CHƯƠNG GIỐNG VI SINH VẬT CHO SẢN XUẤT CÔNG NGHIỆP Muốn có sản phẩm tốt, ngồi quy trình cơng nghệ khâu giống quan trọng nhất, định chất lượng sản phẩm giá trị kinh tế quy trình cơng nghệ sản xuất Trong cơng nghệ lên men, người ta sử dụng rộng rãi nhiều loại vi sinh vật thuộc nhóm Prokaryote (vi khuẩn, xạ khuẩn, vi khuẩn lam) nhóm Eukaryote (nấm men, nấm mốc, tảo) 3.1 Phân lập giống vi sinh vật chủng Để chọn giống vi sinh vật chủng, bước phân lập chúng từ nguồn tự nhiên như: nước, khơng khí, đất, mơ động thực vật, vật liệu hữu vô bị phân huỷ nhiều Từ kỹ thuật vi sinh vật học cổ điển từ thời L Pauster R.Koch đề nhiều phương pháp đặc biệt chủng giống khiết dùng cho công nghiệp phát triển, việc tìm chất sản xuất chất kháng sinh Theo kỹ thuật vi sinh vật cổ điển, việc phân lập chủng khiết nhiều công sức chậm Ngày người ta dùng phương pháp “sàng lọc” vừa nhanh vừa có hiệu Nguyên lý phương pháp là: Trước hết người ta kiểm tra sơ hỗn hợp giống vi sinh vật từ mẫu tự nhiên đất nước, cỏ chẳng hạn…làm huyền phù pha loãng 1/10 đến 1/100 từ đất, gieo mặt hộp petri đựng môi trường thạch dinh dưỡng cấy chủng vi sinh vật kiểm định có tác dụng đối kháng Chỉ có chất đất sinh chất đối kháng với chủng kiểm định, nghĩa có tính chất kháng sinh sau ni tạo vùng ức chế đặc hiệu đĩa thạch Ta tách khuẩn lạc chủng đem nuôi cấy, thử chất sinh xác định Cũng đơn giản đặt mẫu đất lên điểm khác mặt thạch dinh duỡng (nếu muốn tìm vi khuẩn) thạch khoai tây (nếu muốn tìm nấm) có chủng kiểm định ni cấy từ trước Giữ đĩa thạch 28-37oC khoảng ngày, quan sát vùng bị ức chế định công việc phân lập chủng vi sinh vật có tác dụng Phương pháp “sàng lọc” cho phép nhanh chống xác định tính kháng khuẩn kháng nấm virus kháng ung thư chủng phân lập Phương pháp thường dùng hai kiểu kỹ thuật: - Lấy mẫu thử để khảo sát tác dụng với nhiều chủng kiểm định - Lấy nhiều mẫu thử để khảo sát tác dụng với chủng kiểm định Cấy chủng phân lập đường vạch mặt thạch dinh dưỡng hộp petri Sau cấy chủng kiểm định theo đường song song vuông góc 30 với đường vạch chủng nghiên cứu Đặt hộp petri vào tủ ấm với nhiệt độ thích hợp với chủng kiểm định Tác dụng kháng sinh mẫu thử xác định vùng mặt thạch không bị mờ giao điểm đường cấy chủng bị ức chế Phương pháp chủ yếu sử dụng việc tìm chủng sản xuất chất kháng sinh Từ nguyên lý phương pháp cải tiến ngày phong phú Để chọn chủng sản xuất acid amin người ta sử dụng kiểu chọn lọc theo kỹ thuật penicilin Trong phương pháp điều kiện lựa chọn cho tế bào hoang dại phát triển môi trường dinh dưỡng thiếu acid amin bị giết chết pennixilin Chúng ta biết, penicilin có tác dụng lên tế bào sinh trưởng Các tế bào cần acid amin không sinh trưởng nên sống sót Đối với vi khuẩn mẫn cảm với penicilin dùng chất kháng sinh khác Để phân lập chủng có tính chất đặc biệt (như chuyển hoá steroit), người ta dùng hỗn hợp nhiều chủng vi sinh vật đem nuôi cấy mơi trường có chất mà ta muốn thực biến đổi Sau nuôi ta chiết xuất sản phẩm, phân tích theo phương pháp sắc ký 3.2 Tạo giống vi sinh vật công nghiệp Các chủng thu qua phân lập gọi chủng nguyên thủy, chủng hoang dại hay chủng tự nhiên Các chủng chưa hẳn đáp ứng đầy đủ yêu cầu dùng cho sản xuất công nghiệp Thông thường chủng nghiên cứu tuyển chọn tiếp dựa vào điều kiện sinh lý, sinh hố điều kiện tích hợp để cho có hoạt tính cao thực q trình lên men có tính kinh tế Những chủng vi sinh vật nguyên thủy đạc biệt chủng có hoạt tính siêu tổng hợp - tổng hợp thừa sản phẩm trao đổi chất bậc bậc có đặc điểm không bền vững, thường hay bị biến đổi tính chất ban đầu Đồng thời nhân tế bào nhân đơi liên kết nối purin pyrimidin ADN bị cắt ra, làm khuôn để liên kết với hai nửa phân tử khác gồm purin, pyrimidin, deoxyriboza photphat Nếu có sai lệch xảy nửa phân tử ADN tạo nhân có thơng tin sai lệch Vì cơng nghệ lên men, đặc biệt lên men sản phẩmsiêu tổng hợp, không dùng dịch nồi lên men xong để làm giống cho nồi khác Vì thế, mẻ lên men công nghiệp người ta phải tiến hành nhân giống từ ống nghiệm với giống có hoạt lực cao, cấy từ ống giống đong khô tiến hành chọn lại từ mẻ lên men tốt từ trước Những đột biến tự nhiên tạo cá thể có đặc tính thực tế đáng ý Vì việc gây đột biến để chọn lọc định hướng chủng vi sinh vật công nghiệp thành vấn đề đáng quan tâm 3.2.1 Các phương pháp đột biến 31 Thường chủng hoang dại tự nhiên khơng có tổng hợp thừa Các chủng nguyên thủy khiết sau phân lập không bền vững Từ nhu cầu thực tế sản xuất công nghiệp dẫn đến việc lựa chọn giống có khả “siêu tổng hợp” so với chủng nguyên thủy nên phương pháp đột biến đáp ứng yêu cầu Các tác nhân gây đột biến chia thành hai nhóm : - Những tác nhân vật lý: Tia cực tím, tia X (rơnghen), tia Y bắn phá hạt nơtron hay electron - Những tác nhân hoá học: Các hợp chất chứa nitơ như: Nitrozometylguanidin, Metyldicloroetylamin, Nitrit, Hydroxylamin hay Etylametansunfonat Trong tác nhân vật lý dùng vào mục đích tia cực tím tia tử ngoại Người ta dùng đèn thạch anh phát tia cực tím chiếu lên dịch huyền phù giống vi sinh vật chuẩn bị môi trường đẳng trương, đựng hộp petri mở nắp có khuấy lắc Khoảng cách từ đèn UV đến dịch huyền phù vi sinh vật, thời gian chiếu cường độ xạ điều chỉnh cho số tế bào bị tiêu diệt số sống sót tối đa vào khoảng 0,2-0,5% Dùng tác nhân hố học tới mức thể đột biến cần tìm xuất khoảng 105-108 tế bào Nồng độ hoá chất thời gian chiếu xạ thực nghiệm xác định, cho số nhỏ tế bào vi sinh vật sống sót Những chủng sau chịu tác dụng tác nhân đột biến rửa nước đẳng trương vô khuẩn sau nhiều lần pha loãng liên tiếp cấy chuyền nhiều lần hộp petri để khảo sát đặc tính chúng Việc cấy chuyền thực kỹ thuật đóng dấu:dùng dấu nhung chuyển khuẩn lạc từ hộp petri sang hộp petri khác Để phân lập thể đột biến sai hỏng chế điều hồ có khả sinh tổng hợp thừa sản phẩm trao đổi chất, người ta dùng hai phương pháp: dùng chất tương đồng chống chất trao đổi, phân lập thể hồi biến chủng trợ dưỡng Phương pháp dùng chất tương đồng chống chất trao đổi: Hai loại chất có cấu trúc tương tự nhau, ví dụ metioninvà etionin khác vị trí S cấu trúc phân tử: CH3 S CH2 CH2 CH COOH CH3 CH2 S NH2 CH2 CH COOH NH2 Metioni Etioni Do giống nhau, chất chống trao đổi tham gia vào trình trao đổi chất, không làm đầy đủ chức trao đổi thực, nên chất giả thường gây tác dụng ức chế làm chết tế bào Có nhiều nguyên nhân gây ức chế : 32 Một chất tương đồng với acid amin tham gia vào cấu trúc enzyme làm cho enzyme bất hoạt Chất tương đồng cạnh tranh với chất trao đổi trung tâm hoạt động enzyme ngăn cản chuyển hoá chất trao đổi Các chất tương đồng xuất sản phẩm cuối chuỗi tổng hợp, kết hợp với enzyme dị lập thể làm giảm hoạt tính hay phản ứng chất kiềm chế làm giảm tổng hợp enzyme Do vậy, tổng hợp chất trao đổi thật bị ngăn cản sinh sản tế bào bị ức chế Cấy thạch dinh dưỡng có bổ sung chất chống chất trao đổi huyền dịch tế bào đặc biệt ( khoảng 108 tế bào/ đĩa ) xử lý tác nhân gây đột biến Trên mặt thạch sau nuôi xuất số khuẩn lạc thể khuẩn lạc vệ tinh bao quanh khuẩn lạc đĩa trước cấy dầy đặc Đây tế bào kháng chất chống chất trao đổi Phương pháp dùng chất tương đồng giúp ta phân biệt thể đột biến bị hư hại ức chế sản phẩm cuối củng thể đột biến bị rối loạn chế kiềm chế Phương pháp trợ dưỡng: Mục đích phương pháp nhằm phân lập thể hồi biến từ thể đột biến trợ dưỡng sản phẩm cuối Ta nhận thể hồi biến với trung tâm xúc tác trở lại hoạt động bình thường, song trung tâm điều hoà, nơi mà sản phẩm cuối tác động, khơng Tiến hành cấy khoảng 1010 tế bào dột biến trợ dưỡng lên môi trường dinh dưỡng tối thiểu Hầu hết tế không sinh trưởng được, số phục hồi lại khả tổng hợp sản phẩm cuối mọc Như vậy, enzyme bị hư cá thể phục hồi hoạt tính xúc tác nhờ đột biến thứ hai Có vài trường hợp thể đột thứ hai phục hồi hoạt tính enzyme, khơng phục hồi tính mẫn cảm với chất hiệu ứng dị lập thể Như vậy, đột biến có hoạt tính enzyme đầy đủ, khơng có khả dị lập thể Nhận biết thể nhờ vòng khuẩn lạc vệ tinh Qua nhiều bước làm đột biến ta nhận thể đột biến có chứa enzyme tính mẫn cảm dị lập thể từ chọn phương pháp cần thiết cho việc tạo giống công nghiệp Nhờ phương pháp chọn lọc định hướng thể đột biến ngày cải tiến thích hợp, người ta chọn nhiều chủng có xuất lên men cao dùng sản xuất enzyme, acid amin, vitamin, chất kháng sinh…một số giống đột biến để tăng hiệu công nghiệp Trong năm gần đây, nhiều cơng trình tạo giống vi sinh vật công nghiệp đột biến từ tế bào trần cho kết khả quan Ngoài phương pháp lai ghép tế bào trần 33 biến nạp gen tế bào vi sinh vật- phương pháp kỹ thuật di truyền đại mở trang cho cơng nghệ sinh học, có việc tạo giống công nghiệp Các phương pháp lai ghép tế bào trần biến nạp gen tế bào vi sinh vật giúp cho việc tạo giống vi sinh vật cơng nghiệp Nhiều chủng có hoạt tính cao, có khả sinh tổng hợp chất liệu q mà trước sinh thể động vật thực vật gen điều khiển tổng hợp chất ghép vào tế bào vi khuẩn Cơng việc sau tổ chức trình lên men đưa vào sản xuất công nghiệp sản phẩm truyền thống khác Các sản phẩm interferon, insulin, kháng thể đơn dịng…đã sản xuất theo cơng nghệ lên men Cũng cần lưu ý việc dùng chủng vi sinh vật thay đổi gen di truyền việc làm quan trọng, tự nhiên khó kiểm sốt chủng hậu khó lường Vì vậy, nước phát triển có qui định ngặt nghèo với việc cho phép sử dụng chủng tái tổng hợp dùng cho cơng nghiệp 3.3 Các tiêu chí để chọn giống vi sinh vật cho sản xuất công nghiệp Một chủng giống vi sinh vật dùng cho công nghiệp cần phải đáp ừng nhu cầu sau: - Chủng vi sinh vật phải thuần, không chứa vi sinh vật gây nhiễm khác - Phải đảm bảo khả tạo thành sản phẩm với suất cao, chất lượng tốt, không tạo sản phẩm phụ không mong muốn - Khả sử dụng nguyên liệu dễ kiếm rẻ tiền Trên chất vi sinh vật phải mọc nhanh sản sinh lượng lớn sinh khối ổn định Khả tách dễ dàng tế bào hay sản phẩm tạo qua trình lên men - Phải thể tính khơng mẫn cảm với vi sinh vật tạp nhiễm thực khuẩn thể - Cùng với thời gian chủng sản xuất phải bảo toàn đặc tính hố sinh ban đầu - Chủng vi sinh vật có khả thay đổi đặc tính kỹ thuật đột biến, kỹ thuật gen để không ngừng nâng cao suất Việc chọn giống đáp ứng đầy đủ nhu cầu trên, thường kích thước tế bào lớn dễ tách khỏi dịch ni cấy, hoạt tính lại khơng cao, cường độ trao đổi chất vi sinh vật tỉ lệ nghịch với kích thước tế bào Tuy nhiên trình sản xuất tiêu chuẩn gắn liền với tồn số đối tượng vi sinh vật Các vi sinh vật thuộc nhóm Eukaryote có kích thước tế bào lớn thể hình sợi, dễ tách chúng khỏi môi trường dinh dưỡng phương pháp lọc ly tâm thường Nhưng chúng thường tồn quy tắc chung kích thước tế bào tỷ lệ nghịch với hoạt tính trao đổi chất 3.4 Kỹ thuật bảo quản giống vi sinh vật 34 Công tác bảo quản giống vi sinh vật có ý nghĩa lớn phịng nghiên cứu cơng nghiệp vi sinh vật Nó khơng đơn giữ chủng giống vài môi trường dinh dưỡng thông thường định kỳ cấy chuyền, mà phải làm htế để giống sống sót giữ đặc tính ban đầu Vì cơng tác tương đối phức tạp khó khăn Q trình ni cấy đưa giống vi sinh vật có hoạt lực cao vào sản xuất cần qua bước sau: phân lập, tuyển chọn giống, nghiên cứu đặc tính hình thái, sinh lý, hố sinh, tuyển chọn điều kiện nuôi cấy tối ưu Bước cần phải ý việc giữ giống sau phân lập từ đất, nước hay chất Yêu cầu mặt chọn giống: giống có hoạt lực cao ổn định với hoạt lực qui trình thích hợp Giống chọn lần đầu giữ cho lần Có thể cho : công việc giữ giống liên quan đến công tác nghiên cứu thời gian xí nghiệp dùng vi sinh vật Nếu không giữ đặc tính ban đầu vi sinh vật thành thu coi vơ ích Vì lý mà nước giới chuẩn bị cho khâu bảo quản giống mang tính tầm cỡ, thành lập trung tâm, bảo tàng giống vi sinh vật, viện nghiên cứu Nhiệm vụ bảo tàng vi sinh vật là: giữ quần thể tế bào giống sống sót với tỉ lệ cao tế bào giữ đặc tính ban đầu để phục vụ cho nghiên cứu sản xuất Nhưng có vi sinh vật khơng có khả sống trì đặc tính ban đầu Thông thường chủng giữ lâu môi trường dinh dưỡng cấy chuyền nhiều lần có biến đổi Như cần phải chọn lựa giống phương pháp bảo quản thích hợp hệ cháu khơng sinh đột biến Người ta chọn khuẩn lạc riêng lẻ có đặc điểm đặc trưng Chọn tế bào loại, nguyên tắc khó gặp thể đột biến, gặp phải xuất tập trung thể đột biến, gặp phải xuất tập trung thể đột biến chủng ban đầu Sau chọn chủng cần phải tiến hành bảo quản Ngày có nhiều phương pháp bảo quản giống vi sinh vật Phần nhiều phương pháp giữ chủng giống trạng thái tiềm sinh định kỳ cấy chuyền mơi trường thích hợp Trong trạng thái tiềm sinh khơng xảy q trình sống với mức độ thấp Bảo quản trạng thái cho phép giữ tính chất quí ban đầu Sự lựa chọn phương pháp bảo quản tuỳ thuộc vào khả phịng thí nghiệm 3.4.1 Phương pháp cấy truyền vi sinh vật: Đây phương pháp bảo quản đơn giản, chủng vi sinh vật cấy mơi trường thích hợp (dịch thể hay thạch) ống nghiệm hay bình tam giác để điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển Sau chủng vi sinh vật chuyển đến nơi bảo quản có nhiệt độ thích hợp Q trình lặp lại thời hạn định, đảm bảo chủng vi sinh vật chuyển đến môi trường trước già 35 chết Thực tế có nhiều chủng vi sinh vật thích hợp với phương pháp bảo quản như: Staphylococi, Coliform sống vài năm theo cách Cho dù phương pháp phương pháp phổ biến dùng sở nghiên cứu sử dụng chủng vi sinh vật đặc biệt chủng dùng cho nghiên cứu Tuy nhiên, phương pháp bộc lộ nhiều nhược điểm sau: - Dễ bị tạp nhiễm dễ dẫn đến chủng giống gốc - Mất hay nhầm lẫn nhãn hiệu giữu chủng trình bảo quản Phải nghiên cứu theo dõi thời gian cấy truyền thích hợp chủng bảo quản - Tốn nhiều cơng sức để cấy truyền - Giống gốc sai sót dùng mơi trường cấy truyền khơng thích hợp Chủng vi sinh vật cấy truyền dễ bị thay đổi đặc điểm sinh học đột biến xuất sau lần cấy truyền Cấy truyền mơi trường dịch thể: • Cách tiến hành đơn giản chuẩn bị 10 ml môi trường nuôi cấy nấm men (thông thường môi trường YM Yeast extract – Maltose) lọ McCartney khử trùng nhiệt độ 121oC 15 phút Thường làm lọ cho chủng bảo quản • Một vịng que cấy chủng nấm men bảo quản đưa vào môi trường thao tác vô trùng giữ 25oC 72 Phải kiểm tra phát triển chủng bảo quản • Sau mẫu giữ 4oC Thông thường theo cách thời gian bảo quản chủng thường thay đổi từ 2- tháng Cấy truyền môi trường thạch: Cấy truyền môi trường thạch tương tự môi trường dịch thể môi trường bổ sung thạch (1.6%) Giống sau cấy giữ 72 nhiệt độ thích hợp để đạt độ phát triển cần thiết, sau để 4-8oC Theo phương pháp giống có thời gian sống lâu phương pháp cấy truyền dịch thể, thông thường giống bảo quản từ 3-6 tháng Thời gian bảo quản kéo dài từ 2-3 năm ống giống bảo quản dầu parafil trùng đổ lên môi trường thạch cho tạo lớp dày khoảng 1cm 36 Hình Bảo quản phương pháp cấy truyền môi trường thạch Giống vi sinh vật giữ môi trường thạch nghiêng (đối với giống vi sinh vật hiếu khí) trích sâu vào môi trường thạch (đối với vi sinh vật kỵ khí) Các ống giống bảo quản tủ lạnh nhiệt độ 3- 50C Định kỳ để cấy truyền giống, tuỳ nhóm vi sinh vật khác mà định kỳ cấy truyền khác nhau, song giới hạn tối đa tháng Để công tác giữ giống tốt, lâu đỡ bị tạp hơn, người ta thường phủ lên môi truờng cấy giống vi sinh vật lớp dầu khoáng paraffin lỏng Lớp paraffin hạn chế tiếp xúc vi sinh vật oxy khơng khí (O2) hạn chế nước mơi trường thạch, giống bảo quản lâu khơng bị nhiễm tạp, thối hóa Phương pháp giữ giống mơi trường thạch lớp dầu khống Để khắc phục nhược điểm phương pháp cấy chuyền nhiều lần cụ thể hạn chế phát triển vi sinh vật thời gian bảo quản, tránh cho lớp thạch mơi trường bị khơ dần giống bị chết, phủ lên mơi trường thạch có vi sinh vật phát triển lớp dầu khoáng parafin dày khoảng 10mm Lớp parafin hạn chế tiếp xúc vi sinh vật với oxygen khơng khí hạn chế nước mơi trường thạch nên nồng độ chất hồ tan khơng bị thay đổi, áp lực thẩm thấu khơng bị thay đổi nên không gây hại đến đời sống vi sinh vật Những chủng xử lý trên, sau giữ tủ lạnh nhiệt độ 50C bảo quản nhiều năm Cần phải giữ cho trì sống tốt mà không tạo nên ưu sinh sản Đối với chủng phải thử chọn phương pháp bảo quản thích hợp Phương pháp giữ giống với dầu khống tương đối thuận tiện cho kết tốt Giống bảo quản lớp dầu khoáng sau 12 tháng giữ hình dáng bề ngồi bình thường Phương pháp ứng dụng rộng rãi để giữ nhiều giống vi sinh vật như: nấm men, nấm mốc,vi khuẩn, xạ khuẩn… 37 3.3.2 Giữ giống vi sinh vật môi trường đất, cát hạt Do cấu trúc hoá lý, cát đất chất tốt mang tế bào vi sinh vật- chủ yếu bào tử Bảo quản giống vi sinh vật cát: Dùng cát sông rửa nước nhiều lần (đến nước không đục), sấy khô, sàng qua rây lỗ nhỏ để loại đất rác bẩn Có thể dùng acid clohyric đặc để oxy hoá chất hữu (đun nóng 1000C rửa lại nước) Sấy khơ 1200C - Chia cát khô vào ống nghiệm thuỷ tinh sấy trùng 160-1800C khoảng Ta kiểm tra độ vô trùng cát cách cho môi trường dịch đường hố thịt- pepton vơ trùng vào ống cát hấp trùng Sau cho vào tủ ấm 28-300C khoảng tuần Quan sát hàng ngày thấy loại dịch đục coi cát chưa vơ trùng Đổ cát chuẩn bị vào ống nghiệm giống trùng cho cát không rơi vào mặt thạch, khơng dính lên thành ống nghiệm Úp mặt thạch, dùng que cấy cào bào tử vào cát Đổ cát có bào tử vào ống nghiệm vơ trùng lắc Chỉ bảo quản ống cát vào bào tử khơ khơng bị ướt vón cục, ống cát giống đậy nút bơng Dùng parafin nóng chảy phết lên nút ống nghiệm giúp cho ống giống khơng bị ẩm ướt giữ nhiệt độ phịng hay 4-60C Phục hồi chủng cách dùng que cấy lấy cát ống cấy vào ống thạch nghiêng, sau chọn lựa cấy chuyền Phương pháp bảo quản chủ yếu áp dụng cho nhóm vi sinh vật sinh bào tử nấm mốc xạ khuẩn Bảo quản giống đất khô: nghiền đất rây lấy hạt Chia đất nghiền vào ống nghiệm thêm 1-2 giọt nước,có thể thêm 1-2% CaCO3 để trung hồ loại đất chua cho than hoạt tính vào đáy ống đất sau trùng khơ Đậy bơng để ống nghiệm có đất vào giỏ đem hấp trùng hai lần 1200C cách ngày Kiểm tra độ vô trùng môi trường giữ giống cát giữ giống đất cát Ngoài ta giữ giống hỗn hợp cát đất Phương pháp bảo quản thành công với giống Clostridium pasteurianum Giữ giống hạt: Có thể giữ bào tử nấm mốc, xạ khuẩn hạt thực vật khác Ơû Liên Xô cũ thường bảo quản giống xạ khuẩn sinh kháng sinh hạt kê: chọn hạt kê vàng làm sạch, cho vào nước sôi khuấy trộn đều, giữ 30 phút cho hạt thấm ẩm hoàn toàn lọc Tãi kê ẩm mặt khay để xoa cồn, làm nguội hạt phải rời nhau, cho vào lọ (khoảng 15-16 g lọ thể tích 250ml) Các bình đậy nút kín trùng 1150C khoảng 30-40 phút Thử vô trùng giống phương pháp Cấy vào bình ml dịch huyền phù bào tử hay khuẩn ty dinh dưỡng Lắc nhẹ cho giống hạt kê nuôi nhiệt độ 24-280C ngày Sau sấy thiết bị chân khơng đến độ ẩm kê có giống phát triển khơng 8% Kiểm tra giống tráng parafin lên nút bơng Bảo quản nhiệt độ phịng tối khô 38 3.3.2 Phương pháp đông khô vi sinh vật phương pháp đông khô trực tiếp: 3.3.2.1 Phương pháp đơng khơ: Đơng khơ q trình mà nước lấy khỏi mẫu mẫu trạng thái lạnh sâu Ở vi sinh vật huyền phù mơi trường thích hợp làm lạnh môi trường chân không Thiết bị đông khô hút nước cuối mẫu làm khô đến mức định Mẫu hàn kín mơi trường chứa mẫu chân không Đây phương pháp phổ biến có hiệu cao cho bảo quản đối tượng vi sinh vật khác nấm sợi, nấm men, vi khuẩn số virut Tuy nhiên, phương pháp ứng dụng tảo, động vật nguyên sinh tế bào động vật Hình Đông khô vi sinh vật Đây phương pháp phổ biến sử dụng bảo tàng vi sinh vật giới Phương pháp đông khô hạn chế thay đổi đặc tính vi sinh vật bảo quản thời gian dài Phương pháp lạnh đông giữ giống dựa nguyên tắc ức chế phát triển vi sinh vật cách đưa chúng vào nhiệt độ lạnh sâu –250C đến –700C Để đảm bảo tế bào vi sinh vật không bị chết bị làm lạnh sâu ta cần trộn sinh khối giống cần bảo quản với dung dịch bảo vệ (hay gọi dung dịch nhũ hoá) glycerin 15%, huyết ngựa, dung dịch glucose hay lactose 10% Việc làm tiến hành từ từ lạnh được, độ lạnh đạt –200C việc tiếp tục làm lạnh cần đạt tốc độ 1-20C/ phút Với phương pháp cấy chuyền làm lại, thời gian lần cấy chuyền kéo dài so với phương pháp giữ giống thạch Nếu giữ t0=-150C đến -200C : tháng cấy chuyền làm lại lần Nếu giữ t0=-300C : tháng cấy chuyền làm lại lần Nếu giữ t0=400C : năm cấy chuyền làm lại lần 39 Nếu giữ t0=-500C đến -600C : năm cấy chuyền làm lại lần Nếu giữ t0=-700C : 10 năm cấy chuyền làm lại lần Phương pháp đơn giản tiện lợi, lại cho hiệu bảo quản cao Hiện phương pháp sử dụng phổ biến để bảo quản giống vi sinh vật Phương pháp đông khô giống vời phương pháp lạnh đông, tức vi sinh vật trình xử lý đưa vào nhiệt độ thấp nhiệt độ –600C đến –700C cách từ từ với có mặt chất bảo vệ: glutamate 3% hay lactose 1,2% + pepton 1,2% hay saccharose 8% + sữa 5% + gelatin 1,5%… Điều khác biệt với phương pháp lạnh đông là: đảm bảo an toàn cho sống tế bào giống, người ta làm thăng hoa nước tế bào mơi trường có chất bảo vệ thiết bị đông khô với áp suất 1.10-4 mmHg Hỗn hợp tế bào giống dung dịch bảo vệ chứa ampul thuỷ tinh có φ =10mm hay φ =15mm hàn kín để đảm bảo độ khơ chân không cần thiết, ampul bảo quản t0=4 - 60C hay nhiệt độ phòng Phương pháp d0ược coi tối ưu cho hiệu suất bảo quản cao giữ giống vi sinh vật qua hàng chục năm có tỷ lệ sống cao không bị biến đổi di truyền, đồng thời chiếm diện tích bảo quản Phương pháp đơng khơ trình bày phương pháp dùng NCTC (National Colleciton Type Culture, Anh) 1, Nuôi vi khuẩn cho đông khô: Vi khuẩn cấy mơi trường ống thạch nghiêng thích hợp Tuy nhiên, chuẩn bị dịch vi khuẩn mơi trường dịch thể phải làm đậm đặc tế bào li tâm Tuổi tế bào quan trọng thường chọn tế bào nằm pha sinh trưởng log 2, Chuẩn bị đệm mẫu: Có thể dùng hai loại đệm sau: + Đệm huyết thanh- inositol; Meso-inositol: gam Huyết ngựa (số 3): 100 ml Thanh trùng phương pháp lọc vi khuẩn, sau phân 5ml vào bình vơ trùng + Đệm inositol: Môi trường dinh dưỡng bột số 2: 2.5 gam Meso-inositol: gam Nước cất: đủ 100 ml Phân ml vào bình khử trùng nhiệt độ 121 3, Chuẩn bị dịch tế bào: Mật độ tế bào có ý nghĩa quan trọng chất lượng bảo quản Thơng thường thu sinh khối từ ống thạch nghiêng dùng cho 1-2 ml đệm 40 pha mẫu để tạo dịch huyền phù tế bào Mật độ vi khuẩn thông thường cần đạt 1010 (đối với vi sinh vật khơng có bào tử) Mật độ giảm với vi sinh vật có bào tử Hai đệm pha mẫu dùng với vi khuẩn trường hợp enterobacteria khơng dùng đệm huyết gây thay đổi đặc tính miễn dịch vi khuẩn 4, Chuẩn bị ống đông khô: Ống đông khô rửa sau ngâm qua đệm với dịch acid lỗng (HCl 2%) lại rửa sạch, làm khô chuẩn bị nút bông, ống trùng khô khử trùng theo phương pháp thông thường 5, Chuẩn bị mẫu trước đông khô: Lượng dịch huyền phù vi khuẩn đưa cẩn thận pipet pasteur vào ống đông khô khoảng 0.1- 0.2 ml Chú ý thao tác phải cẩn thận tránh dính mẫu vào thành hay phía ống đơng khơ 6, Bước tiền đơng khô: Mục tiêu bước làm bay bị lạnh đơng tạo đá Trước tiến hành đông khô mẫu chuẩn bị qua bước tiền đơng (như trình bày trên) sau bước tiền đông khô tiến hành mẫu lắp vào hệ thống đơng khơ q trình làm nước điều kiện lạnh tiến hành khoảng 7, Tạo chỗ thắt ống đông khô: Sau bước tiền đông khô, yêu cầu phải tạo vết thắt Việc tạo vết thắt thực với hệ thống đèn hàn Tuy nhiên, sở bảo quản vi sinh vật sử dụng hệ thống hàn tạo vết thắt thiết bị tự động 8, Hậu đông khô: Trong bước mẫu lại tiếp tục làm khô độ ẩm cuối đạt khoảng 1% Thời gian cho bước thay đổi từ 1-2 9, Hàn ống đông khô: Việc hàn ống trực tiếp thiết bị đông khô (manifold) cần có kinh nghiệm cẩn thận Trước hết phải tiến hành khố van sau thực thao tác hàn ống đông khô 10, Kiểm tra độ chân không ống đông khô: Người ta sử dụng thiết bị đèn phát mức độ chân không Với mẫu đạt độ chân khơng cần thiết xuất màu xanh tím nhạt Đối với mẫu khơng đạt tiêu chuẩn khơng có tín hiệu màu tím đậm 11, Kiểm tra khả sống mẫu: Đếm số lượng tế bào phương pháp chủ yếu để đánh giá chất lượng bảo quản Việc đếm thực trước sau đông khô Các bước kiểm tra thực sau năm để đánh giá chất lượng mẫu đơng khơ Nói chung khả sống vi sinh vật có bào tử cao vi sinh vật khơng có bào tử loại gram dương cao vi sinh vật gram âm Tuy nhiên, với vi sinh vật kỵ khí u cầu phải tiến hành theo qui trình, tránh vi sinh vật tiếp xúc với oxy 12, Bảo quản mẫu: Mẫu thông thường bảo quản 4OC hay nhiệt độ phòng Phương pháp đơng khơ dịch thể trực tiếp (L-drying): Ngồi phương pháp đơng khơ mơ tả trên, cịn có phương pháp đơng khơ trực tiếp Khác biệt với phương pháp chỗ dịch huyền phù vi sinh vật làm khô nhanh chế độ chân không thích hợp mà mẫu khơng cần làm lạnh từ trước Phương pháp đặc 41 biệt có ý nghĩa nhóm vi khuẩn khơng có khả sống nhiệt độ thấp giai đoạn tiền đông Các thông số quan trọng cần quan tâm thực phương pháp là: - Tuổi vi sinh vật bảo quản - Thành phần dịch huyền phù tế bào vi sinh vật - Tốc độ đông khô - Nhiệt độ đông khô thấp - Khoảng thời gian làm khô mẫu độ ẩm cuối mẫu Phương pháp đông khô trực tiếp thực tương tự phương pháp đơng khơ trình bày thực sau: Chuẩn bị: 1, Ống đông khơ rửa (sonic cleaner) 15 phút sau khử trùng 170oC 2, Môi trường L-drying chuẩn có thành phần sau: Đệm phosphat: 0.1M : 100 ml Monosodium glutamat: g Adonitol: 1.5 g (Khử trùng 115oC/20 phút) 3, Ống thạch nghiêng (có thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo chủng môi trường nuôi cấy mà thời gian thu bào tử thích hợp khác (10-15 ngày) Cách tiến hành: 1, Dùng pipet pasteur lấy khoảng 3-4 ml môi trường trùng cho vào ống nghiệm chứa bào tử nấm sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử nấm có mật độ cao (đối với số chủng có số lượng bào tử thấp tạo dịch bào tử từ vài ống thạch bào tử khác nhau) 2, Dùng pipet pasteur lấy dịch bào tử cho vào ống đông khô (0,2 ml), thông thường chuẩn bị 13 ống cho chủng, dán nhãn, ghi thông tin cần thiết số mã chủng, ngày bảo quản, môi trường nhiệt độ thích hợp Sau đậy nút bơng hay giấy bạc 3, Đồng thời bật máy Dura-Dry, mức độ chân không đạt 45 minitor, nhiệt độ -75 C, nối ampoule mẫu vào hệ thống manifold (chú ý khố van chân khơng nối ampoule mẫu với tube manifold sau lại mở ra, để đảm bảo độ chân không cần thiết làm đông khô phải đưa mẫu vào tín hiệu đèn thị cho phép) Khi độ chân không đạt 45-48 minitor, nhiệt độ -55oC tiến hành q trình làm khơ o 4, Hàn kín ampoule mẫu: Khi máy Dura-Dry chạy để đảm bảo độ chân không cần thiết, khoá van cho ampoule mẫu tiến hành hàn với mẫu 42 vị trí ống bị thắt Dùng lửa gas để đốt nóng phần ống thắt cho phía xoay cho thuỷ tinh chảy bịt kín ống Sau dùng lửa gas để cắt rời phần (nối với manifold) phần chứa mẫu Hết đợt lại khoá van ampoule mẫu hàn Kiểm tra chất lượng sau bảo quản: - Để kiểm tra độ sống sót mẫu nấm sợi bảo quản, thực theo cách mô tả phần đông khô - Kiểm tra độ chủng: mẫu cấy mơi trường thích hợp quan sát hình thái đặc điểm sinh học đặc trưng cần thiết để đánh giá khả tạp nhiễm đặc tính sinh học - Thí nghiệm đánh giá nhanh thời gian bảo quản: mẫu sau đông khô trực tiếp giữ 37oC tuần Độ sống sót mẫu bảo quản giảm tuần 37oC tương đương với bảo quản 10 năm 4oC Phương pháp nhanh thuận lợi cho đợt bảo quản số lượng lớn mẫu Thông thường theo phương pháp vi sinh vật bảo quản từ 10-20 năm Nói chung hai phương pháp có nhiều ưu điểm so với phương pháp trước thời gian bảo quản lâu, tiết kiệm công sức sai sót nhãn mác tạp nhiễm Tuy nhiên, nhược điểm lớn phương pháp giá thành thiết bị Độ ổn định chủng vi sinh vật bảo quản theo đợt đông khô khác Hơn chủng trước đem sử dụng phải hoạt hố mơi trường thích hợp số lần để phục hồi đặc tính sinh học 3.3.3 Phương pháp bảo quản lạnh sâu: Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu vi sinh vật bảo quản môi trường dịch thể nước cần cho hoạt động sống vi sinh vật bị bất hoạt nhiệt độ lạnh sâu (-196°C -> -80°C) Hình Bảo quản lạnh sâu Với phương pháp này, tế bào bị vỡ q trình làm lạnh làm tan mẫu Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào việc tích luỹ chất điện giải mẫu 43 bảo quản hình thành tinh thể nước tế bào Để khắc phục nhược điểm người ta bổ sung chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu làm tan nhanh glycerol, DMSO (dimethyl sulfoxide) Việc bảo quản theo phương pháp lạnh sâu thực thang nhiệt độ khác -20° C, -30° C, -40° C, -70° C, -140°C -196° C Nói chung mức nhiệt độ cao -30° C cho hiệu thấp tế bào chịu nồng độ muối cao sinh từ chất điện giải Phương pháp bảo quản có hiệu với nhiều nhóm vi sinh vật khác nấm sợi, nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn virut Đặc biệt với phương pháp bảo quản lạnh sâu nitơ lỏng phương pháp vạn Phương pháp thích hợp với nhiều đối tượng vi sinh vật khác vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, virut, tảo dòng tế bào động vật Tuy nhiên, phương pháp bộc lộ số nhược điểm đầu tư kinh phí cho thiết bị điện, nitơ lỏng rủi ro cháy nổ Đặc biệt phương pháp khơng thích hợp với chủng vi sinh vật thường xuyên dùng đến Nói chung phương pháp thường dùng với chủng vi sinh vật có đặc tính q mà khơng thích hợp với phương pháp đơng khơ Hình Bảo quản nitơ lỏng - Chuẩn bị tế bào cho lạnh sâu: Tế bào nuôi cấy mơi trường nhiệt độ thích hợp đầu pha log - Pha dịch tế bào với glycerol DMSO trùng trước để đạt nồng độ cuối 10% mật độ tế bào 106 - Dịch huyền phù tế bào đưa vào ống lạnh sâu đóng nắp (trong trường hợp hàn ống thuỷ tinh, cần để dịch xanh metylene 0.05% để phát ống bị rị rỉ) Tồn mẫu để nhiệt độ phòng 30 phút cân áp suất thẩm thấu ngồi tế bào Trong trường hợp có nitơ lỏng mẫu chuyển sang bình nitơ lỏng Mẫu đưa vào lạnh sâu cần theo tốc độ định Thông thường tốc độ lạnh dao động 1-3 O C/phút để đạt tới nhiệt độ -30OC ban đầu Sau mẫu làm lạnh tiếp với tốc độ cao 10-15 OC/phút để đạt tới nhiệt độ lạnh cần thiết (-100OC đến -80OC) Hiện nay, có thiết bị làm lạnh sâu chương trình hố với tốc độ mong muốn Tuy nhiên, có 44 thể đơn giản mẫu ban đầu đặt đá khô sau lại đưa vào tủ lạnh sâu đặt thời gian vài để đạt nhiệt độ -65OC - Hoạt hoá mẫu: mẫu lạnh (lạnh sâu hay nitơ lỏng) hoạt hoá cách làm tan nhanh tới mức (thơng thường đưa vào tủ ấm 37 OC 40-60 giây) Như vậy, theo cách đạt khả sống 95% tế bào sau 10 năm bảo quản 3.4 Hoạt hoá chủng giống Giống sản xuất thường bảo quản để tránh giảm hoạt tính Do đó, việc cấy giống mơi trường thạch nghiêng trước nhân giống việc làm cần thiết Có thể coi việc “đánh thức” chủng giống đồng thời để kiểm tra hoạt tính giống sau thời gian bảo quản nhiệt độ thấp 3.5 Nhân giống vi sinh vật Mục đích việc nhân giống để tăng số lƯợng tế bào vi sinh vật Trong quy trình lên men, tuỳ chủng giống vi sinh vật khác mà cần nhân theo chất môi trường nhân khác Thường có hai dạng giống: tế bào sinh dưỡng bào tử Kỹ thuật nhân giống: Khâu tẩy dụng cụ khử trùng cho môi trường vô trùng vào Tiếp theo cho giống ban đầu (starter culture) vào để nuôi Số lượng giống ban đầu chiếm khoảng 1-10% tổng khối lượng môi trường nuôi Tiến trình nhân giống thực sau: ống giống giữ nhiệt độ thấp nuôi với 10ml môi trường ni 200ml ni lít ni 30 lít 300lít (hình 4.4) Hình Sơ đồ hệ thống nhân giống lên men công nghiệp Nuôi VSV hộp Petri; Nhân giống ống nghiệm; Một phần đơng lạnh giữ giống; Có thể nhân giống từ ống đông lạnh; Nhân giống đến quy mô 1m3; nồi lên men sản xuất 10m3; Hệ thống kiểm soát + Trường hợp giống tế bào sinh dưỡng 45 Để thu lượng tế bào sinh dưỡng, người ta thường chọn môi trường nhân sinh khối môi trường đảm bảo cho vi sinh vật tồn thích hợp nhất, để với thời gian ngắn cho sinh khối vi sinh vật lớn Trong trường hợp thường dùng mơi trường dịch thể (ni cấy chìm) + Trường hợp giống bào tử hay conodi: Thông thường chọn môi trường đặc (nuôi cấy bán rắn: cám gạo, bột bắp, thóc, trấu, mùn cưa ) Ni cấy nấm mốc xạ khuẩn thường cần thời gian dài để tạo bào tử Bào tử thu hồi nhiều cách: Dùng máy hút (như hút bụi) hay dùng chổi lông mềm quét lên bề mặt môi trường bán rắn để thu hồi giống Bào tử thu hồi cho vào bình khơ có gắn miệng bình paraffin, bảo quản nơi thoáng mát sử dụng hàng năm Trong công nghiệp, người ta thường nhân với lượng lớn sinh khối vi sinh vật bước sau: - Giai đoạn phịng thí nghiệm (gọi nhân giống cấp I) Đây giai đoạn cấy giống vi sinh vật khiết từ ống giống, đem nhân mơi trường dinh dưỡng chun tính vơ trùng, ni cấy phịng thí nghiệm, nhằm đáp ứng đủ lượng giống cần thiết cho bước - Giai đoạn xưởng (nhân giống sản xuất) Đây giai đoạn cần nhân lượng giống lớn để đáp ứng cho khâu giống sản xuất Từ giống cấp 1; 2; nhân nồi lên men hay chất đặc (chất mang) Khi kết thúc khâu nhân giống cần kiểm tra độ giống mật độ tế bào vi sinh vật cần nhân THÔNG TIN VỀ CÁC BẢO TÀNG GIỐNG VI SINH VẬT Danh sách sở giữ giống chủ yếu: - Viện giữ giống mẫu Mỹ (ATCC= American Type Culture Collection) Washington - Sở giữ giống trung ương Baarn, Hà Lan (nấm mốc, nấm men xạ khuẩn) - Viện sưu tầm giống (NRRL) ARS (Agricultural Research Service) Peoria, Illinois - Trung tâm sưu tầm chủng vi khuẩn mẫu trung ương (CCTM= Centre de Collection de Type Microbiens )Lausanne,Thuỵ Sĩ 46 - Viện quốc gia giữ chủng vi khuẩn công nghiệp Teddington, Anh - Viện nấm học Commonwealth, Kew,Anh - Viên giống Pringsheim (tảo protozoaires) Trường Đại họcCambridge, Anh - Viện quốc gia giữ giống mẫu (NCTC= National Collection of Type Culture) London - Viện giống tảo trường đại học Indiana Bloowington, Ấn Độ 47 Filename: CHƯƠNG 3ii.doc Directory: C:\Documents and Settings\welcome\Desktop\New Folder Template: C:\Documents and Settings\welcome\Application Data\Microsoft\Templates\Normal.dot Title: CHƯƠNG Subject: Author: User Keywords: Comments: Creation Date: 8/2/2011 11:07:00 PM Change Number: Last Saved On: 9/9/2011 8:44:00 AM Last Saved By: User Total Editing Time: Minute Last Printed On: 9/9/2011 8:44:00 AM As of Last Complete Printing Number of Pages: 18 Number of Words: 8,840 (approx.) Number of Characters: 32,001 (approx.) ... hợp dùng cho công nghiệp 3. 3 Các tiêu chí để chọn giống vi sinh vật cho sản xuất công nghiệp Một chủng giống vi sinh vật dùng cho công nghiệp cần phải đáp ừng nhu cầu sau: - Chủng vi sinh vật phải... tính trao đổi chất 3. 4 Kỹ thuật bảo quản giống vi sinh vật 34 Công tác bảo quản giống vi sinh vật có ý nghĩa lớn phịng nghiên cứu cơng nghiệp vi sinh vật Nó khơng đơn giữ chủng giống vài môi trường... biến nạp gen tế bào vi sinh vật giúp cho vi? ??c tạo giống vi sinh vật công nghiệp Nhiều chủng có hoạt tính cao, có khả sinh tổng hợp chất liệu quí mà trước sinh thể động vật thực vật gen điều khiển