Đang tải... (xem toàn văn)
TILLING (Targetting Induced Local Lesions In Genomes: đột biến gene có chủ đích) là một phương pháp sinh học phân tử cho phép xác định hướng của các đột biến ở một gen cụ thể. Quá trình tiến hóa trong tự nhiên diễn ra một cách chậm chạp thông qua sự hình thành các đột biến, chọn lọc các đột biến, sau đó các loài động thực vật phản ứng thích nghi và biến đổi. Tilling là kết quả của quá trình tạo giống mà các nhà nghiên cứu muốn sử dụng để đẩy nhanh quá trình tiến hóa thêm bước nữa
KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA TILLING TRONG CHỌN GIỐNG CÂY TRỒNG – VẬT NUÔI TILLING Lưu T. Phương Thảo 1. Đặt vấn đề. 2. Tìm hiểu về Tilling a. Tilling là gì? b. Các bước cơ bản của Tilling 3. Khả năng ứng dụng của Tilling NỘI DUNG Đột biến là một phương pháp quan trọng của ngành chọn giống cây trồng, vật nuôi, cho tới năm 2007 đã có tới trên 2.700 giống cây trồng đột biến thuộc 175 loài thực vật đã được chọn tạo và đưa ra sản xuất. Để nâng cao hiệu quả và thúc đẩy nhanh quá trình chọn tạo giống, với bước tiến mạnh mẽ của công nghệ sinh học hiện đại, đang đưa ngành chọn giống đơn thuần từ mò mẫm, không định hướng, nặng về định tính đến một kỷ nguyên phát triển mới, hình thành ngành Công nghệ sinh học Chọn giống đột biến với các phương pháp gây tạo đột biến có chủ đích TILLING, phương pháp GENOMICS sàng lọc phân tử, định vị gen đột biến, tìm ra cơ chế biến đổi gen, chuyển và nhân gen đột biến, tạo ra thư viện các gen đột biến ở từng loại cây trồng để cho cả nhân loại sử dụng, đi sâu vào cơ chế tác động của gen đột biến, góp phần cải thiện tích cực năng suất, thành phần sinh hóa và dinh dưỡng, chất lượng của nông sản. 1. ĐẶT VẤN ĐỀ 2. TÌM HiỂU VỀ PHƯƠNG PHÁP TILLING a. TILLING là gì ? TILLING (Targetting Induced Local Lesions In Genomes: đột biến gene có chủ đích) là một phương pháp sinh học phân tử cho phép xác định hướng của các đột biến ở một gen cụ thể. Quá trình tiến hóa trong tự nhiên diễn ra một cách chậm chạp thông qua sự hình thành các đột biến, chọn lọc các đột biến, sau đó các loài động thực vật phản ứng thích nghi và biến đổi. Tilling là kết quả của quá trình tạo giống mà các nhà nghiên cứu muốn sử dụng để đẩy nhanh quá trình tiến hóa thêm bước nữa. Tilling đã được giới thiệu vào năm 2000, sử dụng mô hình Arabidopsis thaliana. Tilling từ đó đã được sử dụng như một phương pháp đảo ngược di truyền trong sinh vật khác như cá ngựa, ngô, lúa mì, gạo, đậu tương, cà chua và rau diếp Corn Soybean Broken rice Lettuce Tomato 1. Xử lý đột biến EMS + Hạt giống xử lý đột biến EMS ( Mo) + Trồng cây EMS ( M1) tự thụ rồi thu hạt. + Trồng cây EMS ( M2) tự thụ, rồi thu hạt. 3. Thu hoạch hạt giống của M2 , lưu giữ hạt M2 trong ngân hàng hạt giống. Tách DNA từ các mẫu lá . 4. DNA đã tách được cho lần lượt vào các giếng trên các đĩa giếng PCR 7. Khuếch đại chuỗi nucleic acid đích bằng PCR, mồi được đánh dấu bằng gắn huỳnh quang. Sản phẩm khuếch đại được ủ và biến tính với một endonuclease như CEL I để cho phép hình thành các heteroduplexes. Do có mutant ở từng nucleotide > heteropolymorphism xảy ra > hình thành thể mismatch. 5. CEL I nuclease được sử dụng để cắt tại điểm mismatches. 6. Sử dụng DHPLC để phát hiện sự có mặt của heteroduplexes trong giếng. 7. DNA được tách theo từng kích cỡ bằng LI-COR 4300 DNA Analysis System. 8. Xác định các cá thể đột biến. Giải trình tự sản phẩm đột biến của PCR ( Xem các sơ đồ 1, 2 ,3 của trang sau). b. CÁC BƯỚC CƠ BẢN CỦA TILLING B. CÁC BƯỚC CƠ BẢN CỦA TILLING Hình 1 Các chất gây đột biến hóa học trong Tilling được áp dụng như ethyl methanesulfonate (EMS- là một tác nhân hóa học chủ yếu gây nên quá trình chuyển đổi C » T và G » A trên toàn bộ gen) và N-nitroso -N- methylurea ( NMU ) cho cây trồng và ruồi giấm còn ethylnitrosourea ( ENU ) áp dụng trong cá và động vật có vú. Nhóm 1 Nhóm 2 Hạt đã được EMS (hạt từ cây Mo) Cây M1 Cây M2 Ngân hàng hạt giống DNA pools Nhóm 1 Nhóm 2 Nhóm 1 Nhóm 2 B. CÁC BƯỚC CƠ BẢN CỦA TILLING Hình 2: Các bước thu nhận DNA từ cây M2 B. CÁC BƯỚC CƠ BẢN CỦA TILLING Hình 3 3. Ứng dụng của PHƯƠNG PHÁP TILLING [...]... được thu hoạch vào mùa thu năm 2012 b Ứng dụng của TILLING trên cà chua ( THAM KHẢO) Phenotypes in Population A (Heinz 1706, EMS) (Kiểu hình trong quẩn thể A) b Ứng dụng của TILLING trên cà chua ( THAM KHẢO) Variation in morphological traits in M2s of population A (Sự thay đổi về đặc điểm hình thái trong M2s của quần thể A) b Ứng dụng của TILLING trên cà chua ( THAM KHẢO) Variation in fruit color in M2s... a Ứng dụng của PHƯƠNG PHÁP TILLING trên cà chua b Ứng dụng của TILLING trên cà chua ( THAM KHẢO) Phòng thí nghiệm thuộc trung tâm UCD Genome được tài trợ bởi Bộ nông nghiệp Mỹ - NRI Genome đã áp dụng phương pháp Tilling trên cây cà chua Những người tham gia dự án: Junda Jiang (Tomato breeder and molecular biologist), Allen Van Deynze (co-PI), Roger Chetelat (co-PI), and Luca Comai (PI) b Ứng dụng của. .. trí của các đột biến Sọc đen đại diện cho các mảnh vỡ PCR đã được phân tích (B) ProDH đột biến được xác định trình tự G» A và C » T quá trình chuyển đổi được xác định là đỉnh đường cong của biểu đồ Hình 9 a Ứng dụng của PHƯƠNG PHÁP TILLING trên cà chua a Ứng dụng của PHƯƠNG PHÁP TILLING trên cà chua Hình 10: Tổng quan về màn hình đột biến cho ProDH trên dân số M2 Hình 10 a Ứng dụng của PHƯƠNG PHÁP TILLING. .. of population A (Sự thay đổi trong màu sắc trái cây M2s trong quần thể A) b Ứng dụng của TILLING trên cà chua ( THAM KHẢO) Variation in fruit shape in M2s of population A (Sự thay đổi trong hình dáng quả M2s trong quần thể A) b Ứng dụng của TILLING trên cà chua ( THAM KHẢO) Tình hình hiện tại Tháng Chín 2010 Tỷ lệ đột biến của quần thể VFNT - 140x2 bất ngờ thấp (1 đột biến / Mb hoặc ít hơn) Một quần... từ quẩn thể M2 Đường cong nóng chảy màu hồng tương ứng với giếng có chứa một đột biến trong đoạn C » T đột biến trong đoạn Hình 8 a Ứng dụng của PHƯƠNG PHÁP TILLING trên cà chua Những đường cong khác nhau được xác định là nhiệt độ nóng chảy homoduplexes (Hình 8) Hình 8 a Ứng dụng của PHƯƠNG PHÁP TILLING trên cà chua Hình 9: (A) PARSESNP định vị đồ họa của SNPs xác định Hộp màu cam thể hiện trình tự mã... được gộp lại với nhau và các mao dẫn chứa đầy CAP polymer Bể chứa một đột biến được xác định bằng cách sử dụng Toán ứng dụng Applied Maths' HDA peak ana-lyser Sau khuếch đại PCR với sự có mặt của LC-xanh + ™, các giếng được phân tích nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm Hình 4 a Ứng dụng của PHƯƠNG PHÁP TILLING trên cà chua Một số đột biến ở M2: Xem hình 4 Ở M2 cho thấy một loạt các kiểu hình đột biến cho... biến Expansin1 + (E) Đột biến Expansin1 thứ 2 Hình 7 a Ứng dụng của PHƯƠNG PHÁP TILLING trên cà chua Hình 8: Đọc dữ liệu từ HRM ( A và B) Cho thấy sự thay đổi trong huỳnh quang phụ thuộc vào nhiệt độ Bảng bên cho thấy sự khác biệt tương đối trong các đường cong nóng chảy so với một mẫu tham khảo Mẫu bắt đầu tan chảy ở nhiệt độ thấp hơn có khả năng chứa một SNP trong đoạn khuếch đại (A)Pha loãng lần... (F)Trái cây màu cam, (G) Cấu trúc cụm hoa (H) Trái cây tươi sáng màu vàng ( I) Quả hình trứng (J) Lá giống lá Pimpenellifolium S (Cần hôi) Hình 5 a Ứng dụng của PHƯƠNG PHÁP TILLING trên cà chua Một số đột biến ở M2: Xem hình 6 Sử dụng SNP để sàng lọc đột biến Hệ thống tiêu chuẩn để phát hiện điểm đột biến trong các dự án Tilling được dựa trên một loại enzyme endonuclease, cả CEL1 hoặc ENDO1 Cụ thể là phân...a Ứng dụng của PHƯƠNG PHÁP TILLING trên cà chua Cà chua (Solanum lycopersicum L.) là một loại rau quả quan trọng với nhiều mục đích sử dụng khác nhau như sản phẩm tươi sống và chế biến có giá trị dinh dưỡng cao Một phần do tính thương mại quan trọng và di truyền tương đối đơn giản của nó (lưỡng bội, tự tương thích) đã có một khối lượng lớn di... cách sử dụng ADN Li-Cor analyser Cùng với SNP người ta thực hiện hai kỹ thuật mới phát hiện đột biến sàng lọc gọi là Conformation Sensitive Capillary Electrophoresis (CSCE) and High Resolution Melt curve analysis (HRM) và đã được chứng minh là phương pháp nhạy , có số lượng vật liệu đưa vào cao Tổng quan về quá trình sàng lọc CSCE được biểu thị trong hình 4 Hình 6 a Ứng dụng của PHƯƠNG PHÁP TILLING . CỦA TILLING TRONG CHỌN GIỐNG CÂY TRỒNG – VẬT NUÔI TILLING Lưu T. Phương Thảo 1. Đặt vấn đề. 2. Tìm hiểu về Tilling a. Tilling là gì? b. Các bước cơ bản của Tilling 3. Khả năng ứng dụng của Tilling . và dinh dưỡng, chất lượng của nông sản. 1. ĐẶT VẤN ĐỀ 2. TÌM HiỂU VỀ PHƯƠNG PHÁP TILLING a. TILLING là gì ? TILLING (Targetting Induced Local Lesions In Genomes: đột biến gene có chủ đích). các sơ đồ 1, 2 ,3 của trang sau). b. CÁC BƯỚC CƠ BẢN CỦA TILLING B. CÁC BƯỚC CƠ BẢN CỦA TILLING Hình 1 Các chất gây đột biến hóa học trong Tilling được áp dụng như ethyl methanesulfonate (EMS- là