i ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT SỰ TẠO RỄ BẤT ĐỊNH CÀ RỐT DAUCUS CAROTA L. VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CAROTENOID SVTH: TRẦN TIẾN ĐẠT MSSV: 60600468 CBHD: TS. LÊ THỊ THỦY TIÊN BỘ MÔN: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Tp. Hồ Chí Minh, 1/2011 i LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của: Tiến sĩ Lê Thị Thủy Tiên - Bộ môn Công nghệ Sinh Học, Đại học Bách Khoa Tp.HCM - đã gợi ý đề tài, hướng dẫn tận tình về các tài liệu, thao tác thí nghiệm về các vấn đề có liên quan tới nuôi cấy thực vậy in vitro trong đề tài mà tôi thực hiện. Tiến sĩ Nguyễn Thúy Hương - Bộ môn Công nghệ Sinh Học, Đại học Bách Khoa Tp.HCM - đã cho mượn một số đề tài luận văn của các anh chị khóa trên tham khảo và giúp tôi có thêm tài liệu cần thiết trong quá trình làm luận văn. Các cán bộ phòng thí nghiệm 102, 108, 117 của Bộ môn Công nghệ Sinh Học, Đại học Bách Khoa Tp.HCM đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có thể sử dụng các trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm. Cha, mẹ, em gái và bạn bè tôi đã luôn động viên tinh thần và giúp đỡ tôi về mặt kinh tế để tôi có thể hoàn thành luận văn này. Các bạn sinh viên lớp HC06BSH - Đại học Bách Khoa Tp.HCM - đã cùng học tập, trao đổi kinh nghiệm và giúp đỡ tôi trong quá trình làm việc. Xin gởi đến lời cảm ơn chân thành tới mọi người!. ii TÓM TẮT LUẬN VĂN Carotenoid là một chất màu rất cần thiết trong đời sống con người với vai trò cung cấp vitamin A và cũng là một nguồn nguyên liệu thiên nhiên mà ngành công nghệ thực phẩm đang tập trung khai thác nhằm thay thế cho chất màu tổng hợp. Nuôi cấy và tăng sinh rễ bất định cây mầm carrot in vitro nhằm đánh giá khả năng thu nhận hợp chất carotenoid từ rễ. Kết quả cho thấy rễ bất định trong môi trường lỏng B5 bổ sung saccharose 40 g/l, NAA 1.5 mg/l, trong điều kiện tối với mật độ khởi đầu 0.5 g/5 ml có sự gia tăng sinh khối cao nhất. Hàm lượng carotenoid thu được cao 4.69 µg/g khi chuyển rễ sang nuôi cấy trong điều kiện kỵ khí tạm thời trong 4 ngày và 4.61 µg/g khi môi trường được bổ sung glucose 10 g/l. iii MỤC LỤC Trang DANH MỤC VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii DANH MỤC ẢNH ix CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục tiêu cần đạt 1 1.3. Nội dung nghiên cứu 1 CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 2.1. Tổng quan về cà rốt. 2 2.1.1. Đặc điểm sinh học 2 2.1.2. Phân bố, thu hái và chế biến 2 2.1.3. Thành phần hóa học 3 2.1.4. Công dụng 3 2.2. Carotenoid 4 2.2.1. Tổng quan 4 2.2.2. Cấu trúc và công thức cấu tạo của một số carotenoid. 5 2.2.3. Sinh tổng hợp carotenoid 6 2.2.4. Vai trò của carotenoid đối với đời sống của thực vật và con người 7 2.2.5. Phương pháp tách chiết carotenoid 8 2.2.6. Hướng nghiên cứu mới về sự thu nhận carotene trong tế bào thực vật. 10 2.3. Chất điều hòa sinh trưởng thực vật. 11 2.3.1. Auxin 11 2.3.1.1. Những ảnh hưởng sinh lý 11 2.3.1.2. Sự thành lập rễ bất định từ cành giâm 12 2.3.2. Gibberellin 13 2.3.3. Cytokinin 14 iv 2.4. Rễ và các phương pháp nuôi cấy rễ để thu hợp chất thứ cấp 15 2.4.1. Vai trò 15 2.4.2. Cấu trúc và sự tăng trưởng của rễ 15 2.4.3. Phân loại rễ 16 2.4.4. Phương pháp nuôi cấy rễ để thu hợp chất thứ cấp 17 2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo rễ bất định in vitro 18 2.6. Một số nghiên cứu về nuôi cấy rễ để thu hợp chất thứ cấp 20 CHƢƠNG 3: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1. Vật liệu 22 2.2. Phương pháp 22 2.2.1. Tạo cây mầm in vitro từ hạt giống cây rau mầm cà rốt Nhật TN 10. 23 2.2.2. Tạo rễ bất định từ tử diệp và trụ hạ diệp cây mầm cà rốt. 24 2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của thể tích nuôi cấy lên sự gia tăng sinh khối rễ. 25 2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng saccharose bổ sung lên sự tăng sinh khối của rễ 25 2.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng glucose lên sự sinh tổng hợp carotenoid 25 2.2.6. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện ky. khí tạm thời lên sự sinh tổng hợp carotenoid ở rễ bất định cà rốt. 26 2.2.7. Phương pháp xác định hàm lượng carotenoid. 26 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 28 3.1. Tạo cây mầm in vitro từ hạt giống cây rau mầm cà rốt Nhật TN 10 28 3.2. Tạo rễ bất định từ tử diệp và trụ hạ diệp cây mầm cà rốt. 29 3.3. Khảo sát ảnh hưởng của thể tích nuôi cấy lên sự tăng sinh khối rễ. 31 3.4. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ saccharose lên sự tăng sinh khối của rễ. 32 3.5. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng glucose lên sự sinh tổng hợp carotenoid. . 33 3.6. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện kỵ khí tạm thời lên sự sinh tổng hợp . carotenoid ở rễ bất định cà rốt. 34 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 4.1 Kết luận 36 4.2 Kiến nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 v PHỤ LỤC 40 vi DANH MỤC VIẾT TẮT 2,4-D 2,4-dicholorophenoxyacetic acid BPA (6-benzylamino)-9-(2-tetrahydropyranyl)-9H-purine) CDP-MEP 4-(Cytidine 5'-diphospho)-2-C-methyl-D-erythritol cs cộng sự DMAPP Dimethylallyl diphosphate DXP 1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate FPP Fernesyl diphosphate 3 GA Gibberellin acid GGPP Geranyl geranyl diphosphate GPP Geranyl diphosphate HMBPP Hydroxymethylbutenyl 4-diphosphate IAA indole-3-acetic acid IBA indole-3-butyric acid IPP Isopentenyl diphosphate kxd không xác định MEC 2-C-Methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate MEP 2-C-Methyl-D-erythritol 4-phosphate NAA naphthaleneacetic acid Sac Saccharose USDA United States Department Of Agriculture vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần hóa học của một số loại rau củ 3 Bảng 1.2. Hàm lượng các carotenoid ở từng loại củ cà rốt . 9 Bảng 2.1. Thời gian xử lý hiếu khí và kỵ khí. 26 Bảng 3.1. Tỷ lệ hạt nảy mầm và phát triển thành cây mầm hoàn chỉnh trên môi trường MS sau 14 ngày. 28 Bảng 3.2. Sự tạo rễ bất định từ tử diệp cây mầm cà rốt 30 Bảng 3.3. Sự tạo rễ bất định từ trụ hạ diệp cây mầm cà rốt 30 Bảng 3.4. Nồng độ carotenoid trong rễ bất định sau 14 ngày nuôi cấy trong môi trường có bổ sung glucose thay đổi. 34 Bảng 3.5. Nồng độ carotenoid trong rễ bất định nuôi cấy trong điều kiện kỵ khí tạm thời 34 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cây cà rốt và củ cà rốt 2 Hình 1.2. Cấu trúc phân tử isoprene 5 Hình 1.3. Một số hợp chất thuộc nhóm carotenoid quan trọng 5 Hình 1.4. Quá trình tổng hợp carotenoid 6 Hình 1.5. Carotenoid trong màng thylakoid 7 Hình 1.6. Lát cắt dọc ngọn rễ 15 Hình 1.7. Hệ thống rễ cọc và rễ chùm 17 Hình 2.1. Quy trình tạo cây mầm in vitro 23 Hình 2.2. Tạo rễ bất định từ tử diệp và trụ hạ diệp 24 Hình 3.1. Hệ số tăng sinh của rễ bất định sau 14 ngày nuôi cấy. 32 Hình 3.2. Hệ số tăng sinh và hàm lượng carotenoid của rễ bất định sau 14 ngày nuôi cấy 33 ix DANH MỤC ẢNH Ảnh 1.1. Màu sắc các loại cà rốt. 8 Ảnh 2.1. Hạt giống cà rốt TN 10 22 Ảnh 2.2 Nút gòn và nút cao su. 26 Ảnh 3.1. Cây mầm sau 14 ngày trên môi trường MS 28 Ảnh 3.2. Rễ bất định từ trụ hạ diệp ứng với NAA 0.5, 1, 1.5 (mg/l) sau 14 ngày nuôi cấy. 29 Ảnh 3.3. Rễ bất định từ tử diệp ứng với NAA 0.5, 1, 1.5 (mg/l) sau 14 ngày nuôi cấy. 29 Ảnh 3.4. Rễ bất định ở các thể tích môi trường 5, 7.5, 10 ml sau 14 ngày nuôi cấy. 31 [...]... thích hợp cho sự gia tăng sinh khối rễ - Xác định vài yếu tố ảnh hưởng lên sự sinh tổng hợp carotenoid của rễ bất định cây mầm cà rốt 1.3 Nội dung nghiên cứu Bao gồm 3 nội dung chính: Tạo rễ bất định từ tử diệp và trụ hạ diệp cây mầm cà rốt Khảo sát ảnh hưởng của saccharose và thể tích môi trường nuôi cấy lên sự gia tăng sinh khối rễ Khảo sát ảnh hưởng của glucose và điều kiện kỵ khí tạm thời đến sự sinh. .. carotenoid từ rễ bất định in vitro đang được nghiên cứu và phát triển rộng rãi vì năng suất thu được sản phẩm cao hơn, điều khiển được các yếu tố nuôi cấy nên có thể công nghiệp hóa được Từ thực trạng trên, cây mầm cà rốt được chọn là nguồn nguyên liệu tạo rễ bất định để đánh giá khả năng thu nhận hàm lượng carotenoid 1.2 Mục tiêu cần đạt - Xác định nguyên liệu thích hợp cho sự tạo rễ bất định - Thành... khi tạo rễ sẽ được cấy chuyền sau mỗi 3 tuần 24 Chương 3: Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu Sau 6 tuần nuôi cấy, xác định tỷ lệ mẫu cấy tạo rễ, chiều dài trung bình rễ và số lượng rễ trung bình/ mẫu nhằm chọn nồng độ NAA tối ưu cho quá trình tạo rễ bất định 3.2.3 Khảo sát ảnh hƣởng của thể tích nuôi cấy lên sự gia tăng sinh khối rễ Mục đích: Chọn thể tích môi trường thích hợp cho sự tăng sinh. .. thân 16 Chương 2: Tổng quan tài liệu Hình 1.7 Hệ thống rễ cọc và rễ chùm Nhiều loài thân bò như (rau má, rau muống), thân ngầm (ngải hoa, cỏ cú) mang nhiều rễ ở mắt của thân và được gọi là rễ bất định Rễ bất định cũng có thể mọc từ kẽ răng của lá (lá trường sanh Kalanchoe) Thường các rễ bất định là các rễ chùm, trên đó có thể mang các rễ phụ nhỏ hơn Rễ bất định ở dứa gai (Pandanus) to và mọc ở phần đáy... carotenoid ở rễ bất định cây cà rốt Môi trường sử dụng để tạo cây mầm cà rốt là: môi trường Murashige và Skoog (1962) 22 Chương 3: Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu Môi trường sử dụng để tăng sinh rễ bất định cây mầm cà rốt là: môi trường B5 (Gamborg, Miller và Ojima, 1960) Các chất bổ sung: agar-agar, glucose, saccharose và NAA 3.2.1 Tạo cây mầm in vitro từ hạt giống cây rau mầm cà rốt Nhật TN... ethylene, cũng như 12 Chương 2: Tổng quan tài liệu những chất ức chế như abscisic acid, và phenolic đều có ảnh hưởng lên sự khởi sinh rễ Ngày nay, auxin được biết là nhóm có ảnh hưởng lớn nhất trên sự tạo rễ và đã được thương mại hóa Các chất tổng hợp như IBA và NAA đã cho hiệu quả kích thích tạo rễ hơn cả IAA Có nhiều báo cáo cho rằng auxin liên quan đến sự khởi tạo rễ bất định và sự phân chia đó của những... sắc các loại cà rốt 8 Chương 2: Tổng quan tài liệu Bảng 1.2 Hàm lượng các carotenoid ở từng loại củ cà rốt [25] Màu cà rốt Cam Surles và cs (2004) Sun và cs (2009) Alasalvar và cs (2001) Nicolle và cs (2004) El-Quadah (2009) Rodriquez-Amaya và cs (2008) Grassmann và cs (2007) Cam sẫm Surles và cs (2004) Sun và cs (2009) Nicolle và cs (2004) Simon và cs (1989) Vàng Surles và cs (2004) Sun và cs (2009)... thực 2 Chương 2: Tổng quan tài liệu phẩm, nhưng hiện nay lại thêm vai trò cây làm thuốc và nguồn nguyên liệu provitamin A Trong việc trồng cà rốt người ta còn phân biệt ra ba loại cà rốt: Cà rốt dài và đỏ có thể trồng ở bất kỳ đất nào, loại củ cà rốt đỏ và dài vừa phải trồng ở những nơi đất ẩm và loại cà rốt làm thức ăn cho gia súc có năng suất cao hơn có thể trồng ở những nơi đất khô Cà rốt phát triển... mầm cà rốt Nhật TN 10 sau khi khử trùng theo quy trình được trình bày ở hình 2.1 được cấy in vitro vào chai thủy tinh 50 ml chứa 10ml môi trường MS, bổ sung saccharose 30 g/l, agar-agar 7 g/l Hạt được nuôi trong tối, sau 7 ngày đem ra ngoài sáng để cây mầm quang hợp Tiến hành khảo sát 2 chế độ khử trùng (1) và (2) 3.2.2 Tạo rễ bất định từ tử diệp và trụ hạ diệp cây mầm cà rốt Mục đích: Tạo rễ bất định. .. sinh tổng hợp carotenoid ở rễ bất định 1 Chương 2: Tổng quan tài liệu CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về cà rốt Còn gọi là hồ la bặc (Trung Quốc) Tên khoa học Daucus carota L., thuộc họ Hoa tán Umbelliferae [5] 2.1.1 Đặc điểm sinh học Cà rốt là một cây sống hai năm, có rễ trụ nhẵn hay có lông Lá mọc so le, không có lá kèm, bẹ khá phát triển, phiến lá xẻ lông chim, càng gần phía đầu càng . sự gia tăng sinh khối rễ. - Xác định vài yếu tố ảnh hưởng lên sự sinh tổng hợp carotenoid của rễ bất định cây mầm cà rốt. 1.3. Nội dung nghiên cứu Bao gồm 3 nội dung chính: Tạo rễ bất định. 3.1. Tạo cây mầm in vitro từ hạt giống cây rau mầm cà rốt Nhật TN 10 28 3.2. Tạo rễ bất định từ tử diệp và trụ hạ diệp cây mầm cà rốt. 29 3.3. Khảo sát ảnh hưởng của thể tích nuôi cấy lên sự. Sự tạo rễ bất định từ tử diệp cây mầm cà rốt 30 Bảng 3.3. Sự tạo rễ bất định từ trụ hạ diệp cây mầm cà rốt 30 Bảng 3.4. Nồng độ carotenoid trong rễ bất định sau 14 ngày nuôi cấy trong môi trường