ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  LÊ MINH DUY Tên đề tài: XÁC ĐỊNH GIAI ĐOẠN HÌNH THÀNH VÀ KHẢO SÁT SỰ BIỆT HÓA CỦA NGUYÊN BÀO SỤN TRÊN GIÁ THỂ PLA Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Cán hướng dẫn : TS Trần Lê Bảo hà ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÊ MINH DUY ĐỀ CƢƠNG NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI LUẬN VĂN THẠC SĨ Tên đề tài: Xác định giai đoạn hình thành khảo sát biệt hóa nguyên bào sụn giá thể PLA Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số chuyên ngành: 62420201 Chƣơng trình: Phương thức Xác nhận cán hướng dẫn (Ký tên ghi rõ họ tên) TS Trần Lê Bảo Hà Tp HCM, tháng năm 2015 Giới thiệu tổng quát Tế bào bào gốc trưởng thành tế bào gốc sinh dưỡng có tiềm đầy hướng hẹn tái tạo mô thể Hiện nay, việc nghiên cứu sinh học ứng dụng trị liệu tế bào gốc trung mô nhà khoa học đặc biệt quan tâm Tế bào gốc trưởng thành (Adult stem cell, ASC) phân lập nghiên cứu từ nhiều nguồn mô khác thể tủy xương, dây cuống rốn, não, biểu mô, tủy gần nhát mô mỡ Mặc dù tế bào gốc trưởng thành hạn chế khả biệt hóa thành mơ quan khác chúng đảm nhiệm vai trị trì tính nội cân mơ thể cách phục hồi tế bào bị tuổi tác bị tổn thương Điều cho thấy chức tái tạo mô đầy triển vọng loại tế bào gốc Một số ASC quan tâm nghiên cứu nhiều tế bào gốc trung mô (Mesenchymal stem cell, MSC) nồi bật tế bào gốc mô mỡ Tế bào gốc mô mỡ (Adipose tissue-derived stem cell, ADSC) khơng có chung đặc điểm tế bào gốc trung mô tủy xương mà mang ưu điểm bật khác tiêu biểu việc thu nhận dễ dàng không cần trình phẫu thuật phức tạp Hơn nữa, tế bào gốc mơ mỡ cịn có tiềm biệt hóa thành tế bào trung mơ tế bào mỡ, tế bào xương, xương tế bào sụn, tế bào trung mô tế bào gan, tế bào nội tiết tuyến tụy, tế bào thần kinh, tế bào tim tế bào nội mô mạch máu [8] Hiện nay, ứng dụng tế bào bào gốc mô mỡ ngày phát triển đặc biệt lĩnh vực công nghệ tái tạo mô Công nghệ nghiên cứu sử dụng vật liệu sinh học để tạo mơ có đặc điểm chức tương tự thể nằm thay mô quan bị tổn thương Một ví dụ tiêu biểu lĩnh vực cơng nghệ tái tạo mơ sụn Mơ sụn khớp trưởng thành khơng có khả tự sửa chữa cách hiệu bị tổn thương bị lão hóa Việc sử dụng tế bào gốc mơ mỡ kích hoạt biệt hóa sụn nhằm thay mô sụn cho bệnh nhân thối hóa sụn khớp ứng dụng rộng rãi bệnh viện gặt hái thành công định Bên cạnh việc ứng dụng điều trị bệnh sụn khớp, công nghệ tái tạo mơ sụn cịn mở hướng đầy hứa hẹn cho lĩnh vực phẫu thuật thẩm mỹ nâng mũi tái tạo khuôn mặt [7] Với đặc điểm sống mũi khơng cao chóp mũi tẹt hầu hết phụ nữ châu Á, nhu cầu chỉnh sửa nâng mũi ngày lớn kéo theo công nghệ phẫu thuật ngày cang phát triên Cho đến có ba phương pháp nâng mũi sử dụng phổ biến nâng mũi silicon, chất làm dầy sụn Trong đó, phương pháp nâng mũi sụn ưa chuộng sỡ hữu ưu điểm bật so với hai phương pháp lại biến chứng, khối sụn dần đồng với thể tồn vĩnh viễn mà không cần tái phẫu thuật Nâng mũi sụn phương pháp đặt thêm miếng sụn da, dọc theo sống mũi để kéo dài, làm thẳng tạo hình thẩm mỹ phù hợp cho mũi Miếng sụn sụn nhân tạo hay sụn tự thân Trong đó, sụn tự thân thu nhận thông thương từ sụn sườn, sụn vành sụn vách ngăn người cần phẫu thuật Hiện nay, bác sĩ phẫu thuật phát triển thêm bước bọc miếng sụn chóp mũi Miếng sụn nhỏ lấy từ sụn vành tai với đường mổ khoảng – cm Việc giúp cho sống mũi nhân tạo không bị tụ, đầu mũi không bị biến chứng Tuy nhiên, phương pháp nâng mũi sụn đòi hỏi phải phẫu thuật lấy sụn từ nhiều vị trí thể không đảm bảo lượng sụn cần thiết để nâng sống mũi Việc sử dụng sụn nhân tạo giá thể 3D rỗng có cấu trúc tương tự sụn gây biến chứng cần tái phẫu thuật sau thời gian định Vì vậy, công nghệ tạo mô sụn từ tế bào gốc mơ mỡ bệnh nhân giải pháp đầy triển vọng cho vấn đề Để thu nhận mơ sụn với kích thước mong muốn tạo thẩm mỹ cho sống mũi, q trình biệt hóa sụn cần diễn giá thể phù hợp Một giá thể lý tưởng tái tạo mô phải bao gồm ba đặc điểm: tạo điều kiện thuận lợi cho tế bào bám dính phát triển, dễ dàng gia cơng thành cách hình dạng cụ thể có đủ độ bền để trì hình dạng Giá thể polylactic acid (PLA) xem giá thể ứng dụng thành công công nghệ tái tạo mô sụn mô sụn biệt hóa giá thể PLA có cấu trúc tương tự mô sụn tự nhiên PLA với cấu trúc phân tử (C3H4O2)n polyester nhiệt dẻo có khả phân hủy sinh học Ngày nay, thiết bị đại giúp gia công sợi PLA thành giá thể có hình dạng xác với sống mũi người từ miếng sụn tạo đạt kích thước lý tưởng cho phẫu thuật nâng mũi Với ưu điểm giá thể PLA, nhiều cơng trình nghiên cứu thực q trình biệt hóa tế bào gốc mơ mỡ giá thể khảo sát biệt hóa hình thành nên mơ sụn Tuy nhiên, phương pháp biệt hóa tế bào gốc mơ mỡ giá thể PLA khơng kiểm sốt tỷ lệ biệt hóa sụn khơng đảm bảo chất lượng miếng mô sụn tạo Trong đề tài đưa hướng giải sử dụng nguyên bào sụn, giai đoạn trung gian q trình biệt hóa sụn có tỷ lệ hình thành sụn cao hơn, để ni cấy biệt hóa giá thể PLA Điều đỏi hỏi phải xác định giai đoạn hình thành nguyên bào sụn khảo sát tăng trưởng biệt hóa nguyên bào sụn giá thể PLA Kết đề tài ứng dụng việc tối ưu khả biệt hóa sụn từ tế bào gốc mơ mỡ có sử dụng giá thể PLA, từ đảm bảo chất lượng miếng sụn phẫu thuật thẩm mỹ nâng mũi tái tạo khuôn mặt Bên cạnh đó, phương pháp sử dụng nguyên bào sụn để biệt hóa thành tế bào sụn với hiệu suất biệt hóa cao mở hướng việc điều trị bệnh sụn khớp Tình hình nghiên cứu nước: Cho đến nay, giới có nhiều đề tài nghiên cứu thức q trình biệt hóa sụn từ tế bào gốc trung mô hay tế bào gốc mô mỡ in vitro in vivo Một số đề tài cịn khảo sát biệt hóa sụn tế bào gốc mơ mỡ loại giá có thành phần khác Tuy nhiên, giai đoạn nguyên bào sụn chưa có đề tài nghiên cứu xác dịnh thời gian biệt hóa thành nguyên bào sụn từ tế bào gốc mô mỡ marker bề mặt đặc trưng cho giai đoạn Do đó, việc khảo sát biệt hóa nguyên bào sụn giá thể chưa nghiên cứu Gần đây, việc trị bệnh thối hóa khớp tế bào gốc mô mỡ tự thân ứng dụng bệnh viện lớn nước ta Trong năm 2012, bệnh viện Đại học Y dược áp dụng cho 20 trường hợp, tất điều cho kết tốt, bệnh nhân phục hồi chức khớp gối đạt 80-90% so với bình thường Nhiều bệnh viện lớn nước sử dụng kỹ thuật phân tách tế bào gốc mô mỡ tự thân mà nghiên cứu, thực nhiều nước giới việc điều trị thối hóa khớp gối Hiện nay, nước ta có nghiên cứu lâm sàng điều trị thối hóa khớp gối cách sử dụng tế bào gốc mỡ tự thân Điều cho thấy ứng dụng q trình biệt hóa sụn từ tế bào gốc mơ mỡ ngày trị liệu nước ta phổ biến quan tâm nghiên cứu Đối với phẫu thuật thẩm mỹ đặc biệt phẫu thuật nâng mũi, nước ta áp dụng thành công công nghệ phương pháp tiên tiến chuyển giao từ nước thu lợi nhuận to lớn Tuy nhiên phương pháp phẫu thuật nâng mũi hạn chế định Nội dung đề tài phần đưa hướng mới, phương pháp hoàn thiện phẫu thuật thẩm mỹ nâng mũi nói riêng cơng nghệ tái tạo mơ sụn nói chung Mục tiêu đề tài Đề tài bao gồm hai mục tiêu chính: - Xác định giai đoạn ngun bào sụn q trình biệt hóa sụn từ tế bào gốc mô mỡ - Khảo sát tăng trưởng nguyên bào sụn giá thể PLA Đối tƣợng nghiên cứu Nghiên cứu tiến hành đối tượng mẫu mô mỡ bụng người trưởng thành Nội dung nghiên cứu 4.1 Xác định giai đoạn hình thành nguyên bào sụn từ tế bào gốc mơ mỡ Trong q trình biệt hóa từ tế bào gốc trung mô thành tế bào sụn trải qua giai đọan như: (1) Tế bào gốc trung mô; (2) tế bào tiền sụn; (3) Nguyên bào sụn; (4) tế bào sụn chưa trương phồng; (5) tế bào sụn trương phồng Ở giai đoạn biệt hóa đặc trưng số gen mõa hóa cho chất ngoại bào sụn Do đó, để xác định giai đoạn hình thành nguyên bào sụn, phương pháp RT-PCR công cụ đắc lực để phát bắt đầu biểu gen đặc trưng cho giai đoạn Khi tế bào vào giai đoạn nguyên bào sụn kích hoạt biểu gen Collagen IIa1 (Col2a1), aggrecan (Acan) COMP (Cartilage oligomeric matrix protein) Khi tế bào bước sang giai đoạn tế bào bào bắt đầu kích hoạt biểu gen Collagen Xa1 (Col10a1) [6] Như sử dụng thông tin để xác định khoảng thời gian nguyên bào sụn hình thành cách thu hẹp mốc thời gian kiểm tra biển gen đặc trưng đồng thời kết hợp với khảo sát hiệu suất biệt hóa phương pháp nhuộm đặc trưng chất tế bào sụn (Toluidine Blue) Giai đoạn biệt hóa Tế bào trung mơ tạo sụn Các marker chất Col1a1 Các marker điều hịa Hình dạng tế bào Các nhân tố tăng trƣờng biệt hóa Sox9, Runx2 Shh, TGF-β Tiền nguyên bào sụn Col2a1, Acan, Crtl Sox9, Sox5, Sox6 TGF-β, Wnt-3A, Wnt7A FGF-2,4,8,10 BMP-2,4,7 Nguyên bào sụn Col2a1, Acan, Crtl1, Comp, Crtm Sox9, Sox5, Sox6 IGF-1 FGF-2/FGFR2 BMP-2,4,7,14 Tiền tế bào sụn Col2a1, Acan,Crtl1, Comp, Crtm Pthr1, Ihh FGF-18, FGFR-3 BMP-2,7 Runx2, Runx3 VEGF FGF-2, FGF-R1 Wnt14/β-catenin Tế bào sụn Col10a1 Các giai đoạn q trình biệt hóa sụn gen biểu đặc trưng [6] 4.1.1 Biệt hóa nguyên bào sụn từ tế bào gốc mơ mỡ ni cấy vón cục Khơng giống với q trình biệt hóa mỡ biệt hóa xương, yếu tố vật lý vi mơi trường tạo sụn đóng vai trị đặc biệt quan trọng q trình biệt hóa tế bào gốc trung mơ thành sụn Theo số cơng trình nghiên cứu, tương tác không gian ba chiều, tiếp xúc bề mặt tế bào gốc trung mô điều cần thiết cho biệt hóa sụn Khi tế bào gốc dược nuôi cấy theo phương pháp tếbào đơn khơng có kết biệt hóa thành sụn cho dù ni mơi trường có bổ sung nhân tố biệt hóa sụn Chỉ biệt hóa vi mơi trường ba chiều phù hợp, tế bào biểu proteoglycan, collagen isoform chất sụn hình thành [1] Vì thế, phương pháp ni cấy phổ biến sử dụng q trình biệt hóa sụn in vitro nhằm thiết lập mơi trường giúp tế bào gốc tương tác với như: nuôi cấy micromass, nuôi cấy gel alginate ni cấy vón cục Ni cấy vón cục phương pháp sử dụng đề tài Sau thu nhận nuôi cấy tế bào gốc mô mỡ từ tế bào mỡ, tế bào ADSC ni cấy vón cục để biệt hóa thành ngun bào sụn Ở mốc thời gian sau bắt đầu kích hoạt biệt hóa 1, 2, tuần thực RT-PCR cho gen Aggrecan, COMP, Col2a1, Col10a1 nhuộm Toluidine blue để xác định giai đoạn hình thành ngun bào sụn 4.1.1 Biệt hóa ngun bào sụn từ tế bào gốc mô mỡ nuôi cấy tế bào đơn Phương pháp ni cấy vón cục có hạn chế tế bào biệt hóa khơng đồng tế bào bên ngồi tiếp xúc với mơi trường biệt hóa nhiều tế bào nằm bên lõi cục vón Một số nghiên cứu công bố, tế bào gốc mơ mỡ kích hoạt biệt hóa điều kiện nuôi cấy tế bào đơn, tế bào diễn q trình biệt hóa sụn cho dù khơng có tương tác tế bào với tế bào Điều cho thấy điều kiện vi môi trường 3D giúp tế bào tương tác với thúc đẩy biệt hóa sụn ni cấy tế bào đơn điều kiện bắt buộc trỉnh biệt hóa sụn từ tế bào gốc mơ mỡ Vì cần thử nghiệm song song hai phương pháp biệt hóa sụn ni cấy vón cục ni cấy bám dính để lựa chọn nguyên bào sụn tạo từ phương pháp tốt [9] Sau thu nhận nuôi cấy tế bào gốc mô mỡ từ tế bào mỡ, tế bào ADSC nuôi cấy tế bào đơn biệt hóa thành nguyên bào sụn Ở mốc thời gian sau bắt đầu kích hoạt biệt hóa 1, 2, tuần thực RT-PCR cho gen Aggrecan, COMP, Col2a1, Col10a1 nhuộm Toluidine blue để xác định giai đoạn hình thành nguyên bào sụn 4.2 Tiếp tục biệt hóa sụn từ nguyên bào sụn giá thể PLA Nguyên bào sụn đưa lên giá thể PLA tiếp tục ni cấy mơi trường biệt hóa sụn vịng tuần Sau tiến hành thử nghiệm RT-PCR cho gen Col2a1 Col10a1, nhuộm tế bào Toluidine Blue, chụp SEM (Scanning electron microscope) flow cytometry cho marker CD10/14/26/151 để xác định tế bào sụn hình thành [5] 4.3 Sơ đồ nội dung nghiên cứu Tế bào gốc mô mỡ ADSC Nuôi cấy vón cục Ni cấy bám dính Xác định giai đoạn nguyên bào sụn RT-PCR Nhuộm Toluidine Blue Cấy nguyên bào sụn lên giá thể PLA Khảo sát tăng trưởng nguyên bào sụn giá thể PLA RT-PCR Nhuộm Toluidine Blue Chụp SEM Flow cytometry Phƣơng pháp nghiên cứu Đề tài sử dụng phương pháp nghiên cứu sau: - Thu nhận nuôi cấy tế bào gốc mô mỡ - Ni cấy bám dính, ni cấy vón cục - Biệt hóa sụn giá thể 3D - Nhuộm Toluidine, RT-PCR, chụp SEM, flow cytometry 5.1 Thu nhận nuôi cấy tế bào gốc mô mỡ [1] Môi trường tách chiết: • HBSS • Betadine iodine • Collagenase type I • PBS Mơi trường ni cấy cấy chuyển: • DMEM • 10% FBS • 1% Penicillin 100 U/mL + Streptomycin 100 àg/mL ã Trypsin/EDTA ã Gentamycin ã PBSA • IMDM Cách thực hiện: • Mơ mỡ cắt nhỏ rửa HBSS, betadine • Bổ sung collagenase, đặt bể ổn nhiệt 37oC 60p • Ly tâm thu cặn Huyền phù tế bào PBS tiếp tục ly tâm • Huyền phù cằn với mơi trường ni cấy Ủ 37oC, 5% CO2 • Thay mơi trường lần tuần • Khi tế bào phát triển 70 – 80% diện tích bình ni cấy chuyển 5.2 Phƣơng pháp ni cấy vón cục [2] Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp ly tâm với tốc độ hợp lý làm tế bào tụ lại với nhằm tạo điệu kiện môi trường tương tác tế bào với tề bào Sự tương tác tương tự cấu trúc mô sụn tự nhiên, giúp thúc đẩy biệt hóa sụn tế bào gốc Mơi trường biệt hóa sụn:  DMEM HG (Dulbecco‟s Modified Eagles Medium – High glucose)  Dexamethasone 100 nM  Penicillin/Streptomycin (100 μg/ml streptomycin, 100 U/ml penicillin)  ITS + (bovine insulin, transferrin, selenous acid, linoleic acid, BSA)  L-Ascorbic acid 2-phosphate 50mg/mL  FBS 10% + TGF-β1 10 ng/ml Cách thực hiện:  Thu nhận x 105 tế bào ADSC cho vào falcon 15 ml  Bổ sung ml mơi trường biệt hóa sụn  Ly tâm 500g phút Đổ bỏ dịch  Bổ sung 500 μl mơi trường biệt hóa sụn Ủ với nhiệt độ 37oC 5% CO2  Thay môi trường ngày lần 5.3 Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào đơn  Thu nhận x 105 tế bào ADSC cho vào đĩa bốn giếng  Bổ sung 400 μl mơi trường biệt hóa sụn Ủ với nhiệt độ 37oC 5% CO2  Thay môi trường ngày lần 5.4 Phƣơng pháp nuôi cấy giá thể 3D  Thu nhận x 106 nguyên bào sụn cấy vào giá thể đĩa petri  Ủ 37oC để tế bào bám dính vào giá thể  Bổ sung mơi trường biệt hóa sụn cho giá thể ngậm hết mơi trường  Ủ với nhiệt độ 37oC 5% CO2  Thay môi trường ngày lần 5.5 Các phƣơng pháp xác định nguyên bào sụn tế bào sụn 5.5.1 RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) Nguyên tắc: Phương pháp RT-PCR kết hợp phương pháp phiên mã ngược phương pháp PCR Phương pháp phát mRNA tồn với lượng thấp có mẫu Cách thực hiện: • Tách chiết RNA • Tạo cDNA • Chạy PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen Aggrecan, COMP, Col2a1, Col10a1, GADPH • Chạy điện di gel agarose 1% Mồi xuôi Gen Mồi ngƣợc Amplicon Aggrecan 5‟-CCTCTGGACAACCAGGTGTT-3‟ 5‟-AAACCAGGTCAGGGACTCCT-3‟ 174 bp COMP 5‟-AGGACAACTGCGTGACTGTG-3‟ 5‟-GTGTCC TTTTGGTCGTCGTT-3‟ 221 bp Col2a1 5‟-ACCCCAATCCAGCAAACGTT-3‟ 5‟-ATCTGGACGTTGGCAGTGTTG-3‟ 399 bp Col10a1 5‟-AGGTGCCAAAGGGGAACAAG-3‟ 5‟-AATCCTGGAATGCCTGGTGG-3‟ 429 bp GADPH 5‟-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3‟ 5‟-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3‟ 238 bp 5.5.2 Nhuộm mô tế bào Toluidine Blue Nguyên tắc: Toluidine Blue thiazine biến sắc có lực cao với thành phần mơ có tính acid Do đó, Toluidine blue liên kết với proteoglycan mang điện tích âm có chất sụn Sau rửa tuốc nhuộm, mẫu sụn bắt màu xanh dương đặc trưng Cách thực hiện: Chuẩn bị đóng khung mẫu vón cục:  Đưa mẫu vón cục vào 20 ml paraformaldehyde, ủ với nhiệt độ phòng  Dehydrate mẫu dung dịch EtOH  Rửa xylene  Bổ sung paraffin ủ với nhiệt độ 60oC 60 phút  Chuyển vào khung để qua điêm  Cắt lát mỏng 10 μm chuyển lên lame Nhuộm Toluidine Blue  Rehydrate mẫu với dung dịch EtOH Rửa với nước cất  Bổ sung dung dịch Toluidine Blue, ủ nhiệt độ phòng 20 phút Rửa với nước cất  Dehydrate mẫu với dung dịch EtOH  Rửa mẫu xylene  Quan sát trện kinh hiển vi 10 5.5.3 Flow cytometry Nguyên tắc: Flow cytometry kĩ thuật có độ nhạy cao dùng để xác định marker bề mặt tế bào Kĩ thuật sử dụng phương pháp nhuộm huỳnh quang gồm kháng thể kháng marker bề mặt có gắn màu huỳnh quang Sau đó, tế bào di chuyển theo dòng chất lỏng xuyên qua chùm tia sáng Khi tế bào có nhuộm huỳnh quang bị va đập ánh sáng tập trung chúng phát tín hiệu khác Tín hiệu cảm nhận máy dò, chuyển đến máy tính xử lý xuất thơng tin kết Cách thực hiện:  Thu nhận 106 tế bào trypsin/EDTA 0.25  Huyền phù tế bào ml Facs Flow nhuộm với 10 μl kháng thể kháng CD10/14/26/151 30 phút nhiệt độ phòng  Làm lạnh mẫu 15 phút 40C  Tiến hành đánh giá marker tế bào máy FACS Calibur sử dụng phần mềm Cell Quest Pro 5.5.4 Chụp SEM (Scanning electron microscope) Nguyên tắc: SEM loại kính hiển vi điện tử tạo ảnh với độ phân giải cao bề mặt mẫu vật cách sử dụng chùm điện tử electron hẹp quét lên bề mặt mẫu Việc tạo ảnh mẫu vật thực thông qua việc ghi nhận phân tích xạ phát từ tương tác chùm điện tử với bề mặt mẫu Ưu điểm phương pháp phân tích bề mặt mẫu mà khơng cần phá hủy mẫu thử Cách thực hiện:  Mẫu cắt lát mỏng cố định dung dịch 2.5% glutaraldehyde  Rửa lần với 0.2 M sodium cacodylate buffer (pH 7.4)  Cố định mẫu với 1% osmium tetraoxide rửa dung dịch cồn amyl acetate  Sấy khô  Mẫu bọc vàng quan sát thiết bị SEM 11 Dự kiến kết Giai đoạn hình thành nguyên bào sụn bắt đầu sau ngày đến 14 ngày sau kích thích biệt hóa tế bào gốc trung mô thành sụn Sau tuần biệt hóa sụn giá thể 3D, tế bào sụn hình thành số lượng nhiều Địa điểm thời gian thực Địa điểm: Phịng thí nghiệm nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc Thời gian: Từ tháng năm 2015 đến tháng năm 2015 STT Nội dung, công việc chủ yếu Kết dự kiến Thời gian thực Xác định giai đoạn hình thành Xác định thành công Tháng – 3/2015 nguyên bào sụn từ tế bào giai đoạn hình thành ADSC ni cấy vón cục ngun bào sụn Xác định giai đoạn hình thành Xác định thành cơng ngun bào sụn từ tế bào giai đoạn hình thành ADSC ni cấy TB đơn nguyên bào sụn Khảo sát tăng trưởng Đánh giá khả nguyên bào sụn giá thể biệt hóa thành sụn Tháng – 5/2015 Tháng – 7/2015 nguyên bao sụn Phân tích, tổng kết kết Hồn thành đề tài viết báo cáo 12 Tháng 8/2015 Tài liệu tham khảo 8.1 Tài liệu Tiếng Việt [1] Phan Kim Ngọc (2010), “Công nghệ tế bào gốc”, NXB Giáo dục Việt Nam 8.2 Tài liệu Tiếng Anh [2] Bradley T Estes, Brian O Diekman, Jeffrey M Gimble (2010), “Isolation of adipose derived stem cells and their induction to a chondrogenic phenotype”, Nat Protoc, 5(7), 1294–1311 [3] Francesco Carfì Pavia (2012), “Poly Lactic Acid Based Scaffolds for Vascular Tissue Engineering”, Chemical engineering transactions,27 [4] Gary S Firestein,Ralph C Budd,Sherine E (2012), „Cartilage and Chodrocytes”, Kelley's Textbook of Rheumatology volume 1, NXB Elsevier Health Sciences, 33 [5] Hamada T, Sakai T, Hiraiwa H (2013), “Surface markers and gene expression to characterize the differentiation of monolayer expanded human articular chondrocytes”, Nagoya J Med Sci, 75(1-2):101-11 [6] Hanna Taipaleenmäki (2010), “Factors regulating chondrogenic differentiation”, University of Turku [7] Liliana S Moreira- Teixeira (2011), “Cartilage Tissue Engineering”, Cartilage and Bone Development and Its Disorders, 21, 102–115 [8] Samira Yarak (2010), “Human adipose-derived stem cells: current challenges and clinical perspectives”, An Bras Dermatol, 85(5):647-56 [9] Stephane Boeuf, Wiltrud Richter (2010), “Chondrogenesis of mesenchymal stem cells: role of tissue source and inducing factors”, Stem Cell Research & Therapy,1: 31 13 ... bào sụn từ tế bào giai đoạn hình thành ADSC ni cấy vón cục ngun bào sụn Xác định giai đoạn hình thành Xác định thành công nguyên bào sụn từ tế bào giai đoạn hình thành ADSC ni cấy TB đơn ngun bào. .. định giai đoạn hình thành nguyên bào sụn khảo sát tăng trưởng biệt hóa nguyên bào sụn giá thể PLA Kết đề tài ứng dụng việc tối ưu khả biệt hóa sụn từ tế bào gốc mơ mỡ có sử dụng giá thể PLA, ... Dự kiến kết Giai đoạn hình thành nguyên bào sụn bắt đầu sau ngày đến 14 ngày sau kích thích biệt hóa tế bào gốc trung mơ thành sụn Sau tuần biệt hóa sụn giá thể 3D, tế bào sụn hình thành số lượng