BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI NGUYỄN THỊ VÂN KHẢO SÁT TẬP ðOÀN CÀ CHUA, PHÁT HIỆN GEN CHÍN CHẬM VÀ KHÁNG VIRUS XOĂN VÀNG LÁ BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số : 60 42 80 Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS. PHAN HỮU TÔN HÀ NỘI - 2012 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan tất cả số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn tốt nghiệp này là khách quan, trung thực và chưa từng ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam ñoan mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn tốt nghiệp này ñã ñược cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 15 tháng 9 năm 2012 Tác giả Nguyễn Thị Vân Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… ii LỜI CẢM ƠN ðể hoàn thành luận văn này, ngoài sự nỗ lực cố gắng của bản thân, tôi ñã nhận ñược sự quan tâm, giúp ñỡ rất tận tình của các thầy cô, bạn bè cũng như những người thân trong gia ñình. Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết sâu sắc tới PGS.TS Phan Hữu Tôn, người ñã tận tình hướng dẫn, giúp ñỡ tôi về chuyên môn trong suốt quá trình thực hiện ñề tài và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn KS. Tống Văn Hải và toàn thể cán bộ, nhân viên bộ môn Sinh học phân tử và công nghệ sinh học ứng dụng, Khoa công nghệ sinh học, ðH Nông nghiệp Hà Nội ñã rất nhiệt tình giúp ñỡ, tạo ñiều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong thời gian thực hiện ñề tài tại bộ môn. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trường ðH nông nghiệp Hà Nội ñã trang bị cho tôi những kiến thức cần thiết ñể có thể thực hiện ñề tài và hoàn thành luận văn. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia ñình, anh em, bạn bè ñã ñộng viên, giúp ñỡ và tạo ñiều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này. Hà Nội, ngày 15 tháng 9 năm 2012 Tác giả Nguyễn Thị Vân Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… iii MỤC LỤC Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii 1 MỞ ðẦU 1 1.1 ðặt vấn ñề 1 1.2 Mục ñích, yêu cầu 3 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1 ðặc ñiểm giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế của cà chua 4 2.2 Một số ñặc ñiểm nông sinh học của cây cà chua 5 2.3 Yêu cầu ñiều kiện ngoại cảnh của cây cà chua 5 2.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu cà chua chín chậm 7 2.5 Tổng quan tình hình nghiên cứu chọn tạo giống cà chua kháng bệnh virus xoăn vàng lá 15 2.6 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống cà chua trong nước 22 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 3.1 ðối tượng, vật liệu, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 25 3.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 26 3.3 Phương pháp xử lý số liệu 34 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 4.1 Khảo sát ñánh giá các mẫu giống trong vụ ñông xuân (2012) 35 4.1.1 Các giai ñoạn sinh trưởng 35 4.1.2 Một số ñặc ñiểm hình thái và cấu trúc cây 37 4.1.3 Cấu trúc chùm hoa và ñặc ñiểm nở hoa 41 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… iv 4.1.4 ðánh giá tình hình nhiễm bệnh một số bệnh hại chính trên ñồng ruộng 43 4.1.5 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất 46 4.1.6 ðặc ñiểm hình thái quả 49 4.1.7 ðặc ñiểm chất lượng quả 52 4.2 Kết quả PCR phát hiện gen chín chậm rin 55 4.3 ðánh giá ñặc tính chín chậm của quả 56 4.4 Kết quả PCR phát hiện gen kháng virus xoăn vàng lá 58 4.4.1 Kết quả PCR phát hiện gen Ty-1 58 4.4.2 Kết quả PCR phát hiện gen Ty-2 59 4.4.3 Kết quả PCR phát hiện gen Ty-3 59 4.5 ðề xuất một số mẫu giống cà chua triển vọng 60 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63 5.1 Kết luận 63 5.2 Kiến nghị 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 PHỤ LỤC 69 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT - PCR: Polymerase Chain Reaction: Phản ứng chuỗi trùng hợp DNA - TYLCV: Tomato yellow leaf curl virus - ACC : 1-aminocylopropane-1-carbonxylic acid. - Cnr : Colorless non-ripening. - ETB : Ethidium bromide. - DNA : Deoxyribonucleotide acid. - dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate - EDTA : Ethylene Diamine Tetra Acetic - FAO : Food and Agriculture Organization. - Gr : Green ripe. - rin : ripening inhibitor. - Nor : non-ripening. - Nr : Never ripen. - PG : enzyme polygalacturonase. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… vi DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 3.1 Nguồn vật liệu sử dụng trong nghiên cứu 25 4.1 Các giai ñoạn sinh trưởng của các mẫu giống vụ ñông xuân 2012 35 4.2 Một số ñặc ñiểm cấu trúc cây của các mẫu giống vụ ñông xuân 2012 38 4.3 Cấu trúc chùm hoa và ñặc ñiểm hoa của các mẫu giống vụ ñông xuân 2012 42 4.4 Thống kê sơ bộ tình hình nhiễm một số loại sâu bệnh hại của các giống cà chua 45 4.5 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các mẫu giống vụ ñông xuân 2012 47 4.6 Một số ñặc ñiểm hình thái quả của các mẫu giống vụ ñông xuân 2012 50 4.7 Một số ñặc ñiểm về chất lượng quả vụ ñông xuân 2012 53 4.8 ðánh giá ñặc tính chín chậm quả các giống cà chua mang gen rin 57 4.9 Một số giống cà chua có triển vọng 62 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… vii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1 Sơ ñồ tổng hợp Ethylen theo Chalves & Mello-Farias, 2006 8 2.2 Sơ ñồ phương pháp tạo cà chua chín chậm dựa vào sinh tổng hợp Ethylen 10 2.3 Sơ ñồ thể hiện cơ chế ñiều hòa, tác ñộng của ethylen 11 2.4 Sự khác biệt về cấu trúc của 5 loại receptor ethylen ở cà chua 12 2.5 Bản ñồ gen rin trên nhiễm sắc thể số 5 của cà chua 14 2.6 Bản ñồ gen của Gr và Nr-2 trên nhiễm sắc thể số 1 của cà chua 15 2.7 Gen Ty-1 nằm trên NST số 6 18 2.8 Vị trí gen Ty-2 trên nhiễm sắc thể số 11 18 2.9 Gen Ty-3 nằm trên NST số 6 20 2.10 Gen Ty-4 nằm trên trên NST số 3 20 2.11 Bản ñồ khoảng cách cM giữa các marker gen Ty-5 trên nhiễm sắc thể 4 21 4.2 Ảnh ñiện di sản phẩm chạy PCR phát hiện gen chín chậm rin 56 4.3. Ảnh ñiện di sản phẩm PCR phát hiện gen Ty-1 với cặp mồi JB-1 58 4.4 Ảnh ñiện di sản phẩm PCR phát hiện gen Ty-2 bằng cặp mồi T0302F/TY-2R1 59 4.5 Ảnh ñiện di sản phẩm PCR phát hiện gen kháng Ty-3 60 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… 1 1. MỞ ðẦU 1.1. ðặt vấn ñề Cây cà chua (Licopersicum esculentum Mill) thuộc họ cà (Solanaceae) có nguồn gốc từ Châu Mỹ là loại rau ăn quả có giá trị dinh dưỡng cao, ñược trồng với diện tích lớn nhất trong các cây rau. Quả cà chua có nhiều giá trị dinh dưỡng cao, ñặc biệt là trong quả chín có nhiều loại vitamin và khoáng chất rất có lợi cho sức khỏe con người. Ngoài ra cây cà chua còn ñược nhiều phòng thí nghiệm sử dụng làm cây mô hình cho các nghiên cứu di truyền, tế bào và chọn giống ở thực vật bậc cao. Hiện nay ở các nước châu Âu, ngoài giá trị dinh dưỡng, quả cà chua ñược dùng như một nguồn dược liệu làm chất chống oxy hóa ở người. Sản xuất cà chua ở miền Bắc nước ta khá thuận lợi ñặc biệt là vụ ñông xuân nên loại rau này ñược trồng chủ yếu từ tháng 10 ñến tháng 4 năm sau (chiếm 70% sản lượng thu hoạch). Vụ ñông xuân là thời kỳ có nhiều yếu tố môi trường như nhiệt ñộ, ẩm ñộ, ánh sáng , rất thuận lợi cho cà chua sinh trưởng, phát triển và ít bị sâu bệnh phá hại nên năng suất và chất lượng khá cao. Tuy nhiên do thu hoạch tập trung nên giá tương ñối thấp ảnh hưởng ñến thu nhập của người sản xuất. Trong khi ñó, từ tháng 6 ñến tháng 9 do thời tiết nóng bức nên nhu cầu cà chua ăn tươi, làm nước giải khát hay phục vụ chế biến và công nghiệp ñồ hộp rất cao, giá cà chua lúc này có lúc tăng gấp 2 – 3 lần thời ñiểm chính vụ. Vì thế, ñã có nhiều biện pháp kỹ thuật nhằm rải vụ cà chua như trồng sớm hoặc muộn, trồng trong nhà lưới và dùng các giống chống chịu nóng, úng và sâu bệnh. Tuy nhiên do ñiều kiện thời tiết không thuận lợi nên hầu hết các giống cà chua mới chọn tạo của ta hiện nay chưa thích ứng tốt và ñem lại hiệu quả kinh tế khi trồng trái vụ. Hiện nay nhờ sự phát triển của khoa học công nghệ nhiều nước trên thế giới như Mỹ, Pháp và Nhật ñã tạo ñược nhiều giống cà chua có tính chín Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… 2 chậm hoặc không chín. Những giống cà chua có ñặc tính này quả dù ñạt kích thước và tích luỹ ñủ chất khô nhưng không chín trên cây do mất khả năng sinh tổng hợp ethylene - là hoocmon tín hiệu giúp hoạt hoá nhiều enzyme xúc tiến cho quá trình làm quả chín. Tính chín chậm hoặc không chín ñược xác ñịnh là do một số gen quy ñịnh như: gen ức chế quá trình chín của quả, ký hiệu là rin (ripening inhibitor) nằm trên nhiễm sắc thể 5 (Vrebalov và cộng sự, 2002), gen nor (non-ripening) và gen Nr (Never-ripening) quy ñịnh tính không chín… Hiện nay người ta ñã tìm thấy một số chỉ thị phân tử DNA ñể phát hiện và chọn lọc các gen gây nên tính chín chậm này. Quả cà chua chín chậm có thời gian sử dụng lâu hơn, ñộ cứng cao hơn cà chua thông thường do ñó ít bị thối dập trong khi vận chuyển, kéo dài ñược thời gian bảo quản cũng như thời gian sử dụng mà vẫn ñảm bảo chất lượng. Chính vì thế, chọn tạo giống cà chua có ñặc tính chín chậm là một giải pháp ưu việt nhằm rải vụ trong nhà mà không cần trồng trái vụ trên ñồng ruộng. Mặt khác một trở ngại gây ảnh hưởng lớn ñến nền sản xuất cà ở miền bắc cũng như nhiều nơi trên thế giới gặp phải là sự phá hại nặng của virus, ñặc biệt ở vụ sớm, muộn và trái vụ. Cho ñến nay, biện pháp sử dụng giống cà chua kháng virus ñược coi là hướng hiệu quả nhất ñể phòng chống bệnh. Chính vì vậy, chọn tạo giống cà chua có khả năng kháng virus là rất cần thiết. Hiện nay, ñã có 5 gen kháng virus ñược phát hiện là Ty-1, Ty-2, Ty-3, Ty-4 và Ty-5. Các chỉ thị phân tử DNA dựa trên PCR phát hiện gen Ty-1 (marker JB-1), Ty-2 (T0302) và Ty-3 (P6-25) cũng ñã ñược phát triển và sử dụng rộng rãi (Pena và cộng sự, 2010). ðiều này có ý nghĩa rất quan trọng trong việc phát hiện các gen kháng virus và chọn tạo các giống cà chua có tính kháng bệnh. Trong quá trình giao lưu và hợp tác, bộ môn Sinh học phân tử và công nghệ sinh học ứng dụng ñã thu thập ñược một tập ñoàn các mẫu giống cà chua ña dạng, phong phú, có chứa các gen chín chậm và kháng virus xoăn vàng lá. [...]... tính chín ch m và kháng virus xoăn vàng lá trên ñ ng ru ng c a các m u gi ng cà chua thu th p - Phát hi n gen chín ch m và kháng virus xoăn vàng lá trong t p ñoàn cà chua b ng ch th phân t DNA - Tuy n ch n ñư c m t s dòng gi ng t t 1.2.2 Yêu c u - Kh o sát các ñ c ñi m sinh trư ng, phát tri n, năng su t và ch t lư ng qu c a các gi ng cà chua nh p n i - ng d ng ch th phân t DNA ñ phát hi n gen chín... gi ng có ñ c tính chín ch m và kháng virus xoăn vàng lá thì c n thi t ph i kh o, sát ñánh giá ñ c ñi m nông sinh h c, năng su t, ch t lư ng, kh năng mang gen kháng virus và gen chín ch m ð ñáp ng ñư c yêu c u trên dư i s hư ng d n c a PGS TS Phan H u Tôn chúng tôi ñã ti n hành ñ tài: “Kh o sát t p ñoàn cà chua, phát hi n gen chín ch m và kháng virus xoăn vàng lá b ng ch th phân t DNA 1.2 M c ñích,... nghiên c u ch n t o gi ng cà chua kháng b nh virus xoăn vàng lá Nhìn chung, các nghiên c u t o gi ng cà chua kháng b nh xoăn vàng lá ñi theo các hư ng ch y u: (1) t o gi ng kháng vector b ph n; (2) t o gi ng kháng virus xoăn vàng lá nh nh ng ngu n kháng t nhiên t cà chua d i và (3) t o gi ng kháng b nh nh ngu n kháng t virus thông qua công ngh RNAi Trong ñó, t o gi ng mang tính kháng t nhiên ñư c cho... loài begomovirus b gen kép (bipartite begomovirus) và b i s khác bi t trong chu i DNA [4], [34] Các loài begomovirus b gen kép (bipartite genome) g m hai phân t DNA s i vòng ñơn: DNA- A (2,6-2,8 kb) và DNAB (2,5-2,8 kb) (Gronenborn, 2007) [23], các loài có b gen ñơn tương ñương phân t DNA- A Vi t Nam ñã phát hi n có 3 loài begomovirus gây ra b nh xoăn vàng ng n cà chua là Tomato leaf curl Vietnam virus (ToLCVV);... (TYLCKaV) vàTomato yellow leaf curl Vietnam virus (TYLCVNV) [23] 2.5.2 Nghiên c u v các ngu n gen kháng virus xoăn vàng lá Loài cà chua tr ng (Solanum lycopersicum) c c kỳ m n c m v i virus xoăn vàng lá (Tomato yellow leaf curl virus – TYLCV) Tuy nhiên, m c ñ kháng cao v i TYLCV ñã ñư c tìm th y trong các loài cà chua d i S pimpinellifolium, S peruvianum, S chilense, S habrochaites, và S cheesmaniae M t vài... Chi u cao và s nhánh r t khác nhau ph thu c vào gi ng và ñi u ki n tr ng tr t R cà chua thu c h r chùm, trên ñ ng ru ng r cà chua có th phát tri n r ng t i 1,3 m và sâu t i 1 m V i kh i lư ng r l n như v y, cà chua ñư c x p vào nhóm cây ch u h n Lá cà chua ña s thu c d ng lá kép, các lá chét có răng cưa, có nhi u d ng khác nhau: d ng chân chim, lá khoai tây, lá t tuỳ thu c vào gi ng mà lá cà chua có... , c a các m u gi ng cà chua nh p n i v ñông xuân 2 Phát hi n gen chín ch m rin trong t p ñoàn các m u gi ng b ng phương pháp PCR 3 Phát hi n các gen kháng virus xoăn vàng lá: Ty-1, Ty-2, Ty-3 trong t p ñoàn các m u gi ng b ng phương pháp PCR 4 ðánh giá ñ c tính chín ch m c a qu c a các m u gi ng mang gen chín ch m rin (phát hi n nh PCR) và so sánh v i m t s m u gi ng không mang gen rin 3.2.2 Phương... ng b nh (Pena và c ng s , 2010) [34] 2.5.1 Nguyên nhân gây b nh virus xoăn vàng lá B nh xoăn vàng lá cà chua l n ñ u tiên ñư c xác ñ nh t i Israel vào năm 1930 và hi n nay ñã ñư c xác ñ nh do m t nhóm các loài begomovirus khác nhau thu c h geminivirus gây ra, ñư c lan truy n b i vector b ph n tr ng (Bemisia tabaci) theo ki u b n v ng tu n hoàn (Hà Vi t Cư ng, 2008) [5] M c dù nhóm geminivirus này bao... i và cho phép s n xu t th nghi m trên di n r ng t tháng 10/2006 M c dù ñã có nh ng thành t u ñáng k v ch n t o các gi ng cà chua có năng su t cao, chât lư ng t t, ch ng ch u ñư c m t s b nh nhưng ch n t o gi ng cà chua kháng virus xoăn vàng lá và chín ch m v n còn là m t v n ñ l n ñ i v i các nhà ch n gi ng trong nư c Nghiên c u ch n t o gi ng cà chua năng su t cao, ch t lư ng t t, chín ch m và kháng. .. chúng v n ñư c g i chung là virus xoăn vàng lá cà chua - Tomato yellow leaf curl virus (Vidavski, 2007) [39] Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p …………………… 15 TYLCVD cho ñ n nay ñư c bi t có liên quan t i ít nh t 11 loài và hơn 25 ch ng monopartite begomoviruses (Fauquet và c ng s , 2008) [20] B nh virus xoăn lá cà chua (Tomato leaf curl virus disease - ToLCVD) có . tính chín chậm và kháng virus xoăn vàng lá trên ñồng ruộng của các mẫu giống cà chua thu thập. - Phát hiện gen chín chậm và kháng virus xoăn vàng lá trong tập ñoàn cà chua bằng chỉ thị phân tử. DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI NGUYỄN THỊ VÂN KHẢO SÁT TẬP ðOÀN CÀ CHUA, PHÁT HIỆN GEN CHÍN CHẬM VÀ KHÁNG VIRUS XOĂN VÀNG LÁ BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA. Phan Hữu Tôn chúng tôi ñã tiến hành ñề tài: Khảo sát tập ñoàn cà chua, phát hiện gen chín chậm và kháng virus xoăn vàng lá bằng chỉ thị phân tử DNA . 1.2. Mục ñích, yêu cầu 1.2.1. Mục ñích