo ra những xu hướng phát triển mới. Thí dụ, các lĩnh vực như vật liệu sinh học (Biomaterials) và vật liệu nano (Nanomaterials) đang có những bước phát triển mạnh mẽ. Các loại vật liệu sinh học mới này có khả năng ứng dụng rộng rãi, từ những ứng dụng thông thường, cho tới những ứng dụng đặc biệt. Các vật liệu này sẽ thông minh hơn, có nhiều chức năng hơn, thân thiện và thích hợp với nhiều điều kiện môi trường. Trong đó loại vật liệu mới là polymer sinh học đã và đang được các nhà khoa học trong nước và thế giới quan tâm nghiên cứu. Polysaccharide sinh học là thành phần quan trọng có trong các cơ thể sống như thực vật, tảo biển, vi sinh vật… Nó đóng vài trò như vật liệu dự trữ năng lượng, vật liệu cấu trúc, vật liệu hình thành gel của nội và ngoại bào… Polymer sinh học được hình thành từ các quá trình biến đổi sinh học như: quá trình hoạt động sống của vi sinh vật, quá trình sinh trưởng của thực vật, động vật…Các polymer sinh học rất đa dạng về chủng loại, cấu trúc phân tử. Khác với polymer tổng hợp, để biết được cấu trúc của polymer sinh học chúng ta phải dựa vào kết quả nghiên cứu, phân tích. Tuy nhiên, điều này không làm hạn chế tiềm năng sử dụng của các polymer sinh học trong các ứng dụng thực tiễn bởi tính tương thích sinh học cao, thân thiện với môi trường hơn so với polymer tổng hợp [12]. Ngoài ra, polysaccharide sinh học cũng là các polyme có cấu trúc mạch dài nên nó có các tính chất cơ lý tốt cho các ứng dụng như: kéo sợi, màng, keo, chất làm dầy, hydrogel (gel ướt), tác nhân truyền dẫn thuốc…Loại vật liệu này được hình thành từ các hợp chất sinh học nên nói chung nó là vật liệu an toàn, không có tính độc và có khả năng phân hủy sinh học tốt. Loại Tuấn Thị Thanh Vân Lớp KSCNSH 0601 - K13 Khoa Công nghệ Sinh Học Viện Đại Học Mở Hà Nội 2 polymer này được ứng dụng nhiều trong lĩnh vực y sinh, dược, thực phẩm, vật liệu dễ phân hủy sinh học…[9]. Nói đến polysaccharide từ vi sinh vật thì không thể không nói đến các vi sinh vật sinh màng nhầy, đó là những vi sinh vật mà bên ngoài thành tế bào còn có lớp nhầy hay dịch nhầy dạng keo, có độ nhầy bất định (hay còn gọi là giác mạc). Màng nhầy này chủ yếu cấu tạo từ polysaccharide, ngoài ra còn có màng nhầy cấu tạo từ polypeptide và protein [31]. Trong đất chứa rất nhiều vi sinh vật sinh màng nhầy. Nấm men Lipomyces cũng là một trong những nhóm vi sinh vật sinh màng nhầy tiêu biểu trong đất. Khi phân giải các hợp chất hữu cơ trong đất, nấm men tiết ra các chất nhầy mang bản chất polysaccharide. Vì vậy, hướng nghiên cứu khả năng sinh polysaccharide ngoại bào của chủng nấm men đất Lipomyces PT 5.1 là rất cần thiết. Do đặc tính sinh học của vi sinh vật là sinh sản và tổng hợp polyme ngoại bào rất nhanh (3-7 ngày). Nên nếu chúng ta tuyển chọn được các điều kiện thích hợp nhất để khả năng sinh polysacaride của chủng là cao nhất và nghiên cứu được phương pháp tách chiết, tinh sạch có hiệu xuất cao thì sẽ đem lại một nguồn polysaccharide vi sinh vật rất dồi dào. Nó cũng mở ra tiềm năng ứng dụng rộng lớn polymer vi sinh vật này vào các lĩnh vực khác nhau như Y tế, Nano-Sinh học, Nông nghiệp và Công nghiệp thực phẩm. Trên cơ sở những phân tích, đánh giá trên, chúng tôi tiến hành Đề tài: Nghiên cứu khả năng sinh trưởng và sinh polysaccharide ngoại bào của chủng nấm men đất Lipomyces starkeyi PT 5.1. Tuấn Thị Thanh Vân Lớp KSCNSH 0601 - K13 Khoa Công nghệ Sinh Học Viện Đại Học Mở Hà Nội 3 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ LIPOMYCES : 1.1.1. Lịch sử về nghiên cứu giống nấm men Lipomyces : Starkeyi – nhà vi sinh vật học người Mỹ là người đầu tiên phát hiện ra Lipomyces [18] . Khi nghiên cứu về chúng, ông phát hiện ra rằng: tế bào của chúng có chứa giọt mỡ lớn (tên Lipomyces cũng bắt nguồn từ đặc điểm này), chúng có khả năng hình thành bào tử. Song do kiểu tạo túi này đặc biệt nên ông phủ nhận việc mô tả Lipomyces như một số nấm men đất đã biết: Candida pulcherria, Torula lipofera [18], mà tách chúng thành một nhóm riêng. Đến năm 1952, Lodder và Kreger – van – Rij quyết định tách chúng thành một nhóm mới thuộc họ Endomycetoideae, họ phụ Lipomyces và chỉ có một chi Lipomyces [13]. Sau đó còn rất nhiều tranh cãi xung quanh việc phân loại Lipomyces [10, 13]. Sau khi nghiên cứu chi tiết chủng Lipomyces được phân lập từ các vùng đất khác nhau của Liên Xô cũ, Kraxilnikov và Babieva [9] đã phân chia những chủng này thành hai nhóm: + Zygo Lipomyces: nấm men tạo túi có chứa 4 bào tử. + Lipomyces: nấm men tạo túi có chứa nhiều bào tử. Hai nhóm này khác nhau theo một loạt dấu hiệu: Khả năng tạo túi bào tử, hình thái bào tử, đặc điểm hình thái và dựa vào những đặc điểm được công nhận thời đó mà Zygo Lipomyces được chia thành hai loại [11]: + Z. tetrasporus: Sử dụng glixerin, không đồng hoá lactoza. + Z. lactorus: không sử dụng glixerin nhưng đồng hoá lactoza. Nhờ những nghiên cứu sâu của các nhà khoa học về thành phần đường đơn trong polysaccharide ngoại bào của Lipomyces, rồi những nghiên cứu của các nhà khoa học Hà Lan về mối tương quan giữa thành phần polysaccharide Tuấn Thị Thanh Vân Lớp KSCNSH 0601 - K13 Khoa Công nghệ Sinh Học Viện Đại Học Mở Hà Nội 4 ngoại bào và cấu tạo bề mặt của bào tử túi [26] là những tiêu chuẩn được sử dụng trong khoá phân loại nấm men do Lodder và Kreger – van – Rij đưa ra vào năm 1970. Trong khoá phân loại này, các tác giả đã đưa thêm loài mới là Lipomyces kononenkoae với đặc tính màng ngoài bào tử nhẵn, thường không đồng hoá eritrit, khác hẳn Lipomyces stakeyi có khả năng đồng hoá eritrit, màng ngoài bào tử có nếp nhăn. Sau này nhờ những nghiên cứu mới các tác giả phủ nhận việc tách Lipomyces có 4 bào tử thành một nhóm riêng là Zygo Lipomyces [5]. Bởi vì không có sự khác nhau giữa việc tạo nang ở Lipomyces có 4 bào tử và Lipomyces có nhiều bào tử. Hai loài nấm men Z. tetrasporus và Z. lactorus mà nang có 4 bào tử giờ đây được hợp lại thành 1 loài Lipomyces tetasporus. Đến năm 1975, loài thứ năm Lipomyces anomalus đã được phát hiện. Ngày nay, chi Lipomyces gồm có 5 loài. Trong đó loài L. tetrasporus túi chứa 4 bào tử, bốn loài kia (L. anomalus, L. stakeyi, L. lipofer, và L. kononenkoae) nang chứa nhiều bào tử. 1.1.2. Hình thái và sinh sản vô tính của giống nấm men Lipomyces: Tế bào Lipomyces khá to, rất dễ phân biệt với các loại khác, đường kính tế bào vào khoảng 10 µm, một số trường hợp còn lớn hơn thế nữa. Tế bào phần lớn có hình tròn, trứng, hoặc ovan, ít khi hình trụ dài. Những chủng trong cùng một loài mà được phân lập từ các vùng đất khác nhau thì kích thước có thể thay đổi rất lớn. Thậm chí cũng có sự thay đổi kích thước của một chủng khi được cấy trên các môi trường khác nhau. Thỉnh thoảng trong chủng mới cấy xuất hiện những tế bào riêng biệt rất to chứa vài nhân. Chủng L. lipofer mọc trên môi trường khoai tây chứa 6 nhân và có kích thước lớn: đường kính 20 µm. Nhưng khi cấy truyền những tế bào này vào môi trường mới thì chúng lại trở về trạng thái kích thước ban đầu và chỉ có một nhân. Ở những tế bào non cơ cấu tế bào đồng nhất, khi tế bào già chứa nhiều nhân và xuất hiện giọt mỡ lớn [1]. [...]... bước nghiên cứu tiếp theo Kết quả ảnh hưởng của độ thoáng khí được minh họa trên hình 2 Hình 2: Ảnh hưởng của độ thoáng khí lên khả năng sinh trưởng và sinh polysaccharide của chủng nấm men L starkeyi PT 5.1 3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH : Trong thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường lên khả năng sinh trưởng và sinh polysaccharide của chủng nấm men Lipomyces PT 5.1, chúng tôi đã khảo... cấy lên khả năng sinh trưởng và sinh polysaccharide của nấm men PT 5.1: 2.2.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của độ thoáng khí : Chúng tôi nghiên cứu ảnh hưởng của 5 độ thoáng khí (v:v): 1/10, 1/5, 1/3, 2/5 và 1/2 lên khả năng sinh trưởng và sinh polysaccharide của chủng nấm men Lipomyces PT5.1 Thí nghiệm được tiến hành như sau : - Môi trường: sử dụng môi trường Hansen cải tiến (dịch thể) Khoa Công nghệ Sinh. .. thái tế bào của chủng dưới kính hiển vi quang học thấy rõ lớp vỏ nhầy polysaccharide bao quanh tế bào Đa số tế bào hình trứng, ít tế bào hình tròn Kích thước tế bào lớn khoảng 20 – 25 nm Nhiều tế bào nảy chồi và tế bào con Giọt mỡ trong tế bào to (chiếm gần hết tế bào) 3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng và sinh polysaccharide của chủng nấm men L starkeyi PT5.1: ... K13 2.2.3 Nghiên cứu động thái sinh trưởng và sinh polysaccharide: Sau khi nghiên cứu và tìm ra được các điều kiên thích hợp để chủng nấm men cho khả năng sinh polysaccharide là nhiếu nhất, chúng tôi tiến hành nghiên cứu Động thái sinh trưởng và sinh polysaccharide của chúng - Chuẩn bị môi trường: sử dụng môi trường Hansen cải tiến 3% Saccaroza, 0,1% (NH4)2SO4, pH = 7 - Môi trường được phân vào bình... yếu tố trên 3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của độ thoáng khí : Lipomyces là loại vi nấm hiếu khí, bởi vậy trong môi trường lên men độ thoáng khí ảnh hưởng rất lớn tới sự sinh trưởng và phát triển của chúng Để nghiên cứu ảnh hưởng của độ thoáng khí lên khả năng sinh trưởng và sinh màng nhầy của chủng nấm men PT5.1, chúng tôi đã khảo sát các tỷ lệ thoáng khí sau: 1/10, 1/3, 1/5, 1/2 và 2/5 (v:v) Thí nghiệm... C: pH = 6,0 D: pH = 7,0 Hình 3a: Ảnh hưởng của độ pH lên khả năng sinh polysaccharide của chủng nấm men L starkeyi PT 5.1 E: pH = 8,0 F: Môi trường Hansen Hình 3b: Ảnh hưởng của độ pH lên khả năng sinh polysaccharide của chủng nấm men L starkeyi PT 5.1 Kết quả cho thấy, ở dải pH từ 4 đến 7, chủng nấm men này đều có khả năng sinh trưởng và sinh màng nhầy Đặc biệt, trong quá trình phát triển, nó còn làm... trong), lượng sinh khối tế bào sau khi sấy khô chỉ bằng khoảng 1/10 lượng sinh khối tế bào ở các pH khác Điều này phù hợp với nghiên cứu của Babieva và Gorin năm 1978 rằng Lipomyces sinh trưởng được ở pH từ 4 đến 7 [1] Vì vậy, chúng tôi chọn pH môi trường ban đầu bằng 7 cho các nghiên cứu tiếp theo Bảng 2: Ảnh hưởng của độ pH lên khả năng sinh trưởng và sinh polysaccharide của chủng nấm men L.starkeyi... hưởng của độ thoáng khí lên khả năng sinh trưởng và sinh polysaccharide của chủng nấm men L starkeyi PT 5.1 (pHMt ban đầu = 7) Chỉ tiêu phân tích Các tỷ lệ thoáng khí 1/10 1/5 1/3 2/5 ½ 10,87 9,78 8,07 7,8 7,84 9,63 9,02 8,47 6,84 6,99 Polysaccharide sấy khô 80oC (g/l) Sinh khối (tế bào đã loại bỏ màng nhầy) sấy khô 105oC (g/l) Từ kết quả bảng 1 cho thấy: chủng PT5.1 đều có khả năng sinh trưởng và sinh. .. nhầy còn có rất nhiều chức năng quan trọng đang được nghiên cứu và ứng dụng, đặc biệt là khả năng cải tạo đất trống đồi trọc Đối với những vùng đất nghèo chất dinh dưỡng và khô cằn, chúng có khả năng tạo mùn cho đất, giữ đất, giữ nước và làm bền vững cấu tượng đất, chống xói mòn 1.3 Các điều kiện ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và khả năng sinh polysaccharide: * Nguồn cacbon: Lipomyces sử dụng nguồn cacbon... Cao nấm men 1 • Thạch 20 • Nước 1 lit • pH 7 * Môi trường Hansen cải tiến (thay nguồn pepton bằng nguồn (NH4)2SO4 0,1 % ) để nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện bên ngoài tới khả năng sinh polysaccharide của chủng PT 5.1 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 2.2.1 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái : Chủng nấm men nghiên cứu được nuôi cấy trên môi trường Hansen cơ sở để quan sát hình thái khuẩn lạc và . 1. 1.3. Chu trình sống và quá trình hình thành bào tử của nấm men Lipomyces: 5 1. 1.4. Đặc tính sinh hóa của nấm men Lipomyces 6 1. 2. Chức năng của màng nhầy của vi sinh vật 7 1. 3 lên khả năng sinh trưởng và sinh polysaccharide của nấm men PT 5 .1 19 2.2.2 .1. Nghiên cứu ảnh hưởng của độ thoáng khí 19 2.2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH 20 2.2.2.3. Nghiên. đầu 1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1. 1. ĐẠI CƯƠNG VỀ LIPOMYCES 3 1. 1 .1. Lịch sử về nghiên cứu giống nấm men Lipomyces 3 1. 1.2. Hình thái và sinh sản vô tính của giống nấm men Lipomyces