BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN LÊ PHƯƠNG HÀ TÊN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CẢI BIẾN CHITOSAN NHẰM TĂNG CƯỜNG HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẨM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Buôn Ma Thuột, năm 2009 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN ………………………. LÊ PHƯƠNG HÀ TÊN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CẢI BIẾN CHITOSAN NHẰM TĂNG CƯỜNG HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẨM Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN ANH DŨNG Buôn Ma Thuột, năm 2009 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong luận văn là trung thực, ñược các ñồng tác giả cho phép sử dụng và chưa từng ñược công bố trong bất kỳ một công trình nào khác. Họ tên tác giả Lê Phương Hà ii LỜI CẢM ƠN ! Trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp, tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành ñến: Ban giám hiệu trường Đại học Tây Nguyên. Các thầy cô Khoa sau Đại học, Khoa KHKT&CN Trường Đại học Tây Nguyên. Các thầy cô phòng thí nghiệm Sinh học thực vật – Khoa Nông Lâm Nghiệp Trường Đại học Tây nguyên ñã ñộng viên và giúp ñỡ cho tôi sớm hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Ban Giám Hiệu, toàn thể các anh chị, các bạn ñồng nghiệp và ñặc biệt là Khoa Trồng Trọt trường Cao ñẳng Công Nghệ và Kinh Tế Bảo Lộc ñã luôn tạo ñiều kiện thuận lợi và nhiệt tình giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian công tác và học tập. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất ñến PGS.TS Nguyễn Anh Dũng, người ñã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ dạy và giúp ñỡ trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn. Xin ghi nhận sự giúp ñỡ của các anh chị trong lớp Cao học Sinh Học Thực Nghiệm K1 ñã luôn ñộng viên và giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường. Cuối cùng tôi vô cùng biết ơn sự quan tâm , khích lệ của người thân trong gia ñình ñã luôn luôn ñộng viên về mọi mặt ñể tôi hoàn thành tốt khóa học này. Xin chân thành cảm ơn! LÊ PHƯƠNG HÀ iii MỤC LỤC Trang Các chữ viết tắt………………………………………………………………i Danh mục ảnh……………………………………………………… ii Danh mục bảng…………………………………………………………… iv Danh mục hình………………………………………………………………v MỞ ĐẦU……………………………………….…………………… 1 Phần 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………… …………… 3 1.1. Tổng quan về chitosan và chitosan oligomer………………………… 3 1.1.1. Công thức cấu tạo …………………………………………………….3 1.1.2. Tính chất của chitosan ……………………………………………… 4 1.1.3. Các ñặc tính của chitosan 6 1.1.4. Ứng dụng của Chitosan và các dẫn suất …………………… ………7 1.1.5. Tình hình nghiên cứu cải biến chitosan 15 1.1.6. Các dẫn suất cải biến của Chitosan 20 1.1.6.1. Chitooligosaccharide …………………………………… …….20 1.1.6.2. Các dẫn suất của Chitosan …………………………… ……….21 1.1.7. Khả năng kháng khuẩn của Chitosan và dẫn suất 25 1.2. Tình hình bảo quản thực phẩm hiện nay 26 1.3. Một số ñặc ñiểm của ñối tượng nghiên cứu 27 1.3.1. Vi khuẩn Escherichia coli 27 1.3.1.1. Đặc ñiểm chung 27 1.3.1.2. Đặc ñiểm sinh vật 28 1.3.1.3. Phòng và trị 28 1.3.2. Vi khuẩn Staphylococcus aureus 28 iv 1.3.2.1. Đặc ñiểm chung 28 1.3.2.2. Phòng bệnh và chữa bệnh 29 Phần 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 30 2.1. Nội dung nghiên cứu 30 2.2. Phương pháp nghiên cứu 30 2.2.1. Địa ñiểm nghiên cứu 30 2.2.2. Vật liệu hoá chất 30 2.2.3. Thiết kế thí nghiệm 30 2.2.3.1. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn 30 2.2.4. Các bước tiến hành 31 2.2.5. Phương pháp nghiên cứu cải biến chitosan 32 2.2.5.1. Phương pháp cải biến chitosan-glucose 32 2.2.5.2. Phương pháp cải biến chitosan-glucosamine 33 2.2.6. Phương pháp nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của các dẫn suất chitosan cải biến 33 2.2.6.1. Xác ñịnh khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp ño ñộ ñục 33 2.2.6.2. Xác ñịnh khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp khuyếch tán trên ñĩa 34 2.2.7. Phương pháp thử nghiệm các dẫn suất chitosan cải biến trong bảo quản thực phẩm 34 2.2.8. Phương pháp xử lý số liệu 37 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1. Nghiên cứu chế tạo dẫn suất Chitosan cải biến 38 3.1.1. Ảnh hưởng khối lượng phân tử của chitosan và tỷ lệ nồng ñộ chitosan/glucose ñến phản ứng Maillard 38 3.1.2. Ảnh hưởng khối lượng phân tử của chitosan và nồng ñộ ñường glucose ñến phản ứng Maillard gắn glucosamine vào mạch chitosan 40 v 3.2. Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của các dẫn suất chitosan cải biến trong invitro 41 3.2.1. Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của chitosan – glucose 41 3.2.2. Kết quả nghiên cứu khả năng kháng khuẩn chitosan – glucosamine cải biến 52 3.3. Kết quả xác ñịnh khả năng kháng khuẩn của chitosan cải biến bằng phương pháp khuyếch tán trên ñĩa 62 3.3.1. Đối với chitosan – glucose 62 3.3.2. Đối với chitosan – glucosamine 65 3.4. Nghiên cứu thử nghiệm các dẫn suất chitosan cải biến trong bảo quản thực phẩm 67 3.4.1. Đối với chitosan – glucose 67 3.4.1.1. Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucose ñến trạng thái cảm quan của thịt trong quá trình bảo quản 67 3.4.1.2. Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucosamine ñến trạng thái cảm quan của thịt trong quá trình bảo quản 71 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 76 4.1. Kết luận ……………………………………….………………………76 4.2. Đề nghị ……………………………………………………………… 76 TÀI LIỆU THAM KHẢO 77 Tiếng Việt 77 Tiếng Anh …………………………………………… ………………… 79 PHỤ LỤC vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT CGC Chitosan – glucose CT1 Công thức 1 CT2 Công thức 2 CT3 Công thức 3 ĐC Đối chứng TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam CV Coefficient of Variation Da Daton ppm parts per million CGC chitosan - glucose LMWC khối lượng phân tử thấp PEG polyethylene glycol vii DANH MỤC BẢNG Trang Bảng1.1: . Ảnh hưởng của khối lượng phân tử của chitosan ñến khả năng kháng khuẩn…… …………………………………………………………17 Bảng 1.2: Chỉ số MIC (µg/ml) và MBC (µg/ml) của chitosan và DEMC 18 Bảng 2.1: Cơ sở cho ñiểm thịt bò theo TCVN 3215-79………………… 37 Bảng 2.2: Hệ số quan trọng của các chỉ tiêu cảm quan của thịt………… 38 Bảng 2.3: Bảng phân cấp chất lượng thịt…………………………………. 38 Bảng 3.1: Ảnh hưởng của khối lượng phân tử và nồng ñộ ñường glucose ñến mức ñộ phản ứng Maillard……………………………………………… 40 Bảng 3.2: Ảnh hưởng của khối lượng phân tử và nồng ñộ ñường glucosamine ñến mức ñộ phản ứng Maillard………………………………41 Bảng 3.3: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose có khối lượng phân tử 30000 Da ñối với vi khuẩn Escherichia coli………………… 43 Bảng 3.4: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose có khối lượng phân tử 30000 Da ñối với vi khuẩn Staphylococcus aureus…………………… 45 Bảng 3.5: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose có khối lượng phân tử 300000 Da ñối với vi khuẩn Escherichia coli………………………… 46 Bảng 3.6: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose có khối lượng phân tử 300000 Da ñối với vi khuẩn Staphylococcus aureus………………… 48 Bảng 3.7: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose có khối lượng phân tử 700000 Da ñối với vi khuẩn Escherichia coli………………………… 50 Bảng 3.8: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose có khối lượng phân tử 700000 Da ñối với vi khuẩn Staphylococcus aureus………………… 51 Bảng 3.9: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine có khối lượng phân tử 30000 Da ñối với vi khuẩn Staphylococcus aureus……………….53 viii Bảng 3.10: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine có khối lượng phân tử 30000 Da ñối với vi khuẩn Escherichia coli…………………… 55 Bảng 3.11: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine có khối lượng phân tử 300000 Da ñối với vi khuẩn Staphylococcus aureus…………… 56 Bảng 3.12: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine có khối lượng phân tử 300000 Da ñối với vi khuẩn Escherichia coli…………………… 57 Bảng 3.13: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine có khối lượng phân tử 700000 Da ñối với vi khuẩn Staphylococcus aureus…………… 59 Bảng 3.14: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine có khối lượng phân tử 700000 Da ñối với vi khuẩn Escherichia coli…………………… 60 Bảng 3.15: Kết quả xác ñịnh khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose bằng phương pháp khuyếch tán trên ñĩa ñối với vi khuẩn S. aureus……… 62 Bảng 3.16: Kết quả xác ñịnh khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose bằng phương pháp khuyếch tán trên ñĩa ñối với vi khuẩn Escherichia coli………………………………………………………………………….63 Bảng 3.17: Kết quả xác ñịnh khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine bằng phương pháp khuyếch tán trên ñĩa ñối với vi khuẩn Staphylococcus aureus………………………………………………… 64 Bảng 3.18: Kết quả xác ñịnh khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine bằng phương pháp khuyếch tán trên ñĩa ñối với vi khuẩn Escherichia coli…………………………………………………………….65 [...]... chitin, trong ó nhóm (-NH2) thay th nhóm (-COCH3) v trí C(s 2) Chitosan ư c c u t o t các m t xích D-glucosamine liên k t v i nhau b i liên k t b-( 1-4 -glicoside, do v y chitosan có th g i là poly b-(1,4 )-2 -amino-2-deoxi-D-glucose ho c là poly b( 1-4 )-D-glucosamine (c u trúc b c III) Các ơn v c u t o nên phân t chitosan là -D-glucosamine hay -( 1,4)2-amino-2-deoxy-D-glucose 1.1.2 Tính ch t c a chitosan a Tính. .. n su t - D n xu t sunfat - D n xu t O-axyl c a chitin /chitosan - D n xu t O-tosyl hóa chitin/ chitoan * Ph n ng v trí N - Ph n ng N-acetyl hóa chitosan - D n xu t N-sunfat chitosan - D n xu t N-glycochitosan(N-hydroxyl-etylchitosan) - D n xu t acroleylen chitosan * Các ph n ng x y ra t i v trí O, N -D n xu t O,N-cacboxymetylchitosan -D n xu t N,O-cacboxymetylchitosan - Ph n ng c t t liên k t b-(1,4)... ho t tính c a chitosan Vì v y, tăng cư ng ho t tính kháng khu n, h n ch kh năng phân hu c a enzyme do vi sinh v t ti t ra, c n ph i c i bi n thay i c u trúc c a chitosan Xu t phát t th c ti n ó, chúng tôi ti n hành nghiên c u tài: Nghiên c u c i bi n chitosan nh m tăng cư ng ho t tính kháng khu n ng d ng trong b o qu n th c ph m” M c tiêu c a tài là: 1 C i bi n chitosan nh m nâng cao ho t tính kháng. .. salicylic aldehyde ã làm gia tăng ho t tính kháng khu n lên nhi u l n MIC c a chitosan i v i E coli kho ng 250 ppm, oligoglucosamine kho ng 8 0- 100 ppm và salicyden oligoglucosamine (SO) ch còn 3 0-4 0 ppm Mu i ammonium b c b n c a chitosan th hi n ho t tính kháng khu n r t cao Ví d : diethylmethylchitosan cloride th hi n ho t tính kháng khu n cao hơn chitosan Hydroxypropyl chitosan ghép v i axit maleic... aureus và E coli trong 30 phút ti p xúc v i n ng mg/ml 100 18 Avadi (2004) nghiên c u ch (DEMC) t o d n su t diethylmethylchitosan tăng kh năng hòa tan trong dung môi, nư c và tăng tính kháng khu n g p hai l n so v i chitosan không c i bi n B ng 1.2: Ch s MIC (µg/ml) và MBC (µg/ml) c a chitosan và DEMC Môi trư ng Ki m ch ng (m u tr ng) AcOH DEMC MIC MBC MIC MBC MIC MBC - Nư c c t Chitosan - - - 500 500 0,25%... salicyden chitosan oligomer ch có 30ppm Ying-Chien Chung và các công s (2005) nghiên c u c i bi n chitosan khi g n các g c ư ng glucose, glucosamine, maltose và fructose b ng ph n ng Maillard tăng kh năng hòa tan và kháng khu n c a chitosan K t qu cho th y: xét v tính tan, α -chitosan phù h p v i chu n b chitosan hoà tan trong nư c hơn là β -chitosan pH t i là 3,3 v i nhi t ph n ng là 65oC Hi u su t t i ưu trong. .. s ch chitosan có ch a các nhóm ch c –OH, -NHCOCH3 trong các m t xích axetyl-D-glucosamine và nhóm –OH, nhóm –NH2 trong 5 m t xích D-glucosamine có nghĩa chúng v a là ancol v a là amin, v a là amit Ph n ng hóa h c có th x y ra v trí nhóm ch c t o ra d n xu t th O-, d n xu t th N- ho c d n xu t th O-, N- M t khác chitosan là nh ng polimer và các monomer ư c n i v i nhau b i các liên k t b-(1,4)-glicoside,... tăng ho t tính kháng khu n: - C i bi n b ng cách tăng i n tích dương c a chitosan - C i bi n b ng cách t o nhánh v i các phân t ư ng - C i bi n b ng cách t o d n su t v i các g c hóa h c khác như phosphate, sulfate, salicylic, … Nguy n Anh Dũng (2003) nghiên c u c i bi n t o d n su t salicydenchitosan nâng cao ho t tính kháng khu n K t qu cho th y ch s MIC c a chitosan oligomer là 100 ppm, trong khi... 1996)[1] + c tính kháng khu n c a chitosan Ho t tính kháng khu n c a chitosan và các d n xu t c a nó ã nh n ư c s quan tâm áng k trong nh ng năm g n ây Cơ ch kháng khu n c a chitosan là nh m t s cơ ch sau: - Chitosan là m t polycationic, chúng tương tác v i thành ph n polyanion vách t bào (polysaccharides và protein) c a vi sinh v t, k t qu là 16 s rò r thành ph n n i bào do các thay i trong tính th m... t khác nhau c a chitosan, chitosan oligomer n kh năng kháng khu n trên 7 lo i vi khu n gram dương và 4 vi khu n gram âm K t qu th y r ng chitosan có kh i lư ng phân t cao có kh năng kháng khu n t t hơn chitosan oligomer có kh i lư ng phân t th p hơn Ho t tính kháng khu n c a chitosan m nh hơn vi khu n gram âm hơn là vi khu n gram dương Ch s MIC c a chitosan bi n ng trong kho ng 0,0 5-0 ,1% tùy thu c . thành phần sinh học mang ñiện tích âm. - Có thể tái sinh theo con ñường sinh học trên trái ñất. - Có khả năng thủy phân sinh học bằng enzyme trong cơ thể. - Có khả năng tương hợp sinh học với. Thú y Thành phố Hồ Chí Minh (1999) cho thấy 50-60% mẫu xét nghiệm không ñạt tiêu chuẩn vi sinh và sinh hóa. Ngộ ñộc thực phẩm do vi khuẩn và ñộc tố của nó thường xảy ra do thiếu sót trong quá. KHUẨN ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẨM Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN ANH DŨNG