ii LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện làm luận văn tốt nghiệp, tôi đã nhận được sự chỉ dạy và giúp đỡ: - Tiến sĩ Huỳnh Ngọc Oanh – Bộ môn Công nghệ Sinh Học – Đại học Bách Khoa Tp HCM – đã gợi ý đề tài, hướng dẫn tận tình về các vấn đề có liên quan, tặng một số hóa chất, sửa từng lỗi chính tả và luôn động viên tinh thần tôi trong suốt thời gian làm luận văn. - Phó Giáo Sư Tiến Sĩ Nguyễn Thúy Hương – Bộ môn Công nghệ Sinh Học – Đại học Bách Khoa Tp HCM – hướng dẫn tận tình về các vấn đề có liên quan và tặng giống vi sinh vật sử dụng trong đề tài. - Tiến sĩ Lê Thị Thủy Tiên và các cán bộ trong phòng thí nghiệm 102, 108 và 117 của Bộ môn Công nghệ Sinh Học – Đại học Bách Khoa Tp HCM – đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có thể sử dụng các trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm. - Các cán bộ phòng thí nghiệm khoa vật liệu của trường Đại Học Nông Lâm đã tận tình giúp đỡ cung cấp các thông số, số liệu. - Các anh chị cao học phòng thí nghiệm 108 chỉ bảo, giúp đỡ và cho mượn một số dụng cụ thí nghiệm. - Các bạn sinh viên lớp HC06BSH – Đại học Bách Khoa Tp HCM – đã cùng học tập, trao đổi kinh nghiệm và giúp đỡ tôi trong quá trình làm luận văn. - Cha, mẹ, anh, chị và em trong gia đình tôi đã động viên tinh thần và giúp đỡ tôi vể mặt kinh tế để tôi an tâm thực hiện luận văn này. Xin gởi đến những lời cám ơn chân thành. iii MỤC LỤC Lời cảm ơn ii Mục lục iii Các từ viết tắt vi Danh mục bảng và danh mục hình vii Chƣơng 1: Mở đầu 1 Chƣơng 2: Tổng quan 2 2.1. Các vi sinh vật sản sinh Bacterial Cellulose (BC) 2 2.2. Sơ lƣợc về vi khuẩn Acetobacter Xylinum 3 2.2.1. Phân loại 3 2.2.2. Đặc điểm về hình thái 3 2.2.3. Đặc điểm về sinh lý 4 2.2.4. Đặc điểm về hóa sinh 4 2.2.5. Đặc điểm về Cellulose vi khuẩn 5 2.3. Sinh tổng hợp BC 8 2.4. Các yếu tố ảnh hƣởng quá trình tạo BC 13 2.4.1. Lên men bề mặt 13 2.4.2. Lên men chìm 13 2.4.3. Ảnh hưởng của phương pháp lên men 14 2.4.4. Ảnh hưởng bởi nhiệt độ 15 2.4.5. Ảnh hưởng bởi pH 15 2.4.6. Ảnh hưởng bởi Oxy 15 2.4.7. Ảnh hưởng bởi nguồn dinh dưỡng 16 2.5. Ứng dụng của BC 16 2.5.1. Ứng dụng BC trong công nghiệp mỹ phẩm 16 iv 2.5.2. Ứng dụng BC trong y học 17 2.5.3. Ứng dụng BC trong thực phẩm 17 2.5.4. Ứng dụng BC trong công nghệ sản xuất giấy 17 2.5.5. Ứng dụng BC trong sản xuất audio 17 2.5.6. Ứng dụng BC trong công nghiệp 18 2.5.7. Ứng dụng BC trong công nghiệp làm ván ép 18 2.6. Tổng quan về enzyme 21 2.6.1. Khái niệm về enzyme 21 2.6.2. Enzyme cố định 24 Chƣơng 3: Vật liệu và phƣơng pháp 28 3.1. Vật liệu, hóa chất, dụng cụ và môi trƣờng 28 3.1.1. Vật liệu 28 3.1.2. Hóa chất 28 3.1.3. Dụng cụ 28 3.1.4 Môi trường 29 3.2. Phƣơng pháp thí nghiệm 29 3.2.1 Phương pháp DNS 29 3.2.2 Phương pháp Bradford 29 3.2.3 Các công thức tính toán 29 3.3. Nội dung thí nghiệm 30 3.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát các đặc tính sinh học của A. xylinum 30 3.3.2. Thí nghiệm 2:Thử nghiệm trong quá trình lên men BC để kết dính vật liệu xơ dừa và mùn cưa. 30 3.3.3. Thí nghiệm 3: Sử dụng BC lên men tĩnh (S-BC) làm chất kết dính vật liệu xơ dừa và mùn cưa 30 3.3.4. Thí nghiệm 4: Tạo màng BC kết hợp celite cố định enzyme. 31 v 3.3. Phƣơng pháp thí nghiệm 31 Chƣơng 4: Kết quả và bàn luận. 35 4.1. Kết quả khảo sát đặc tính sinh học của A.xylinum 35 4.1.1. Kiểm tra vi thể 35 4.1.2. Kiểm tra đại thể 35 4.2. Kết quả khảo sát quá trình nhân giống 37 4.3. Kết quả khảo sát quá trình lên men tĩnh tạo BC để làm chế phẩm kết dính với xơ dừa và mùn cƣa. 38 4.4. Kết quả khảo sát trong quá trình lên men BC kết dính với xơ dừa và mùn cƣa. 41 4.5. Kết quả sử dụng BC làm chất kết dính vật liệu xơ dừa và mùn cƣa. 42 4.5.1. Kết quả đối với độ bền nén 43 4.5.2. Kết quả đối với độ bền kéo 46 4.5.3. Kết quả đối với vị trí đứt cách tâm 48 4.5.4. Kết quả đối với góc uốn cong 50 4.5.5. Kết quả đối với tỷ lệ ngậm nước 51 4.6. Kết quả tạo màng mỏng BC kết hợp celite cố định enzyme Termamyl, enzyme AMG và hỗn hợp enzyme Termamyl với AMG 54 4.6.1. Kết quả hiệu suất cố định protein 54 4.6.2. Kết quả hiệu suất thủy phân của các chế phẩm enzyme cố định 55 4.6.3. Kết quả khảo sát sự rửa trôi của các chế phẩm enzyme cố định qua các lần tái sử dụng 57 4.6.4. Kết quả khảo sát tái sử dụng của các cp enzyme cố định 59 Chƣơng 5: Kết luận và đề nghị 61 Tài liệu tham khảo 63 Phục lục 67 vi CÁC TỪ VIẾT TẮT BC : Bacterial cellulose – cellulose vi khuẩn. S-BC : (satic-BC) cellulose vi khuẩn được sản xuất bằng nuôi cấy tĩnh. A-BC : (agitated-BC) cellulose vi khuẩn được sản xuất bằng nuôi cấy chìm. DAP : (NH) 4 HPO 4 (diamonium hydro phosphate). SA : (NH) 2 SO 4 (ammonium sunfate). BSA : Bovine serum albumin. DNS : dinitrosalicylic acid. sp : sản phẩm. ss : so sánh. hl : hàm lượng. cp : chế phẩm. dd : dung dịch. vii 2.1 Acetobacter xylinum. 4 2.2 6 2.3 - -BC. 7 2.4 A.xylinum 9 2.5 10 2.6 A.xylinum 10 2.7 A.xylinum 12 2.8 14 2.9 14 Hình 2.10 α-amylase 21 Hình 2.11 glucoamylase 23 h 3.1 28 3.2 28 Hình 4.1 Hình dạng vi khuẩn Gram âm A.xylinum 35 Hình 4.2 Hình dạng đại thể A.xylinum trên môi trường đặc 35 Hình 4.3 Ống cấy chuyền vi khuẩn A.xylinum 36 Hình 4.4 Ống nhân giống cấp 1 vi khuẩn A.xylinum 37 Hình 4.5 Erlen nhân giống cấp 2 vi khuẩn A.xylinum 37 Hình 4.6 BC kết dính xơ dừa trong quá trình lên men 41 Hình 4.7 BC đã lên men 7 ngày 42 Hình 4.8 BC kết dính với vật liệu xơ dừa và mạt cưa 42 viii Hình 4.9 Sản phẩm BC kết dính với xơ dừa sau khi ép tạo ván 43 Hình 4.10 Sản phẩm kết dính với mạt cưa 53 Hình 4.11 Sản phẩm kết dính với xơ dừa 53 Hình 4.12 DD protein nhuộm Brashford bị rửa trôi qua các lần tái sử dụng 57 Hình 4.13 Tái sử dụng enzyme cố định để xác định hàm lượng glucose 59 2.1 . 2 Bảng 4.1 Mật độ tế bào theo thời gian lên men 37 Bảng 4.2 Kết quả các chỉ tiêu khảo sát theo thời gian khi lên men tĩnh 39 Bảng 4.3 Độ bền nén của sản phẩm kết dính xơ dừa và mạt cưa 43 Bảng 4.4 Độ bền kéo của sản phẩm kết dính xơ dừa và mạt cưa 46 Bảng 4.5 Vị trí cắt cách tâm của sản phẩm kết dính xơ dừa và mạt cưa 48 Bảng 4.6 Góc uốn cong của sản phẩm kết dính xơ dừa và mạt cưa 50 Bảng 4.7 Tỷ lệ ngậm nước của sản phẩm kết dính xơ dừa và mạt cưa 51 Bảng 4.8 Mối tương quan giữa ∆OD và mật độ protein chuẩn 54 Bảng 4.9 Kết quả hiệu suất cố định enzyme 54 Bảng 4.10 Tương quan giữa ∆OD và nồng độ glucose chuẩn 56 Bảng 4.11 Hiệu suất thủy phân tạo đường khử của các chế phẩm enzyme cố định 56 Bảng 4.12 Số liệu xác định phần trăm protein cố định qua các lần tái sử dụng 58 Bảng 4.13 Hiệu suất thủy phân tạo đường khử của các enzyme cố định qua các lần tái sử dụng 59 ix Đồ thị 4.1 Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn A.xylinum 38 Đồ thị 4.2 Sự thay đổi pH theo thời gian 39 Đồ thị 4.3 Sự thay đổi nồng độ chất khô theo thời gian 40 Đồ thị 4.4 Sự thay đổi khối lượng BC theo thời gian 40 Đồ thị 4.5 So sánh độ bền nén của sp kết dính xơ dừa và mạt cưa 44 Đồ thị 4.6 So sánh độ bền nén của sp kết dính tỷ lệ BC/vật liệu 25% với FRAMA 44 Đồ thị 4.7 So sánh độ bền nén của sp kết dính tỷ lệ BC/vật liệu 30% với FRAMA 45 Đồ thị 4.8 So sánh độ bền nén của sp kết dính tỷ lệ BC/vật liệu 35% với FRAMA 45 Đồ thị 4.9 So sánh độ bền kéo của sp kết dính xơ dừa và mạt cưa 46 Đồ thị 4.10 So sánh độ bền kéo của sp kết dính tỷ lệ BC/vật liệu 20% với FRAMA 47 Đồ thị 4.11 So sánh độ bền kéo của sp kết dính tỷ lệ BC/vật liệu 25% với FRAMA 47 Đồ thị 4.12 So sánh độ bền kéo của sp kết dính tỷ lệ BC/vật liệu 30% với FRAMA 47 Đồ thị 4.13 So sánh độ bền kéo của sp kết dính tỷ lệ BC/vật liệu 35% với FRAMA 48 Đồ thị 4.14 Ss vị trí đứt cách tâm của sp kết dính xơ dừa và mạt cưa 49 Đồ thị 4.15 Ss vị trí đứt cách tâm của sp kết dính tỷ lệ BC/vật liệu 20% với FRAMA. 49 Đồ thị 4.16 Ss vị trí đứt cách tâm của sp kết dính tỷ lệ BC/vật liệu 35% với FRAMA . 50 Đồ thị 4.17 So sánh góc uốn cong của các sản phẩm kết dính và ván ép FRAMA 50 Đồ thị 4.18 So sánh tỷ lệ ngậm nước của sp kết dính xơ dừa và mạt cưa 51 Đồ thị 4.19 Ss tỷ lệ ngậm nước của sp kết dính tỷ lệ BC/vật liệu 20% với FRAMA 52 Đồ thị 4.20 Ss tỷ lệ ngậm nước của sp kết dính tỷ lệ BC/vật liệu 25% với FRAMA 52 Đồ thị 4.21 Tương quan giữa ∆OD và nồng độ albumin 54 Đồ thị 4.22 Hiệu suất cố định protein 55 x Đồ thị 4.23 Biểu diễn sự biến thiên giữa ∆OD và nồng độ glucose chuẩn 56 Đồ thị 4.24 Hiệu suất thủy phân tạo đường khử của các chế phẩm enzyme cố định 57 Đồ thị 4.25 Phần trăm protein cố định qua các lần tái sử dụng 58 Đồ thị 4.26 Khảo sát khả năng tái sử dụng của các chế phẩm enzyme cố định 60 Sơ đồ và q Sơ đồ 2.1 Các phương pháp cố định enzyme 26 2.1 S . 20 Qui trình 3.1 Tạo BC kết dính mùn cưa. 33 Chƣơng 1: Mở đầu 1 CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU Trên thế giới, Acetobacter xylinum đã được nghiên cứu rất nhiều theo hướng sử dụng BC làm vật liệu mới trong nhiều lĩnh vực sản xuất và đời sống. Các kết quả đạt được cho thấy tiềm năng ứng dụng độc đáo trong các lĩnh vực khác nhau như: thực phẩm, y học, dược phẩm, mỹ phẩm, khoa học vật liệu, xử lý môi trường … Phế liệu nông lâm nghiệp là vấn đề lớn trong xử lý chất thải, gây ảnh hưởng đến môi trường. Hiện nay một số công ty và nhà khoa học đã nghiên cứu sử dụng phế liệu để sản xuất nhiều sản phẩm có giá trị cho đời sống, một trong số các sản phẩm đó là ván ép. Tuy nhiên do công nghiệp sản xuất ván ép vẫn còn dùng loại keo kết dính hữu cơ gây độc cho sức khỏe công nhân và ảnh hưởng đến môi trường nên cần thiết nghiên cứu thay thế loại keo hữu cơ thông thường bằng loại keo có khả năng kết dính cao nhưng vẫn đảm bảo sức khỏe con người và môi trường sống. Quan sát thấy cellulose vi khuẩn có những tính chất đặc biệt như độ bền sợi cellulose cao, khả năng giữ nước tốt và có tính kết dính, chúng tôi sử dụng BC để thử nghiệm khả năng là chất kết dính tạo sản phẩm kết dính từ phế liệu nông nghiệp và hướng tới ứng dụng trong sản xuất ván ép. Tên đề tài: “Bƣớc đầu nghiên cứu sử dụng BC làm vật liệu kết dính”. Mục tiêu nghiên cứu: Tiến hành nghiên cứu thử nghiệm để khảo sát khả năng sử dụng cellulose vi khuẩn do vi khuẩn Acetobacter xylinum tạo ra làm tác nhân kết dính trong sản xuất ván ép và vật liệu cố định enzyme. Nội dung nghiên cứu: - Khảo sát đặc điểm sinh học của Acetobacter xylinum - Sử dụng BC làm tác nhân kết dính xơ dừa và mùn cưu. - Tạo màng BC kết hợp celite cố định enzyme. [...]... chúng là keo dính, thường thì ván ép gồm 3 lớp, 5 lớp, 7 lớp và 9 lớp với độ dày từ 1 – 30 mm Ván nhân tạo là sản phẩm được tạo thành từ cellulose thực vật, qua tác dụng liên kết của chất kết dính – keo dưới áp suất của nhiệt độ Những ưu điểm của ván nhân tạo là có thể thiết kế phù hợp với mọi nhu cầu sử dụng, có kích thước khác nhau tùy mục đích sử dụng Ngoài ra có thể kết hợp với các vật liệu chịu nhiệt... tài liệu, giấy có thời gian sử dụng lâu dài, trong vẽ, in, chất dính và chất xơ trên trang vẽ như giấy phủ bề mặt láng trong công nghệ in 2.5.5 Ứng dụng trong sản xuất audio Sử dụng BC làm màng rung bộ chuyển đổi âm thanh dựa vào tính cơ học đặc biệt của màng BC sấy khô có vận tốc truyền âm lớn có thể đạt được 5000m/s Công ty Sony liên kết với công ty Ajinomoto sản xuất ra màng loa phóng thanh đầu. .. mặt, màng BC (S -BC) được tích lũy trên bề mặt môi trường nuôi S -BC thương mại thông dụng như Nata-de Coco, màng rung truyền âm thanh, làm màng trị bỏng… Còn khi nuôi cấy lắc thì BC (A -BC) sẽ có dạng sợi huyền phù, hay dạng khối không đồng nhất (dạng hột nhỏ, hoặc hình cầu, hình elip) Kiểu nuôi này thích hợp hơn cho sản xuất BC công nghiệp và cho các ứng dụng khác của A -BC như: mỹ phẩm, vật liệu, chất... Giảm giá thành vật liệu - Phát triển những sản phẩm có thể tận dụng nguồn nguyên liệu tái chế và có thể tái chế chính nó [34] Sản xuất ván ép từ phế liệu theo (qui trình 2.1) Qui trình 2.1: Sản xuất ván ép từ phế liệu Thuyết minh qui trình [32] Nguồn nguyên liệu sử dụng được tận dụng từ các phế liệu của ngành nông lâm nghiệp: bã mía, bả trấu, mạt cưa, bụi xơ dừa … Nghiền, sàng: nguyên liệu được nghiền... microscope) Những sợi S -BC kéo dài và chồng trên các sợi khác theo chiều đan chéo nhau Những sợi A -BC thì rối rắm và cong (hình 2.3) [22] Ngoài ra, bề mặt cắt ngang của sợi A -BC (0,1-0,2μm) lớn hơn sợi S -BC (0.05 – 0.10μm) Sự khác nhau về hình thái giữa hai loại BC này làm mức độ kết tinh, kích cỡ kết tinh của chúng khác nhau [2],[13] Hình 2.3 Cấ -BC (a) A -BC được tạo ra từ môi trường lắc (b) S -BC được tạo ra... phóng thanh đầu tiên bằng cellulose bởi vi sinh vật [30] 17 Chƣơng 2: Tổng quan 2.5.6 Ứng dụng trong công nghiệp Vật liệu làm quần áo và giày dép, vải da nhân tạo, lều lắp ráp cho cắm trại, quần áo thể thao Trong công nghiệp máy làm thành phần than tàu, máy bay, xe, vỏ bọc tên lửa 2.5.7 Ứng dụng BC làm ván ép nhân tạo Ván ép là sản phẩ ổng hợp, có phạm vi ứng dụng linh hoạt Ván ép được sản xuất bằng cách... trường Đề tài chúng tôi sử dụng chất mang hữu cơ là BC, để cố định enzyme b) Chất mang vô cơ Các chất mang vô cơ được sử dụng thương mại như: silicum oxide, aluminum oxide, magnesium oxdide Đây là những dạng oxide bền với tác động bên ngoài, không bị vi sinh vật ăn mòn phân hủy nhưng việc gắn enzyme chủ yếu thông qua hấp thụ vật lý nên liên kết thường không bền Đề tài chúng tôi sử dụng chất mang vô cơ... màng cellulose cũng có thể được sử dụng như là chất thay thế tạm thời cho da người trong các trường hợp bị bỏng, loét và nhiều trường hợp khác… 2.5.3 Ứng dụng trong thực phẩm BC được sản xuất từ A xylinum được sử dụng làm thức ăn truyền thống của người Philippine, cũng như ở một số nước thuộc Châu Á bao gồm Indonesia, Nhật Bản, Taiwan [18] Sản phẩm cellulose được sử dụng trong nước ép trái cây, một... sử dụng khá nhiều loại keo Keo tự nhiên: đi từ hợp chất sẵn có trong thiên nhiên có nguồn gốc động vật, thực vật và khoáng chất Keo động vật như: keo da, keo xương, keo casein, cánh kiến Keo thực vật như: tinh bột, dextin, các loại nhựa cây như 18 Chƣơng 2: Tổng quan sơn tây, gôm, cao su thiên nhiên, sáp, protein đậu nành, dầu khô Keo khoáng có bitom, nhựa đường Đây là những loại keo được sử dụng đầu. .. chịu nhiệt, dùng để tạo mối nối chịu lực cho vật liệu kim loại và phi kim loại - Keo từ nhựa dẻo (poly isobutilen, polyvinyl acetate, poly acrilate ) nóng chảy khi bị đốt nóng Có chỉ tiêu về độ bền tương đối thấp, nhất là khi sử dụng ở nhiệt độ cao, chủ yếu được sử dụng cho những kết cấu phi kim loại Hiện nay trong công nghiệp sản xuất đồ gỗ người ta sử dụng hai loại là phenolformaldehyde và ure formaldehyde . tài: Bƣớc đầu nghiên cứu sử dụng BC l m vật liệu kết dính”. Mục tiêu nghiên cứu: Tiến hành nghiên cứu thử nghiệm để khảo sát khả năng sử dụng cellulose vi khuẩn do vi khuẩn Acetobacter xylinum. CÁC TỪ VIẾT TẮT BC : Bacterial cellulose – cellulose vi khuẩn. S -BC : (satic -BC) cellulose vi khuẩn được sản xuất bằng nuôi cấy tĩnh. A -BC : (agitated -BC) cellulose vi khuẩn được sản xuất bằng. Cellulose vi khuẩn (bacterial cellulose – BC) 2.2.5.1. Đặc điểm về cấu trúc Cellulose l một polymer không phân nhánh bao gồm những gốc glucopyranose nối với nhau bởi nối β-1,4 glucan. Các nghiên