Đang tải... (xem toàn văn)
2. Mục tiêu nghiên cứu 2.1. Mục tiêu tổng quát Tạo được dòng cây chịu hạn mang cấu trúc gen chuyển liên quan đến sự kéo dài rễ phân lập từ cây đậu tương bằng kỹ thuật chuyển gen. 2.2. Mục tiêu cụ thể (i) Xác định được sự khác biệt về sự phát triển của bộ rễ và sự sai khác về trình tự nucleotide của gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ của một số giống đậu tương địa phương. (ii) Phát triển được vector chuyển gen thực vật mang gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ ở cây đậu tương. (iii) Tạo được dòng cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc gen GmEXP1 biểu hiện sự kéo dài rễ cao hơn so với cây đối chứng không chuyển gen. (iv) Tạo được dòng cây đậu tương chuyển gen mang gen GmEXP1 liên quan đến sự phát triển kéo dài rễ. 3. Nội dung nghiên cứu (1) Nghiên cứu so sánh sự phát triển bộ rễ của một số giống đậu tương thông qua các chỉ tiêu như: chiều dài, kích thước, khối lượng khô của rễ... và phân nhóm các giống đậu tương nghiên cứu theo mức độ phát triển bộ rễ. (2) Nghiên cứu thông tin về gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ, thiết kế cặp mồi, khuếch đại, tách dòng và xác định trình tự gen từ cây đậu tương. 3 (3) Nghiên cứu phát triển vector chuyển gen thực vật chứa cấu trúc gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ. (4) Nghiên cứu chuyển cấu trúc vector chứa gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ vào cây thuốc lá thông qua A.tumefaciens. Phân tích sự biểu hiện của gen chuyển trên cây thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T0 và T1. Phân tích, so sánh sự phát triển bộ rễ của các dòng cây chuyển gen và cây đối chứng ở thế hệ T1 trên phương diện chiều dài rễ chính, khối lượng khô và thể tích rễ. (5) Nghiên cứu thử nghiệm chuyển cấu trúc mang gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ vào cây đậu tương. 4. Những đóng góp mới của luận án Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu có hệ thống từ phân lập, tách dòng phân tử đến phát triển vector chuyển gen và biểu hiện gen GmEXP1 liên quan đến sự phát triển bộ rễ ở cây thuốc lá và cây đậu tương Việt Nam. Ứng dụng kỹ thuật Real time RTPCR và Western blot đã đánh giá được mức độ biểu hiện của gen chuyển trong cây chuyển gen và bước đầu tạo được dòng đậu tương chuyển gen mang gen GmEXP1. Kết quả đạt được của luận án có giá trị khoa học và thực tiễn cao trong tiếp cận nghiên cứu tạo dòng cây chịu hạn theo hướng cải thiện sự phát triển bộ rễ bằng kỹ thuật chuyển gen ở thực vật. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án Về mặt khoa học Kết quả nghiên cứu góp phần làm sáng tỏ đặc điểm cấu trúc của gen GmEXP1 phân lập từ các cây đậu tương SL1, DT84. Cơ sở khoa học và hiệu quả của kỹ thuật chuyển gen trong việc cải thiện đặc tính chịu hạn của cây trồng đã được khẳng định thông qua việc phát triển thành công vector chuyển gen thực vật mang cấu trúc gen GmEXP1 và tạo được dòng cây thuốc lá chuyển gen có bộ rễ phát triển tốt hơn so với cây đối chứng. Kết quả bước đầu tạo cây đậu tương chuyển gen đã mở ra hướng nghiên cứu kỹ thuật chuyển gen trong cải thiện khả năng chịu hạn của cây đậu tương ở Việt Nam. Các bài báo đăng tải trên các tạp chí khoa học công nghệ quốc tế và trong nước cùng với 9 trình tự gen công bố trên Ngân hàng Gen quốc tế là những tư liệu có giá trị tham khảo trong nghiên cứu và giảng dạy. 4 Về mặt thực tiễn Các dòng cây thuốc lá chuyển gen tạo được có bộ rễ phát triển tốt hơn so với cây đối chứng đã góp phần giải quyết những vấn đề cụ thể về việc sử dụng kỹ thuật chuyển gen có thể cải thiện khả năng kéo dài rễ ở cây đậu tương và những cây trồng khác nhằm nâng cao khả năng chống chịu hạn. Kết quả thiết kế vector chuyển gen thực vật mang gen liên quan đến sự phát triển bộ rễ, tạo được cây chuyển gen đối với thuốc lá và đậu tương là kết quả bước đầu cho hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong cải thiện khả năng chịu hạn của thực vật và mở ra triển vọng ứng dụng mới trong thực tiễn chọn giống cây trồng chịu hạn ở Việt Nam. 6. Cấu trúc luận án: Luận án có 127 trang (kể cả tài liệu tham khảo) được chia thành các chương, phần: Mở đầu (04 trang), Chương 1: Tổng quan tài liệu (33 trang), Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (16 trang); Chương 3: Kết quả nghiên cứu (46 trang); Chương 4: Thảo luận chung kết quả nghiên cứu (09 trang); Kết luận và đề nghị (01 trang); Các công trình công bố liên quan đến luận án (02 trang); Tài liệu tham khảo (16 trang); Phụ lục (8 trang). Luận án có 25 bảng, 31 hình và tham khảo 150 tài liệu. Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án đã tham khảo 18 tài liệu tiếng Việt; 130 tài liệu tiếng Anh và 2 tài liệu từ internet để tổng kết các nội dung có liên quan, bao gồm: (1) Vai trò của bộ rễ thực vật và của cây đậu tương đối với tác động của hạn; (2) Một số gen liên quan đến sự phát triển bộ rễ của thực vật và của cây đậu tương; (3) Chuyển gen liên quan đến hoạt động của bộ rễ cây đậu tương nhờ A. tumefaciens. Bộ rễ thực vật giữ vai trò quan trọng, là cơ quan hấp thu nước chủ yếu cung cấp cho các hoạt động sống của tế bào và cơ thể. Những cây có bộ rễ phát triển kéo dài, đâm xuyên sâu và lan toả
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN LÒ THANH SƠN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ CHUYỂN GEN GmEXP1 LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merrill) Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62.42.01.21 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN S SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2015 Công trình được hoàn thành tại Bộ môn Di truyền học & Sinh học hiện đại, Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên; Phòng Công nghệ DNA ứng dụng, Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam. Người hướng dẫn khoa học: 1. GS. TS. Chu Hoàng Mậu 2. PGS. TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Đại học Họp tại trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên Vào hồi giờ , ngày tháng năm 201 Có thể tìm hiều luận án tại Trung tâm học liệu Đại học Thái Nguyên, Thư viện Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên và Thư viện Quốc gia Việt Nam. CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1. Lo Thanh Son, Le Van Son, Nguyen Vu Thanh Thanh, Chu Hoang Mau (2014), “Cloning and Designing Vector Carrying GmEXP1 Gene Isolated from Local Soybean Cultivar Sonla, Vietnam”, International Journal of Bioscience, Biochemistry and Bioinformatics (IJBBB), 4 (3), pp.191 - 194. 2. Lò Thanh Sơn, Hồ Mạnh Tường, Lê Văn Sơn, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hoàng Mậu (2013), “Tách dòng, thiết kế vector và chuyển gen GmEXP1 vào cây thuốc lá Nicotinana tabacum”, Tạp chí Khoa học Tự nhiên và Công nghệ ĐHQGHN, 29(4), tr.44 - 52. 3. Lò Thanh Sơn, Hồ Mạnh Tường, Lê Văn Sơn, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hoàng Mậu (2013), “Nghiên cứu đặc điểm gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ phân lập từ một số giống đậu tương địa phương Sơn La (Glycine max (L.) Merrill)”, Hội nghị Khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc 2013, Quyển 1, tr.192 - 196. 4. Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Bùi Thị Doan, Lò Thanh Sơn, Chu Hoàng Mậu (2014), “So sánh trình tự gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ phân lập từ mRNA của hai mẫu đậu tương địa phương Bắc Kạn và Vĩnh Phúc”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ Đại học Thái Nguyên, 118(4), tr.129 - 134. Các trình tự gen đăng ký trên Ngân hàng gen quốc tế Accession number of GmEXP1_cDNA: HG799004, HG799005, HG799006, HG799007, HG799008, HG799009, HG799010, LN681352, LN681353. Accession number of GmEXP1_DNA: LM651915, LM651916. - 1 - MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là loại cây trồng chiến lược ở nhiều quốc gia, giữ vị trí quan trọng thứ tư sau lúa, ngô và lúa mì. Đậu tương rất có giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế. Hạt có hàm lượng protein cao, chứa nhiều amino acid không thay thế và các vitamin cần thiết cho cơ thể người và động vật. Thân lá để lại trong đất nhiều chất dinh dưỡng, rễ có nhiều nốt sần do vi khuẩn Rhizobium cộng sinh có khả năng cố định đạm giúp cải tạo độ phì và sử dụng bền vững nguồn tài nguyên đất. Tình trạng biến đổi khí hậu toàn cầu gây khó khăn lớn cho sản xuất nông nghiệp ở nhiều nước châu Á, châu Phi, Nam Mỹ và thu hẹp diện tích sản suất nông nghiệp. Việt Nam có khoảng 75% diện tích là đồi núi, đất dốc nên thường xuyên khan hiếm về nguồn nước gây khó khăn cho canh tác đối với nhiều loại cây trồng, trong đó có đậu tương. Cây đậu tương có thời gian sinh trưởng ngắn, khả năng thích ứng rộng, có thể bố trí phù hợp với nhiều cơ cấu cây trồng trong sản xuất, nhưng lại thuộc nhóm cây trồng chịu hạn kém. Khô hạn có ảnh hưởng trực tiếp đến sinh trưởng phát triển ở tất cả các giai đoạn của cây đậu tương. Thiếu nước ở giai đoạn trước khi hoa nở làm giảm tới 40% năng suất hạt đậu tương so với ảnh hưởng của hạn ở giai đoạn sau khi nở hoa. Chính vì vậy chọn tạo giống đậu tương có khả năng chịu hạn tốt là vấn đề cấp thiết và mang tính thời sự trên thế giới cng như ở Việt Nam. Trong điều kiện khô hạn, sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong tế bào và sự phát triển mạnh của bộ rễ s giúp cây thu được nhiều nước từ các lớp đất sâu, đảm bảo quá trình sinh trưởng và phát triển bình thường của thực vật. Thực vật có bộ rễ phát triển kéo dài, khả năng đâm xuyên tốt, có thể vươn tới những lớp đất sâu s có cơ hội thu nhận được nhiều nước hơn trong điều kiện khô hạn. Đồng thời, sự điều chỉnh thẩm thấu trong tế bào chóp rễ bằng những cơ chế tích luỹ chất khô, tăng cường các kênh vận chuyển tích cực, tăng cường hô hấp và trao đổi ion cng giúp thực vật dễ dàng lấy được lượng nước ít ỏi trong đất. Mặt khác, trong điều kiện hạn, thực vật còn có một loạt các phản ứng kết hợp để tăng cường khả năng chống chịu với điều kiện hạn như điều chỉnh đóng mở khí khổng, giảm thoát sự thoát hơi nước, tăng cường tích nước tế bào… Trong một loạt những phản ứng nói trên ở thực vật dưới - 2 - điều kiện khô hạn của môi trường thì việc nghiên cứu tác động vào sự phát triển kéo dài rễ, thay đổi cấu trúc và số lượng rễ bên được xem là biện pháp hữu hiệu trong việc cải thiện khả năng chịu hạn của cây đậu tương. Cải thiện đặc tính di truyền thích nghi với khô hạn của cây trồng được xem là giải pháp quan trọng trong tình trạng biến đổi khí hậu toàn cầu hiện nay. Hướng tiếp cận nghiên cứu cải thiện sự phát triển bộ rễ của cây đậu tương đã được quan tâm với việc sử dụng kỹ thuật chọn lọc quần thể, lai giống hữu tính, đột biến thực nghiệm và ứng dụng công nghệ sinh học hiện đại, trong đó công nghệ gen được coi là biện pháp có hiệu quả trong nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương có khả năng chịu hạn cao. Từ những lý do trên chúng tôi thực hiện đề tài luận án: “Nghiên cứu đặc điểm và chuyển gen GmEXP1 liên quan đến sự phát triển bộ rễ của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill)”. 2. Mục tiêu nghiên cứu 2.1. Mục tiêu tổng quát Tạo được dòng cây chịu hạn mang cấu trúc gen chuyển liên quan đến sự kéo dài rễ phân lập từ cây đậu tương bằng kỹ thuật chuyển gen. 2.2. Mục tiêu cụ thể (i) Xác định được sự khác biệt về sự phát triển của bộ rễ và sự sai khác về trình tự nucleotide của gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ của một số giống đậu tương địa phương. (ii) Phát triển được vector chuyển gen thực vật mang gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ ở cây đậu tương. (iii) Tạo được dòng cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc gen GmEXP1 biểu hiện sự kéo dài rễ cao hơn so với cây đối chứng không chuyển gen. (iv) Tạo được dòng cây đậu tương chuyển gen mang gen GmEXP1 liên quan đến sự phát triển kéo dài rễ. 3. Nội dung nghiên cứu (1) Nghiên cứu so sánh sự phát triển bộ rễ của một số giống đậu tương thông qua các chỉ tiêu như: chiều dài, kích thước, khối lượng khô của rễ và phân nhóm các giống đậu tương nghiên cứu theo mức độ phát triển bộ rễ. (2) Nghiên cứu thông tin về gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ, thiết kế cặp mồi, khuếch đại, tách dòng và xác định trình tự gen từ cây đậu tương. - 3 - (3) Nghiên cứu phát triển vector chuyển gen thực vật chứa cấu trúc gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ. (4) Nghiên cứu chuyển cấu trúc vector chứa gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ vào cây thuốc lá thông qua A.tumefaciens. Phân tích sự biểu hiện của gen chuyển trên cây thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T 0 và T 1. Phân tích, so sánh sự phát triển bộ rễ của các dòng cây chuyển gen và cây đối chứng ở thế hệ T 1 trên phương diện chiều dài rễ chính, khối lượng khô và thể tích rễ. (5) Nghiên cứu thử nghiệm chuyển cấu trúc mang gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ vào cây đậu tương. 4. Những đóng góp mới của luận án Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu có hệ thống từ phân lập, tách dòng phân tử đến phát triển vector chuyển gen và biểu hiện gen GmEXP1 liên quan đến sự phát triển bộ rễ ở cây thuốc lá và cây đậu tương Việt Nam. ng dụng kỹ thuật Real time RT-PCR và Western blot đã đánh giá được mức độ biểu hiện của gen chuyển trong cây chuyển gen và bước đầu tạo được dòng đậu tương chuyển gen mang gen GmEXP1. Kết quả đạt được của luận án có giá trị khoa học và thực tiễn cao trong tiếp cận nghiên cứu tạo dòng cây chịu hạn theo hướng cải thiện sự phát triển bộ rễ bằng kỹ thuật chuyển gen ở thực vật. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án Về mặt khoa học Kết quả nghiên cứu góp phần làm sáng tỏ đặc điểm cấu trúc của gen GmEXP1 phân lập từ các cây đậu tương SL1, DT84. Cơ sở khoa học và hiệu quả của kỹ thuật chuyển gen trong việc cải thiện đặc tính chịu hạn của cây trồng đã được khẳng định thông qua việc phát triển thành công vector chuyển gen thực vật mang cấu trúc gen GmEXP1 và tạo được dòng cây thuốc lá chuyển gen có bộ rễ phát triển tốt hơn so với cây đối chứng. Kết quả bước đầu tạo cây đậu tương chuyển gen đã mở ra hướng nghiên cứu kỹ thuật chuyển gen trong cải thiện khả năng chịu hạn của cây đậu tương ở Việt Nam. Các bài báo đăng tải trên các tạp chí khoa học công nghệ quốc tế và trong nước cùng với 9 trình tự gen công bố trên Ngân hàng Gen quốc tế là những tư liệu có giá trị tham khảo trong nghiên cứu và giảng dạy. - 4 - Về mặt thực tiễn Các dòng cây thuốc lá chuyển gen tạo được có bộ rễ phát triển tốt hơn so với cây đối chứng đã góp phần giải quyết những vấn đề cụ thể về việc sử dụng kỹ thuật chuyển gen có thể cải thiện khả năng kéo dài rễ ở cây đậu tương và những cây trồng khác nhằm nâng cao khả năng chống chịu hạn. Kết quả thiết kế vector chuyển gen thực vật mang gen liên quan đến sự phát triển bộ rễ, tạo được cây chuyển gen đối với thuốc lá và đậu tương là kết quả bước đầu cho hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong cải thiện khả năng chịu hạn của thực vật và mở ra triển vọng ứng dụng mới trong thực tiễn chọn giống cây trồng chịu hạn ở Việt Nam. 6. Cấu trúc luận án: Luận án có 127 trang (kể cả tài liệu tham khảo) được chia thành các chương, phần: Mở đầu (04 trang), Chương 1: Tổng quan tài liệu (33 trang), Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (16 trang); Chương 3: Kết quả nghiên cứu (46 trang); Chương 4: Thảo luận chung kết quả nghiên cứu (09 trang); Kết luận và đề nghị (01 trang); Các công trình công bố liên quan đến luận án (02 trang); Tài liệu tham khảo (16 trang); Phụ lục (8 trang). Luận án có 25 bảng, 31 hình và tham khảo 150 tài liệu. Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án đã tham khảo 18 tài liệu tiếng Việt; 130 tài liệu tiếng Anh và 2 tài liệu từ internet để tổng kết các nội dung có liên quan, bao gồm: (1) Vai trò của bộ rễ thực vật và của cây đậu tương đối với tác động của hạn; (2) Một số gen liên quan đến sự phát triển bộ rễ của thực vật và của cây đậu tương; (3) Chuyển gen liên quan đến hoạt động của bộ rễ cây đậu tương nhờ A. tumefaciens. Bộ rễ thực vật giữ vai trò quan trọng, là cơ quan hấp thu nước chủ yếu cung cấp cho các hoạt động sống của tế bào và cơ thể. Những cây có bộ rễ phát triển kéo dài, đâm xuyên sâu và lan toả rộng s có nhiều cơ hội thu nhận được nước và dinh dưỡng do vậy có thể dễ dàng vượt qua điều kiện khô hạn (Huck và cs, 1983). Sự phát triển bộ rễ của thực vật và của cây đậu tương được quy định bởi nhiều gen liên quan đến các đặc điểm hình thái, sinh trưởng phát triển, trao đổi chất (Taylor và cs, 1978; Uga và cs, 2013). Cho đến nay, gen chìa khoá xác định sự phát triển kéo dài rễ chưa được tìm ra. Ở cây - 5 - đậu tương, gen EXP1 xác định protein expansin hoạt động chủ yếu ở vùng sinh trưởng của cả rễ chính và rễ bên được cho là có liên quan đến hoạt động phát triển kéo dài rễ (McQueen-Mason và cs, 1994; Choi và cs, 2003; Lee và cs, 2003). Protein expansin là một liên họ bao gồm 4 phân họ là α-expansin (EXPA), β-expansin (EXPB), expansin-like A (EXLA) và expansin-like B (EXLB) có tác động kéo giãn, nới lỏng thành tế bào thực vật. Protein expansin được mã hoá bởi đa họ gen (multi-gene family) được phát hiện ở nhiều thực vật như lúa, yến mạch, đậu tương, ngô, khoai tây Riêng ở cây đậu tương có tới 75 gen EXP khác nhau nằm trên 18 cặp NST tương đồng, trong đó gen GmEXP1 thuộc NST số 17 có kích thước 1491 bp gồm 3 exon và 2 intron xen k. Trình tự mã hoá của gen GmEXP1 dài 768 bp xác định protein α-expansin gồm 255 amino acid (Kende và cs, 2004; Zhu và cs, 2014). Protein tương ứng gồm 3 vùng: vùng tín hiệu dẫn đầu; vùng chức năng DPBB xúc tác dạng enzyme endoglucanase và vùng Pollen allerg bám dính cơ chất (Wu và cs, 2001). Khi thành tế bào đạt "pH sinh trưởng" = 4,5 - 6,0 và tỷ lệ khối lượng expansin với thành tế bào đạt 1 : 10.000 thì expansin gây biến đổi cấu trúc mạng lưới thành tế bào bằng cách len lỏi, bẻ gãy các liên kết phi hoá trị giữa các thành phần polysaccharide với nhau (gồm pectin và hemicellulose) và làm lỏng lẻo mạng lưới polymer. Áp lực sức trương của tế bào làm khoảng cách giữa các vi sợi mở rộng theo cả chiều ngang và chiều dọc (Cosgrove và cs 2000, 2005). Hình 1.4. Cơ chế gây giãn thành tế bào thực vật của expansin (theo Cosgrove - 2000) A: Expansin bẻ gãy các liên kết phi hoá trị giữa glycan với vi sợi cellulose; B: Expansin bẻ gãy các liên kết hoá trị giữa các polysaccharide với nhau; C: Các vi sợi cellulose dễ dàng trượt và đẩy giãn khoảng cách dưới áp lực sức trương của tế bào. Ngoài ra tác động trực tiếp giãn thành tế bào, expansin còn gây hiệu quả gián tiếp tạo khoảng trống cho cellulolase tiếp xúc với cơ chất, đẩy nhanh hiệu quả tăng kích thước tế bào. Một số thực nghiệm chứng minh hoạt động và phân bố của expansin trong tế bào mô thuộc vùng sinh trưởng của rễ đậu tương cho thấy - 6 - vai trò quan trọng của expansin trong việc kéo dài rễ, tạo điều kiện cho thực vật hấp thu được nhiều nước và dinh dưỡng từ các lớp đất sâu (Cosgrove và cs 1998). Những tiến bộ kỹ thuật trong chuyển gen thực vật nhờ A. tumefaciens mở ra khả năng tạo cây đậu tương chuyển gen GmEXP1 cải tiến sự phát triển kéo dài rễ nhằm cải thiện khả năng chịu hạn. Sự tiến bộ thể hiện ở các khâu: hoàn thiện quy trình tái sinh; chọn lọc hiệu quả bằng các gen chỉ thị, gen sàng lọc; ứng dụng thành công và có hiệu quả các kỹ thuật phân tử trong phân tích thể chuyển gen như PCR, Real-time RT-PCR, Western blot; đánh giá chính xác sự biểu hiện chức năng sinh học của gen chuyển Nhờ đó, Việt Nam và Thế giới đã đạt được những thành tựu chuyển gen ở cây đậu tương rất đáng khích lệ (Zhang 2010; Li 2013; de Paiva Rolla 2014; Trần Thị Cúc Hoà 2007; Nguyễn Thị Thuý Hường 2011; Nguyễn Thu Hiền 2014; Lò Thị Mai Thu 2014 ). Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu Sáu giống đậu tương địa phương Sơn La được Trung tâm Nghiên cứu & Phát triển Đậu đỗ - Viện Cây lương thực & Cây thực phẩm - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam và giống đậu tương DT84 do Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam cung cấp được dùng làm vật liệu đánh giá bộ rễ và nghiên cứu đặc điểm gen. Hai giống đậu tương địa phương Bắc Kạn và Vĩnh Phúc được sử dụng làm vật liệu bổ sung trong tách dòng, xác định trình tự nucleotide và phân tích đa dạng trình tự gen GmEXP1. Giống thuốc lá Nicotinana tabacum K326 do Viện Kinh tế Kỹ thuật thuốc lá Việt Nam cung cấp. Các chủng vi khuẩn và các loại vector sử dụng trong đề tài luận án được cung cấp bởi Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam gồm: Escherichia coli DH5α, Agrobacterium tumefaciens CV58; vector pBT tách dòng gen, vector pRTRA7/3, vector pCB301. 2.2. Hoá chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu Hoá chất, các bộ KIT được mua tại các hãng nổi tiếng Thế giới như Bio- Neer, Fermentas, Invitrogen ; Các thí nghiệm được thực hiện từ tháng 02 năm 2012, thí nghiệm sinh lý đánh giá sự phát triển bộ rễ và kiểm tra chức năng sinh học của gen chuyển được tiến hành tại phòng thí nghiệm khoa Sinh Hoá - trường Đại học Tây Bắc. Các thí nghiệm phân lập gen, thiết kế vector, - 7 - chuyển gen và phân tích cây chuyển gen được tiến hành tại phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Phòng Công nghệ Tế bào thực vật và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen thuộc Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Công trình được hoàn thành tại Bộ môn Di truyền và Sinh học hiện đại, Khoa Sinh - Kỹ thuật Nông nghiệp, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên. 2.3. Phương pháp nghiên cứu Các thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ tổng quát mô tả ở hình 2.1. Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát Luận án sử dụng các phương pháp nghiên cứu chia thành 6 nhóm chính: (1) nhóm phương pháp sinh lý đánh giá sự phát triển của bộ rễ, (2) nhóm phương pháp phân lập, tách dòng và xác định trình tự gen, (3) nhóm phương pháp phát triển vector chuyển gen GmEXP1, (4) nhóm phương pháp tạo cây chuyển gen, (5) nhóm phương pháp phân tích cây chuyển gen và (6) phân tích, xử lý số liệu. 2.3.1. Nhóm phương pháp sinh lý đánh giá sự phát triển của bộ rễ Các giống đậu tương, các dòng thuốc lá nghiên cứu được gây hạn trên hệ thống thí nghiệm gây hạn nhân tạo (thực hiện theo Lê Trần Bình và cộng sự - 1998) sau khi nảy mầm và đạt 3 lá thật. Mỗi giống/dòng đều được bố trí song song 3 lô thí nghiệm (lặp lại 3 lần) và một lô đối chứng, mỗi lô 10 cây/1 giai [...]... xác định sự có mặt của gen chuyển GmEXP1 trong các cây đậu tương chuyển gen M: thang chuẩn DNA 1kb; 1 - 9: sản phẩm PCR các cây chuyển gen; (+): sản phẩm PCR vector chuyển gen GmEXP1; (-): sản phẩm PCR DNA cây đậu tương không chuyển gen Điều đó chỉ ra rằng, hệ gen của cây đậu tương chuyển gen số 4 và số 7 (ký hiệu là cây DT04 và cây DT07) có mặt của gen ngoại lai GmEXP1 Hiệu suất chuyển gen GmEXP1 ở... rễ của 6 giống đậu tương địa phương Sơn La và giống DT84 trong điều kiện gây hạn nhân tạo đã được đánh giá dựa trên chỉ tiêu chiều dài rễ chính, thể tích và khối lượng khô của bộ rễ Giống đậu tương SL1 có bộ rễ phát triển tốt nhất, tiếp đến các giống SL4, SL6 và bộ rễ phát triển kém là các giống SL2, SL3, SL5 và DT84 1.2 Gen GmEXP1 của các giống đậu tương nghiên cứu đã được tách dòng thành công và. .. chiều dài rễ chính tăng từ 31,07 đến 41,23% chứng tỏ mối liên quan giữa gen chuyển GmEXP1 đối với sự thay đổi chiều dài rễ chính cây thuốc lá chuyển gen - 19 3.5 KẾT QUẢ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG MANG GEN CHUYỂN GmEXP1 3.5.1 Chuyển cấu trúc mang gen GmEXP1 vào cây đậu tương nhờ A tumefaciens Hạt đậu tương được khử trùng bằng khí Clo, nảy mầm 4-5 ngày trên GM và thu nhận nách lá mầm làm vật liệu nhận gen Biến... DAB) các cây đậu tương chuyển gen thế hệ T0 M: thang chuẩn protein 10-180 kDa; DT04, DT07: mẫu cây chuyển gen số 4 và 7; (-): mẫu cây đậu tương không chuyển gen; (+): protein cây thuốc lá chuyển gen Kết quả cho thấy, cây đậu tương chuyển gen GmEXP1 đã biểu hiện đến mức độ dịch mã cho protein expansin ngoại lai Như vậy có thể thấy, vector chuyển gen pCB301 _GmEXP1 đã thiết kế không chỉ phù hợp với cây thuốc... được chuyển thành công vào giống đậu tương DT84 nhờ A.tumefaciens và tạo được hai cây đậu tương chuyển gen T0 dương tính với PCR Protein expansin tái tổ hợp được biểu hiện ở một dòng cây đậu tương chuyển gen và hiệu suất chuyển gen đạt 0,27% 2 Đề nghị Tiếp tục phân tích các dòng cây đậu tương chuyển gen qua các thế hệ T1, T2, T3 nhằm chọn tạo được dòng cây ổn định về tính trạng phát triển kéo dài rễ và. .. Yên - Sơn La) là giống có bộ rễ phát triển tốt nhất trên các phương diện đánh giá dùng làm vật liệu cung cấp gen GmEXP1; giống DT84 có bộ rễ phát triển kém nhất làm đối tượng tiếp nhận gen chuyển 3.2 ĐẶC ĐIỂM GEN GmEXP1 PHÂN LẬP TỪ MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG 3.2.1 Đặc điểm gen GmEXP1 phân lập từ cDNA của một số giống đậu tương 3.2.1.1 Tách dòng cDNA và xác định trình tự gen GmEXP1 Cặp mồi SoyExp1F_NcoI/SoyExp1R_NotI... gen cho thấy gen chuyển hoạt động dịch mã và di truyền ổn định qua hai thế hệ T0 và T1 Sự biểu hiện chức năng sinh học gen chuyển GmEXP1 đánh giá qua các chỉ tiêu phát triển bộ rễ trong điều kiện gây hạn và không gây hạn cho thấy mối liên quan về vai trò và ý nghĩa của gen GmEXP1 đối với một số tính trạng phát triển bộ rễ thực vật Từ năm 2003, Lee và cs đã chứng minh được vai trò của gen GmEXP1 bằng... nạp Chuyển vector chứa cấu trúc gen chuyển GmEXP1 vào cây thuốc lá N tabacum K326 thông qua vi khuẩn A tumefaciens và tạo cây thuốc lá chuyển gen qua hệ thống tái sinh phù hợp theo mô tả của Topping - 1998 Chuyển vector chứa cấu trúc gen chuyển GmEXP1 vào cây đậu tương DT84 qua nách lá mầm hạt chín nhờ vi khuẩn A tumefaciens Quy trình tạo cây đậu tương chuyển gen được thực hiện dựa trên nghiên cứu của. .. để phân nhóm các giống đậu tương nghiên cứu theo mức độ phát triển của bộ rễ đồng thời xây dựng căn cứ lựa chọn giống đậu tương ưu tú về đặc điểm này phục vụ phân lập gen nhằm cung cấp nguyên liệu cho việc phát triển vector chuyển gen Các chỉ tiêu được đánh giá bao gồm: chiều dài rễ chính, thể tích và khối lượng khô của bộ rễ ở các ngưỡng gây hạn khác nhau của giai đoạn cây đậu tương non Các tham số... nucleotide; vùng mã hoá của gen có kích thước 768 nucleotide mã hoá 255 amino acid 1.3 Vector chuyển gen thực vật mang gen GmEXP1 đã được phát triển và chuyển thành công vào cây thuốc lá N tabacum K326 nhờ A.tumefaciens và tạo được 44 cây thuốc lá chuyển gen T0 trồng trong nhà lưới 1.4 Gen chuyển GmEXP1 được xác định tồn tại trong hệ gen của 32 cây thuốc lá ở thế hệ T0 và 3/32 cây có gen chuyển được biểu . QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1. Lo Thanh Son, Le Van Son, Nguyen Vu Thanh Thanh, Chu Hoang Mau (2014), “Cloning and Designing Vector Carrying GmEXP1 Gene Isolated from Local Soybean Cultivar Sonla, Vietnam”,. quốc 2013, Quyển 1, tr.192 - 196. 4. Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Bùi Thị Doan, Lò Thanh Sơn, Chu Hoàng Mậu (2014), “So sánh trình tự gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ phân lập từ mRNA của hai. vào cây thuốc lá Nicotinana tabacum”, Tạp chí Khoa học Tự nhiên và Công nghệ ĐHQGHN, 29(4), tr.44 - 52. 3. Lò Thanh Sơn, Hồ Mạnh Tường, Lê Văn Sơn, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hoàng Mậu (2013),