i LỜI CẢM ƠN Trƣớc tiên em xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Đức Lƣợng đã giúp em tiếp cận vời đề tài này và nhiệt tình chỉ dẫn để em có thể hoàn thành luận văn của mình. Em xin cảm ơn các thầy, cô trong Bộ môn Công nghệ Sinh học đã tận tình chỉ dạy và truyền đạt những kiến thức quý báu trong suốt thời gian qua tạo điều kiện cho em đƣợc học hỏi, trau dồi kiến thức để hoàn thành phần luận văn này. Em xin cảm ơn gia đình đã luôn ủng hộ và tạo điều kiện tốt nhất giúp em hoàn thành tốt những năm học của mình. Cảm ơn các anh chị ở phòng thí nghiệm đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em thực hiện luận văn của mình. Xin cảm ơn tất cả các bạn lớp HC06BSH đã luôn ở bên cạnh và đồng hành cùng em trong suốt những năm học qua. Em xin chân thành cảm ơn! Nguyễn Phƣơng Thảo ii MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC BẢNG vii CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN 3 2.1. Giới thiệu về các phế liệu nông nghiệp 3 2.2. Tình hình sử dụng phế liệu nông nghiệp trong sản xuất bioethanol trong nƣớc và thế giới 5 2.2.1. Tình hình sản xuất trên thế giới 6 2.2.2. Tình hình sản xuất ở Việt Nam 8 2.3. Phƣơng pháp tiền xử lý nguyên liệu lignocellulose trong sản xuất bioethanol 9 2.3.1. Giới thiệu về nguyên liệu lignocellulose 9 2.3.2. Cấu trúc lignocellulose 10 2.3.3. Các phƣơng pháp tiền xử lý nguyên liệu lignocellulose 13 2.4. Quá trình đƣờng hóa 19 2.4.1. Giới thiệu enzyme cellulase 19 2.4.2. Cấu trúc enzyme cellulase 20 2.4.3. Cơ chế tác dụng của enzyme 20 2.4.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình đƣờng hóa 21 2.5. Quá trình lên men rƣợu (Ethanol) 22 2.5.1. Bản chất của quá trình lên men 22 2.5.2. Vi sinh vật sử dụng trong lên men rƣợu 23 2.5.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men 26 iii 2.6. Tính chất hóa lý của lõi bắp 28 2.6.1. Cấu tạo 29 2.6.2. Tính chất 29 2.7. Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất bioethanol từ lõi bắp 31 CHƢƠNG 3: VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP 32 3.1. Vật liệu 32 3.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu 32 3.1.2. Hóa chất – dụng cụ - thiết bị 32 3.1.3. Môi trƣờng nuôi cấy 33 3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 34 3.2.1. Kiểm tra giống 34 3.2.2. Khảo sát khả năng lên men đƣờng glucose của nấm men S.cerevisiae 35 3.2.3. Tiền xử lý lõi bắp và lên men 35 3.2.4. Các phƣơng pháp kiểm tra 36 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ - BÀN LUẬN 40 4.1. Phân lập, kiểm tra giống 40 4.1.1. Kiểm tra hình thái tế bào 40 4.1.2. Xây dựng đƣờng chuẩn sinh khối 41 Để xác định đƣợc mối quan hệ giữa mật độ tế bào và giá trị OD tƣơng ứng ta tiến hành xây dựng đƣờng chuẩn thể hiện mối quan hệ đó. 41 4.1.3. Đƣờng cong sinh trƣởng của nấm men 42 4.2. Khảo sát khả năng lên men đƣờng glucose 43 4.2.1. Khảo sát tỷ lệ giống 43 4.2.2. Khảo sát thời gian lên men 45 iv 4.2.3. Khảo sát nồng độ đƣờng 46 4.3. Độ acid toàn phần 47 4.3.1. Theo mật độ giống 47 4.3.2. Theo nồng độ đƣờng 48 4.4. Tiền xử lý và lên men dịch lõi bắp 49 4.4.1. Đƣờng chuẩn đƣờng tổng 49 4.4.2. Độ cồn 50 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 51 5.1. Kết luận 51 5.2. Đề nghị 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 PHỤ LỤC 57 v DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Một số phế liệu nông nghiệp 3 Hình 2.2: Mối quan hệ giữa các thành phần trong lignocellulose 10 Hình 2.3: Cấu tạo hóa học của cellulose 11 Hình 2.4: Cấu trúc của hemicellulose 12 Hình 2.5: Các đơn vị cấu tạo của lignin 13 Hình 2.6: Tiền xử lý lignocellulose trong sản xuất ethanol 14 Hình 2.7: Sơ đồ quá trình lên men từ glucose 23 Hình 2.8: S.cerevisiae 23 Hình 2.9: Cấu tạo tế bào nấm men 25 Hình 2.10: Sự nảy chồi và hình thành bào tử túi ở S.cerevisiae 26 Hình 2.11: Mặt cắt ngang của lõi bắp 29 Hình 2.12: Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất ethanol từ lõi bắp 31 Hình 4.1: Dịch nhân giống nấm men sau 48h và tế bào nấm men 40 Hình 4.2: Khuẩn lạc S.cerevisiae 41 Hình 4.3: Đƣờng chuẩn biễu diễn mối quan hệ giữa OD và mật độ tế bào 42 Hình 4.4: Đƣờng cong sinh trƣởng của nấm men 42 Hình 4.5: Dịch đƣờng sau lên men 43 Hình 4.6: Đồ thị biểu diễn độ cồn theo tỷ lệ giống 44 vi Hình 4.7: Đồ thị biểu diễn độ cồn theo thời gian lên men 45 Hình 4.8: Đồ thị biểu diễn độ cồn theo nồng độ đƣờng 46 Hình 4.9: Đồ thị giữa độ acid toàn phần và tỷ lệ giống. 47 Hình 4.10: Đồ thị giữa nồng độ đƣờng và độ acid tổng. 48 Hình 4.11: Đƣờng chuẩn đƣờng tổng 49 Hình 4.12: Độ cồn theo thời gian tiền xử lý 50 vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Các nguồn sinh khối chính ở Việt Nam năm 2000 5 Bảng 2.2: Các khu vực tiềm năng trong sản xuất bioethanol 6 Bảng 2.3: Các thành phần của lignocellulose trong các loại phế liệu nông nghiệp 9 Bảng 2.4: Tóm tắt ƣu, nhƣợc điểm của các phƣơng pháp tiền xử lý lignocellulose 19 Bảng 2.5: Các thành phần lignocellulose trong lõi bắp theo khối lƣợng khô 30 Bảng 2.6: Mật độ năng lƣợng của lõi bắp so với các nhiên liệu khác 30 Bảng 4.1: Mối quan hệ giữa mật độ tế bào và OD 41 Bảng 4.2: Ảnh hƣởng của % nấm men 43 Bảng 4.3: Ảnh hƣởng của thời gian lên men đến độ cồn 45 Bảng 4.4: Ảnh hƣởng nồng độ đƣờng đến quá trình lên men 46 Bảng 4.5: Độ acid toàn phần theo mật độ giống 47 Bảng 4.6: Độ acid toàn phần theo nồng độ đƣờng 48 Bảng 4.7: Hàm lƣợng đƣờng theo thời gian xử lý 49 Bảng 4.8: Độ cồn thu đƣợc theo từng mẫu. 50 CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU Hiện nay, các sản phẩm từ dầu mỏ vẫn là nguồn cung cấp nhiên liệu chính cho xã hội và đã đóng góp rất nhiều vào sự phát triển của nền kinh tế thế giới. Cùng với sự phát triển của xã hội nhu cầu sử dụng dầu mỏ ngày càng cao trong khi trữ lƣợng của chúng ngày một giảm, đồng thời thế giới đang phải đối mặt với 3 vấn đề quan trọng đó chính là giá nhiên liệu tăng cao đột ngột, khí hậu thay đổi và không khí bị ô nhiễm. Vì vậy việc tìm ra một loại nhiên liệu mới để thay thế cho các loại nhiên liệu hiện thời là một vấn đề hết sức cấp bách, có rất nhiều loại nhiên liệu thay thế đã đƣợc nghiên cứu và ứng dụng, trong đó nhiên liệu sinh học đã cơ bản giải quyết đƣợc các vấn đề trên. Đây là một nguồn năng lƣợng sạch, có khả năng tái tạo, đặc biệt giúp làm giảm lƣợng khí thải gây hiệu ứng nhà kính, và đƣợc nhiều nƣớc trên thế giới coi là “giải pháp xanh”. Cùng với biodiesel, bioethanol là một nhiên liệu sinh học đang đƣợc sử dụng rông rãi trên thế giới. Tuy nhiên trong thời gian này bioethanol chủ yếu đƣợc sản xuất từ các loại cây lƣơng thực, điều này lại gây ra những vấn đề tranh cãi về việc đảm bảo nguồn lƣơng thực cho toàn cầu và mối lo ngại về việc phá rừng để trồng cây phục vụ sản xuất nhiên liệu sinh học lại làm tăng lƣơng CO 2 gây hiệu ứng nhà kính. Vì vậy những nghiên cứu gần đây hƣớng đến việc tìm ra những nguồn nguyên liệu mới cho việc sản xuất bioethanol. Nhiều quốc gia trên thế giới đang nghiên cứu việc sản xuất bioethanol từ phế phẩm nông nghiệp nhƣ bã mía, rơm rạ, vỏ trấu, lõi bắp, bã khoai mì…những nguồn nguyên liệu này đƣợc cho là đầy triển vọng cho sản xuất bioethanol. Việt Nam là một đất nƣớc sản xuất nông nghiệp lâu đời, ngoài cây lƣơng thực chính là lúa thì bắp cũng là một loại cây trồng rất phổ biến với sản lƣợng khoảng 4.5 triệu tấn/ năm. Tuy nhiên chỉ có hạt bắp đƣợc sử dụng cho nhu cầu dinh dƣỡng trong khi một lƣợng lớn phế phẩm từ cây bắp (thân, lá, lõi) vẫn chƣa đƣợc tận dụng. Đặc biệt lõi bắp thƣờng rất lớn sau khi tách hạt (100 kg trái bắp thu đƣợc khoảng 18 kg lõi bắp) vẫn chƣa đƣợc sử dụng hợp lý. Vì vậy đề tài này nghiên cứu đến việc sử dụng nguồn lõi bắp để sản xuất bioethanol. Nhiệm vụ của luận văn là “Nghiên cứu quá trình tiền sử lý lõi bắp để sản xuất bioethanol”. Qua đề tài này cung cấp cho chúng ta những cơ sở dữ liệu về quá trình CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU 2 xử lý các nguồn phế phẩm nông nghiệp (lõi bắp) để sản xuất bioethanol bằng con đƣờng sinh hóa góp phần tận dụng triệt để nguồn phế phẩm nông nghiệp. Nhiệm vụ của luận văn bao gồm:  Tổng quan về các phƣơng pháp tiền xử lý lõi bắp - Tiền xử lý bằng vật lý - Tiền xử lý bằng phƣơng pháp hóa học - Tiền xử lý bằng phƣơng pháp sinh học  Khảo sát khả năng lên men đƣờng bởi S.cerevisiae - Khảo sát tỷ lệ giống, nồng độ đƣờng, thời gian lên men. - Độ acid toàn phần theo tỷ lệ giống, thời gian lên men và nồng độ đƣờng.  Tiền xử lý lõi bắp và lên men dịch lõi bắp. - Lõi bắp đƣợc tiền xử lý bằng phƣơng pháp sinh học, đƣờng hóa và tiến hành lên men trong điều kiện lên men tối ƣu của nấm men. CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN 3 CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1. Giới thiệu về các phế liệu nông nghiệp Hiện nay các nguồn phế liệu nông nghiệp đang đƣợc quan tâm chú ý đến bao gồm: bã mía, rơm rạ, lõi ngô, bã khoai mì, vỏ trấu, vỏ café…chúng có thể đƣợc sử dụng làm thức ăn cho gia súc, phân bón hay nguyên liệu cho ngành công nghiệp. Gần đây các nguồn nguyên liệu này đƣợc cho là có tiềm năng trong việc sản xuất nhiên liệu sinh học. Đây là nguồn nguyên liệu lignocellulose rẻ tiền, khối lƣợng lớn, không có tính cạnh tranh với lƣơng thực thế giới và việc đốt bỏ hay thải bỏ các nguồn nguyên liệu này không gây ảnh hƣởng xấu đến môi trƣờng, đồng thời giúp cho việc tái sử dụng nguồn phế liệu một cách hiệu quả nhất. Hình 2.1: Một số phế liệu nông nghiệp [36]. [...]... tuyên bố đã nghiên cứu thành công quy trình kỹ thuật sản xuất bioethanol với khối lƣợng lớn nhƣng không cần dùng nguyên liệu là những loại cây lƣơng thực mà là từ cỏ, thậm chí từ những bãi phế liệu Ở Trung Quốc công nghệ sản xuất ethanol từ nguồn cellulose đang đƣợc nghiên cứu và đã có nơi sản xuất đạt 600 tấn/năm 7 CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN 2.2.2 Tình hình sản xuất ở Việt Nam Việc sản xuất và sử dụng nhiên... Antonieta Ferrara đã tiến hành nghiên cứu quá trình sản xuất bioethanol từ sinh khối bằng cách thủy phân bởi enzyme [12] Đặc biệt gần đây tại Sao Paulo (Brazil), nhóm nghiên cứu gồm Marcia A Ribeiro, Vanessa M Cardoso, Manoel N Mori, Jaime Finguerut, Celia M A Galvao và Celina L Duarte đã tiến hành nghiên tận dụng nguồn bã mía để sản xuất bioethanol dùng phƣơng pháp tiền xử lý bằng chiếu xạ điện tử [23]... kế đƣợc quy trình công nghệ sản xuất bioethanol nhiên liệu từ phế phụ phẩm nông nghiệp (rơm rạ, lõi ngô, thân gỗ, bã mía…) và mô hình hệ thống thiết bị sản xuất bioethanol nhiên liệu từ phế phụ phẩm nông nghiệp nhằm triển khai áp dụng tại các cơ sở sản xuất [12] Nhóm nghiên cứu thuộc Viện Sinh học nhiệt đới vừa thành công trong việc sản xuất cồn từ bã khoai mì, cứ 15 kg bã khoai mì sẽ sản xuất đƣợc 1... TỔNG QUAN Theo ƣớc tính nguồn sinh khối lignocellulose có thể sản xuất đƣợc 442 tỉ lít bioethanol/ năm, vì thế tổng tiềm năng sản xuất bioethanol từ phế thải của các vụ mùa và các chất thải của cây trồng là 49 tỷ lít/năm, cao gấp 16 lần so với sản xuất bioethanol hiện thời [10] 2.2.1 Tình hình sản xuất trên thế giới Việc sản xuất và sử dụng bioethanol ở một số nƣớc trên thế giới đã phát triển từ rất sớm,... giúp làm giảm chi phí sản xuất nhiên liệu sinh học này từ cellulose Quy trình dựa trên cơ sở sử dụng amoni để phân hủy cellulose và hemicellulose trong thực vật với hiệu quả cao hơn 75% so với khi chỉ sử dụng các enzyme truyền thống Nghiên cứu cho biết, ta có thể sử dụng quy trình AFEX để xử lý sơ bộ phế thải của cây ngô (lõi bắp, thân cây và lá ngô), sau đó thủy phân và lên men để tạo ra ethanol mà... và pH thấp nhƣ điều kiện trong quá trình tiền xử lý bằng hơi nƣớc Ở nhiệt độ phản ứng cao hơn 200oC, lignin bị kết khối thành những phần riêng biệt và tách ra khỏi cellulose [16] 2.3.3 Các phƣơng pháp tiền xử lý nguyên liệu lignocellulose Bƣớc đầu tiên của quá trình chuyển hóa sinh học trong sản xuất bioethanol là làm giảm kích thƣớc và tiền xử lý nguồn nguyên liệu Quá trình chuyển hóa sinh học cellulose... Tiền xử lý lignocellulose trong sản xuất ethanol [19] 2.3.3.1 Tiền xử lý bằng hóa học Phƣơng pháp này sử dụng các tác động của hóa chất lên nguồn nguyên liệu Các phƣơng pháp hóa học sử dụng cho quá trình tiền xử lý bao gồm: ly giải bằng ozone, thủy phân bằng acid, thủy phân bằng kiềm, sử dụng dung môi hữu cơ…Trong đó phƣơng pháp thủy phân bằng acid và kiềm là 2 phƣơng pháp thông dụng nhất cho quá trình. .. chuyển giao công nghệ sản xuất bioethanol từ trái điều phế phẩm cho 120 hộ trồng điều ở huyện Cẩm Mỹ để sản xuất bioethanol Theo công nghệ này, mỗi tấn trái điều sau khi lấy hạt đƣa vào xử lý chƣng cất sẽ thu đƣợc 80 lít bioethanol 80 độ Trong khoảng thời gian tháng 04/2007 – tháng 12/2009, PGS.TS Vũ Nguyên Thành thực hiện đề tài: Nghiên cứu công nghệ và hệ thống thiết bị sản xuất bioethanol nhiên liệu... tất yếu của nhiều quốc gia trên toàn cầu, việc sử dụng bioethanol đã giúp làm giảm sự ảnh hƣởng vào nhiên liệu hóa thạch Vì thế luôn có những nghiên cứu về sản xuất bioethanol từ các nguồn nguyên liệu mới trong đó có phế liệu nông nghiệp Bảng 2.2: Các khu vực tiềm năng trong sản xuất bioethanol [18] Khu vực Tiềm năng sản xuất bioethanol (GL) Tổng lƣợng bioethanol (GL) Lƣợng xăng dầu tƣơng đƣơng (GL)... chất hóa lý của lõi bắp Ở Việt Nam, bắp là một loại cây lƣơng thực trồng rất phổ biến ở vùng Trung du miền núi phía Bắc, Bắc Trung Bộ, vùng duyên hải miền Trung và Tây nguyên Diện tích trồng bắp ở Việt Nam khá lớn khoảng 1126 nghìn ha, bên cạnh việc sử dụng hạt bắp cho nhu cầu lƣơng thực thì lõi bắp đƣợc thải ra chiếm một khối lƣợng rất lớn nhƣng chƣa đƣợc sử dụng hợp lý Trƣớc đây lõi bắp đã đƣợc sử dụng . lý. Vì vậy đề tài này nghiên cứu đến việc sử dụng nguồn lõi bắp để sản xuất bioethanol. Nhiệm vụ của luận văn là Nghiên cứu quá trình tiền sử lý lõi bắp để sản xuất bioethanol”. Qua đề tài. luận văn bao gồm:  Tổng quan về các phƣơng pháp tiền xử lý lõi bắp - Tiền xử lý bằng vật lý - Tiền xử lý bằng phƣơng pháp hóa học - Tiền xử lý bằng phƣơng pháp sinh học  Khảo sát khả năng. lá, lõi) vẫn chƣa đƣợc tận dụng. Đặc biệt lõi bắp thƣờng rất lớn sau khi tách hạt (100 kg trái bắp thu đƣợc khoảng 18 kg lõi bắp) vẫn chƣa đƣợc sử dụng hợp lý. Vì vậy đề tài này nghiên cứu