ii LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tôi xin gởi lời cảm ơn đến quý thầy cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học trường Đại học Bách Khoa – Đại Quốc Gia Tp HCM đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường. Xin cảm ơn cha mẹ đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi có thể học tập tốt và an tâm hoàn thành tốt luận văn. Xin cảm ơn Ban lãnh đạo Viện nghiên cứu cây ăn quả Miền Nam đã tạo điều kiện cho tôi được nghiên cứu và thực hiện luận văn tốt nghiệp tại Viện. Đồng thời, tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Nguyễn Thanh Bình đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các anh chò thuộc phòng Công nghệ sinh học – Viện nghiên cứu cây ăn quả Miền Nam đã động viên tinh thần và nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiên để tôi thực hiện tốt luận văn. Các bạn sinh viên lớp HC06BSH đã cùng tôi học tập trao đổi kiến thức giúp tôi học tập tốt. iii TÓM TẮT Ứng dụng công nghệ sinh học trong việc tạo giống cây trồng mới đã được các nhà khoa học trên thế giới thực hiện rất thành công, một trong những ứng dụng này là việc nuôi cấy-dung hợp tế bào trần tạo được nhiều giống cây trồng mới có năng suất và chất lượng cao góp phần đa dạng di truyền nguồn gene cây trồng trên toàn thế giới. Các ứng dụng này trên các giống loài cây có múi khác nhau cũng được các nhà khoa học trên thế giới thành công rất nhiều, do đó việc ứng dụng này để cải thiện các giống cam quýt của Việt Nam là cần thiết đặc biệt là các giống bưởi, qt ngon của Việt Nam còn nhiều đặc tính cần cải thiện như nhiều hạt và mẫn cảm với nhiều loại bệnh hại đặc biệt là bệnh VLG. Nghiên cứu phân lập và nuôi cấy tế bào trần từ lá cây tắc Tắc (Fotunella japonica) in vitro, bao gồm hai nội dung chính là 1. Nghiên cứu Xác đònh nồng độ các loại enzyme và thời gian xử lý nhằm phân lập tế bào trần từ lá cây tắc có hiệu quả cao nhất, và xác đònh quy trình ly tâm tinh sạch tế bào trần và 2. Thử nghiệm nuôi cấy tế bào trần cây tắc trên các môi trường nhằm tái sinh tế bào trần thành mô sẹo. Sử dụng phương pháp phân lập tế bào trần qua 2 bước với việc áp dụng các enzyme phân giải vách tế bào là cellualse (2%) và pectinase (0,2 – 0,3%) đã được áp dụng để phân lập tế bào trần từ lá cây Tắc đạt được số lượng tế bào trần nguyên vẹn rất cao 5,51 x 10 7 tế bào/1 g lá sau 16 giờ ủ trong dung dòch enzyme và tinh sạch qua dung dòch rửa và ly tâm 850 vòng/phút trong 10 phút. Đã nuôi cấy thành công tế bào trần cây tắc tạo mô sẹo trên môi trường MT (Murashige and Tucker 1969) cơ bản không có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng. iv MỤC LỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH ix CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2 Mục tiêu cần đạt 3 1.3 Nội dung nghiên cứu 3 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1 Phân loại và nguồn gốc cây có múi 4 2.1.1 Phân loại 4 2.1.2 Nguồn gốc cây có múi 4 2.1.3 Tổng quan về bệnh VLG trên cây có múi 5 2.1.4 Các nghiên cứu về cây có múi 7 2.2 Thành phần và cấu trúc vách tế bào thực vật 11 2.2.1 Cellulose 12 2.2.2 Hemicellulose 12 2.2.3 Pectin 12 2.2.4 Lignin 12 2.3 Tế bào trần 13 2.3.1 Đònh nghóa 13 2.3.2 Đặc điểm của tế bào trần 13 v 2.3.3 Ứng dụng của tế bào trần 14 2.4 Phân lập tế bào trần 14 2.4.1 Nguyên liệu dùng để phân lập tế bào trần 14 2.4.2 Tạo mô sẹo và huyền phù tế bào làm nguyên liệu phân lập tế bào trần 15 2.4.3 Enzyme dùng để tách tế bào trần 18 2.4.4 Phương pháp chung phân lập tế bào trần 21 2.5 Cấy tế bào trần 24 2.5.1 Môi trường nuôi cấy tế bào trần 24 2.5.2 Các phương pháp nuôi cấy tế bào trần 25 2.6 Sơ lược một số thành tựu của kỹ thuật tế bào trần trên cây có múi 26 2.7 Giới thiệu một quy trình phân lập và nuôi cấy tế bào trần cây tắc [10] 29 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 3.1 Thời gian và đòa điểm nghiên cứu 31 3.2 Vật liệu và dụng cụ 31 3.2.1 Vật liệu 31 3.2.2 Dụng cụ 31 3.2.3 Hóa chất và thiết bò 32 3.3 Các bước thực hiện 33 3.3.1 Chuẩn bò dung dòch phân lập tế bào trần 33 3.3.2 Chuẩn bò mẫu lá tắc 35 3.4 Phương pháp 36 vi 3.4.1 Phương pháp phân lập tế bào trần từ mô lá tắc 36 3.4.2 Phương pháp nuôi cấy tế bào trần thu được từ lá tắc 37 3.4.3 Bố trí thí nghiệm 37 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 42 4.1 Ảnh hưởng các nồng độ enzyme lên tổng số tế bào trần thu được từ mô lá cây tắc sau khi phân lập 42 4.2 Ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme lên số TBT thòt lá cây tắc sau khi phân lập 43 4.3 Ảnh hưởng của tốc độ ly tâm lên số tế bào trần thòt lá cây tắc 43 4.4 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sự hình thành dòng mô sẹo từ tế bào trần cây tắc in vitro 44 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 5.1 Kết luận 46 5.2 Đề nghò 46 Phương pháp phân lập tế bào trần từ mô lá tắc 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC 53 vii CÁC TỪ VIẾT TẮT IAA : 3-indolyl-acetic acid BAP : 6-benzynlaminopurine MES : 2(N-morpholino) ethanol sulfonic acid MS : (Murashige và Skoog, 1962) MT : (Murashige và Tucker, 1969) NAA : 1-naphthalene acetic acid TBT : Tế bào trần VLG : Vàng lá Greening CCM : Cây có múi RCC : Rầy chổng cánh viii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Một số loại cây có múi 4 Bảng 2.1 Các giống và loài cây có múi được tái sinh trong phòng thí nghiệm. 28 Bảng 3.1 Dung dòch A (DD Enzyme) 34 Bảng 3.2 Dung dòch B (DD rửa) 34 Bảng 3.3 Dung dòch C (ly tâm thu nhận TBT) 34 Bảng 3.4 Dung dòch D (ly tâm thu nhận TBT) 35 Bảng 3.5 Bố trí thí nghiệm 1 38 Bảng 3.6 Bố trí thí nghiệm 2 39 Bảng 3.7 Bố trí thí nghiệm 3 40 Bảng 3.8 Bố trí thí nghiệm 4 41 Bảng 4.1: Ảnh hưởng các nồng độ enzyme lên tổng số tế bào trần thu được từ mô lá cây tắc (tế bào x 10 7 /g) 42 Bảng 4.2: Ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme lên số TBT thòt lá cây tắc (tế bào x 10 7 /g) 43 Bảng 4.3 Ảnh hưởng của tốc độ ly tâm lên số tế bào trần thòt lá cây tắc (tế bào x 10 6 /g) 44 ix DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Cấu trúc tế bào thực vật 11 Hình 2.2 Cấu trúc vách tế bào thực vật 11 Hình 2.3 Vò trí phân cắt của enzyme cellualase 18 Hình 2.4 Một số loại enzyme thông dụng phân lặp tế bào trần 19 Hình 3.1 Enzyme cellulase 32 Hình 3.2 Enzyme pectinase 33 Hình 3.3 Mẫu lá cắt thành mảnh vuông. 35 Hình 3.4 Mẫu lá cắt dọc theo gân chính 35 Hình 4.1 Tế bào trần lá tắc (vật kính 40X) 42 Chương 1: Mở đầu 1 CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cây có múi thuộc họ Rutaceae và có khoảng 150 chi, 1600 loài được trồng ở vùng nhiệt đới và bán nhiệt đới. Họ Rutaceae được chia ra thành bảy họ phụ gồm 93 chi (Enger, 1931). Cây có múi có nguồn gốc ở chân núi Hy Mã Lạp Sơn ở miền đông bắc Ấn Độ và được trồng ở rất nhiều vùng trên thế giới (FAO, 1998 ). Ở Việt Nam, cây có múi được trồng từ Bắc tới Nam, diện tích tập trung chủ yếu ở 3 vùng trọng điểm: đồng bằng sông Cửu Long (trên 80% tổng diện tích), vùng trung du miền núi phía Bắc (khoảng 17%) và Bắc Trung bộ (khoảng 12%) (Vũ Mạnh Hải, 1999). Ở miền Bắc nhiều giống cây có múi đặc sản nổi tiếng như Bưởi Diễn, Cam Canh Hà Nội, Cam Sành Hà Giang, cam Xã Đoài Riêng ĐBSCL, cây có múi tập trung ở các tỉnh Tiền Giang, Vónh Long, Đồng Tháp và Cần Thơ với các chủng loại đặc sản như bưởi Năm Roi, bưởi Da Xanh, quýt Tiều, quýt Đường, cam Mật, cam Sành, v.v. Tuy đem lại nguồn kinh tế cao nhưng cây có múi nhiễm không ít bệnh nguy hiểm và ngành trồng cây có múi vẫn đang đứng trước những thách thức rất lớn. Bệnh Greening là một trong những bệnh hại quan trọng trên cây có múi. Bệnh được ghi nhận đầu tiên tại Nam Phi vào năm 1947 và hiện nay bệnh này đã và đang lan rộng trên 50 quốc gia, gây thiệt hại cho ngành sản xuất cây ăn quả có múi trên toàn thế giới. (Bar Joseph at al., 1989). Ở Việt Nam, bệnh được ghi nhận từ năm 1960 và hiện nay nhiều vườn cây đã bò chặt bỏ hoàn toàn chỉ sau vài năm trồng do người dân chiết hoặc ghép từ cây đã bò nhiễm bệnh. Kết quả điều tra đã ghi nhận hầu hết các vườn trồng cây có múi ở các tỉnh phía Bắc - Việt Nam như Hà Giang, Tuyên Quang, Nghệ An đều có tỷ lệ cây nhiễm bệnh greening cao lên tới 60-65%. Ở đồng bằng sông Cửu Long một số Chương 1: Mở đầu 2 diện tích trồng cam Sành có năng suất thấp, bò bệnh đã bò người nông dân phá bỏ để trồng lúa hoặc thay thế bằng cây trồng khác.(Hà Minh Trung, 2008). Bệnh lây lan nhanh trên đồng ruộng thông qua nhân giống vô tính và môi giới truyền bệnh là rầy chổng cánh (Diaphorina citri). Để hạn chế bệnh lây lan trên đồng ruộng nhiều giải pháp đã được đề xuất như trồng mới bằng cây giống sạch bệnh, phòng trừ tổng hợp vector truyền bệnh VLG trong đó chú ý biện pháp quản lý cây giống sạch bệnh trước khi trồng, thời điểm trồng và biện pháp trồng xen cây giống sạch bệnh trong vườn ổi. Nghiên cứu giống kháng hoặc chống chòu bệnh VLG cũng được các nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm đầu tư nghiên cứu chọn tạo giống kháng/chống chòu đối với bệnh này. Trong một báo cáo gần đây, Toru Iwanami, 2010 báo cáo xác đònh được giống qt Unzoki (C. keraji hort. ex Tanaka var. unzoki hort. ex Tanaka) có khả năng chống chòu tốt bệnh VLG, cây qt này sau hai năm nhiễm bệnh VLG (phản ứng dương tính khi chẩn đoán bằng PCR) có khả năng sinh trưởng tốt không kém so với cây không bò nhiễm bệnh (số liệu chưa công bố). Do Việt Nam là một trong những quốc gia vùng lãnh thổ nằm trong khu vực khởi nguyên nguồn gốc cây có múi với tập quán trồng từ hạt có từ rất nhiều năm trước đây, vì vậy, Cây có múi Việt Nam có một sự đa dạng di truyền rất lớn và có ý nghóa khoa học trong việc chọn lọc giống cây có múi có khả năng kháng hoặc chống chòu tốt với bệnh này. Việc điều tra, thu thập và đánh giá nguồn gene cây có múi Việt Nam có tính chống chòu bệnh VLG là một công việc cấp thiết, tạo tiền đề cho việc chọn tạo giống kháng/chống chòu bệnh VLG để phát triển ngành công nghiệp CCM Việt Nam. Một trong những kết quả đạt được gần đây mà các tác giả đã báo cáo cây Tắc (còn gọi là cây Quất) có khả năng chống chòu tốt với bệnh VLG và đang được các nhà khoa học trên thế giới chú ý đến công tác lai tạo giống mới tạo ra giống có khả năng kháng hay chống chòu với bệnh này, do [...]... đề tài Nghiên cứu phân lập và nuôi cấy tế bào trần từ lá cây Tắc (Fotunella japonica) in vitro được thực hiện nhằm đáp ứng việc nghiên cứu cơ bản, tạo tiền đề cho những nghiên cứu lai tạo giống mới bằng dung hợp tế bào trần tạo giống kháng bệnh VLG hoặc có những đặc tính mong muốn 1.2 Mục tiêu cần đạt Hoàn thiện quy trình phân lập tế bào trần từ lá cây tắc và bước đầu xác đònh môi trường nuôi cấy tạo... trường nuôi cấy tạo mô sẹo từ tế bào trần cây tắc 1.3 Nội dung nghiên cứu Bao gồm 2 nội dung chính: Xác đònh nồng độ các loại enzyme và thời gian xử lý nhằm phân lập tế bào trần từ lá cây tắc có hiệu quả cao nhất, và xác đònh quy trình ly tâm tinh sạch tế bào trần Thử nghiệm nuôi cấy tế bào trần cây tắc trên các môi trường nhằm tái sinh tế bào trần thành mô sẹo 3 Chương 2: Tổng quan và tài liệu CHƯƠNG 2:... sẹo invitro và huyền phù tế bào Mô sẹo và huyền phù tế bào là nguồn tách tế bào trần được chuộng hơn bởi vì tốc độ phát triển nhanh, màng tế bào mỏng và mức độ đồng đều cao Việc tạo lập và duy trì huyền phù tế bào đòi hỏi điều kiện rất nghiêm ngặt Tuy nhiên, tế bào trần tách từ tế bào được nuôi cấy có những thuận lợi là được phát triển trong điều kiện vô trùng và môi trường dinh dưỡng Tế bào trần từ. .. cả giới sinh vật Việc tái sinh tế bào trần thành một cây hoàn chỉnh đã được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu và trong sản xuất Các nhà khoa học cho thấy hoàn toàn có thể sử dụng các tế bào trần để sản xuất các sản phẩm thứ cấp giống như phương pháp nuôi cấy tế bào đơn 2.4 Phân lập tế bào trần 2.4.1 Nguyên liệu dùng để phân lập tế bào trần Mô và cơ quan dùng tách tế bào trần rất đa dạng như là: lá, chồi... mới để tách tế bào trần và thời gian giữa hai lần cấy chuyền không nên kéo dài 2.4.4.3 Phân lập tế bào trần từ huyền phù tế bào [1] Huyền phù tế bào mới được nuôi cấy trong trạng thái tăng trưởng mạnh cũng là nguồn cung cấp nguyên liệu tốt để cô lập tế bào trần Một phương pháp điển hình để cô lập tế bào trần là 5ml huyền phù tế bào có mật độ tế bào cao được hút cho vào ống ly tâm hình nón và ly tâm tốc... thì tế bào trần có khả năng tái sinh thành tế bào Đây là đặc tính hết sức đặc biệt của tế bào trần Nhờ đó tế bào trần mới phục hồi được toàn bộ chức năng của một tế bào nguyên thủy Khi tế bào trần tái tạo được thành tế bào và trở lại thành tế bào nguyên thủy, chúng có khả năng phát triển và phân chia hoàn toàn giống như tế bào bình thường 13 Chương 2: Tổng quan và tài liệu 2.3.3 Ứng dụng của tế bào trần. .. Thành phần môi trường dinh dưỡng dùng để nuôi cấy tế bào trần tương tự như nuôi cấy mô và tế bào Sự mất đi của vách tế bào làm cho tế bào trần hấp thu dinh dưỡng tốt hơn trong môi trường nuôi cấy Tế bào trần được nuôi cấy thành công trên môi trường đơn giản như MT và Gamborg et al (1968) hoặc trên môi trường phức tạp hơn như Kao và Michayluk (1975) và Kao (1977) Môi trường nuôi cấy phức tạp thường được... Tách tế bào trần từ mô sẹo phôi hóa của giống cam ngọt Trovita Tách tế bào trần từ mô thòt lá của loài họ hàng là cam ba lá Poncitrus trifoliata Dung hợp 2 loại tế bào trần trên với nhau và tái sinh tế bào lai thành cây 26 Chương 2: Tổng quan và tài liệu Phương pháp của Ohgawara và Cộng sự đã trở thành phương pháp kinh điển trong lai tế bào trần (hay còn gọi là lai tế bào sinh dưỡng hay lai tế bào sôma)... người ta đã tách và nuôi cấy tế bào trần từ mô sẹo phôi hóa của giống cam này và đã tái sinh được cam đầu tiên từ tế bào trần [32] Năm 1985, các nhà khoa học Nhật Bản (Ohgawara và cs 1985) lại thành công trong dung hợp tế bào trần của 2 loại cây ăn quả có múi khác nhau và đã tái sinh được cây lai từ tế bào dung hợp giữa giống cam ngọt Trovita và giông cam ba lá Poncitrus trifoliata, tạo ra cây lai tứ bội... trong các môi trường nuôi cấy khác nhau và có ảnh hưởng quyết đònh đối với tách nuôi tế bào trần và tái sinh cây Môi trường nuôi cấy tế bào trần thành công nhất có sử dụng kết hợp cả sucrose và mannitol Tuy nhiên, sau khi tế bào đã tái tạo được vách, cần giảm nồng độ các chất thẩm thấu nhằm duy trì sự phân chia tế bào [27] 24 Chương 2: Tổng quan và tài liệu Tế bào trần được nuôi cấy với mật độ khác . vậy, đề tài Nghiên cứu phân lập và nuôi cấy tế bào trần từ lá cây Tắc (Fotunella japonica) in vitro được thực hiện nhằm đáp ứng việc nghiên cứu cơ bản, tạo tiền đề cho những nghiên cứu lai. 26 2.7 Giới thiệu một quy trình phân lập và nuôi cấy tế bào trần cây tắc [10] 29 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 3.1 Thời gian và đòa điểm nghiên cứu 31 3.2 Vật liệu và dụng. bệnh hại đặc biệt là bệnh VLG. Nghiên cứu phân lập và nuôi cấy tế bào trần từ lá cây tắc Tắc (Fotunella japonica) in vitro, bao gồm hai nội dung chính là 1. Nghiên cứu Xác đònh nồng độ các