Luận văn thạc sỹ Chuyên ngành: Hóa Phân tích Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  TRẦN PHÚC NGHĨA ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SẮC KÝ ĐIỆN DI MAO QUẢN PHÂN TÍCH ACESULFAME-K, SACCHARIN, ASPARTAME TRONG ĐỒ UỐNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2011 Luận văn thạc sỹ Chuyên ngành: Hóa Phân tích Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA HOÁ HỌC  TRẦN PHÚC NGHĨA ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SẮC KÝ ĐIỆN DI MAO QUẢN PHÂN TÍCH ACESULFAME-K, SACCHARIN, ASPARTAME TRONG ĐỒ UỐNG CHUYÊN NGÀNH: HOÁ PHÂN TÍCH MÃ SỐ: 60 44 29 Giáo viên hướng dẫn khoa học: TS. LÊ THỊ HỒNG HẢO Hà Nội - 2011 Luận văn thạc sỹ Chuyên ngành: Hóa Phân tích Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Chƣơng I: TỔNG QUAN 2 1.1.Giới thiệu về đường hóa học 2 1.1.1. Định nghĩa 2 1.1.2. Phân loại 2 1.1.3. Tác hại của đường hóa học 2 1.1.4. Tình hình sử dụng đường hóa học trong thực phẩm, đồ uống hiện nay 2 1.2. Đại cương về chất phân tích 4 1.2.1. Acesulfame-K 4 1.2.2. Aspartam 5 1.2.3. Saccharin 6 1.3. Tổng quan về các phương pháp phân tích Ac-k, Sac, As 7 1.3.1 Các phương pháp và xu hướng nghiên cứu trong nước 7 1.3.2 Các phương pháp trên thế giới 7 1.3.2.1. Phương pháp quang phổ UV – VIS 8 1.3.2.2. Các phương pháp HPLC 10 1.3.2.3. Phương pháp điện di mao quản 12 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1.Đối tượng, nội dung và mục tiêu nghiên cứu 14 2.1.1. Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu 14 2.1.2. Nội dung nghiên cứu 14 2.2. Phương pháp nghiên cứu 15 2.2.1. Phương pháp sử lý mẫu 15 2.2.2. Phương pháp sắc ký điện di mao quản 15 2.2.2.1. Cơ sở lý thuyết của điện di mao quản 15 2.2.2.2. Nguyên tắc hoạt động của điện di mao quản 15 2.2.2.3. Đặc điểm của điện di mao quản 16 2.2.2.4. Phân loại điện di mao quản 16 2.2.2.5. Mao quản (cột tách) trong phương pháp điện di mao quản 17 Luận văn thạc sỹ Chuyên ngành: Hóa Phân tích Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên 2.2.2.6. Dòng điện thẩm (Electroosmotic flow-EOF) 17 2.2.2.7. Các thông số phân tích của CE 20 2.2.2.8. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình điện di 21 2.2.2.9. Các loại detector thông dụng trong phương pháp điện di mao quản. 21 2.2.2.10. Điện di mao quản vùng (CZE) 22 2.3. Phương tiện nghiên cứu 22 2.3.1 Nguyên vật liệu 22 2.3.1.1. Chất chuẩn đối chiếu 22 2.3.1.2 Hóa chất dung môi 23 2.3.1.3. Thiết bị dụng cụ 23 2.4. Chuẩn bị các dung dịch hóa chất 24 2.4.1. Pha dung dịch chuẩn gốc 24 2.4.2. Pha dung dịch đệm 25 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1. Tối ưu hóa các điều kiện xác định Ace-K, Sac, Asp bằng kỹ thuật sắc ký điện di mao quản. 27 3.1.1. Một số điều kiện cố định 27 3.1.2. Khảo sát các điều kiện 27 3.1.2.1. Hệ đệm 28 3.1.2.2. Xác định điều kiện nhiệt độ 32 3.1.2.3. Xác định thế đặt vào hai đầu 33 3.1.2.4. Xác định bước sóng định lượng 34 3.1.2.5 Kết luận 36 3.2 Thẩm định phương pháp 36 3.2.1. Tính chọn lọc Error! Bookmark not defined. 3.2.2. Các chất cản trở gây ảnh hưởng 38 3.2.2.1. Ảnh hưởng của chất bảo quản 39 3.2.2.2. Ảnh hưởng của các loại đường 40 3.2.2.3. Ảnh hưởng của phẩm màu 42 3.2.3. Khảo sát lập đường chuẩn 44 Luận văn thạc sỹ Chuyên ngành: Hóa Phân tích Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên 3.2.4. Giới hạn phát hiện LOD 47 3.2.5.Giới hạn định lượng LOQ 49 3.2.6. Khoảng tuyến tính 50 3.2.7. Đánh giá độ chính xác (độ đúng, độ chụm ) của phương pháp 50 3.2.8. Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp 52 3.3. Phân tích mẫu thực tế 54 3.4. Bàn luận về qui trình rửa giải 61 KẾT LUẬN 63 KIẾN NGHỊ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 PHỤ LỤC 69 Luận văn thạc sỹ Chuyên ngành: Hóa Phân tích Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên BẢNG NHỮNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN STT Ký hiệu Giải thích 1 Ace-K Acesulfame 2 Asp Aspartame 3 Brill Brilliant 4 CE Phương pháp điện di mao quản 5 CIEFC Sắc ký điện di mao quản đẳng tốc độ 6 Cyc Cyclamate 7 CZE Điện di mao quản vùng 8 EOF Dòng điện di thẩm thấu 9 Fruc Fructose 10 GEL-CEC Sắc ký điện di mao quản gel (rây phân tử) 11 Glu Glucose 12 HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao 13 IC Sắc ký ion 14 LOD giới hạn phát hiện 15 LOQ Giới hạn định lượng 16 MEKC Điện di mao quản điện động học Mixen 17 Qui Quilenol 18 RSD Độ lệch chuẩn 19 Sac Saccharin 20 Sacch Saccharose 21 Sun Sunset - Yellow 22 Tarta Tartarin 23 TNHH Trách nhiệm hữu hạn 24 UPLC Sắc ký lỏng siêu hiệu suất 25 UV-VIS Quang phổ hấp thụ phân tử Luận văn thạc sỹ Chuyên ngành: Hóa Phân tích Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên MỤC LỤC BẢNG Bảng 3.1. Kết quả sự phụ thuộc giữa diện tích píc của các chất vào các loại đệm 28 Bảng 3.2. Kết quả sự phụ thuộc giữa diện tích píc của các chất vào giá trị pH 29 Bảng 3.3. Kết quả sự phụ thuộc của thời gian lưu của các chất chuẩn 31 vào nồng độ đệm borat 31 Bảng 3.4. Kết quả thời gian lưu của asp, sac, ace-k ở các nhiệt độ khác nhau 32 Bảng 3.5. Thời gian lưu của asp, sac, ace-k khi thay đổi điện thế 34 Bảng 3.6. Diện tích píc của asp, sac, ace-k ở các bước sóng khác nhau 35 Bảng 3.7. Kết quả thể hiện tính chọn lọc của phương pháp 38 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của chất bảo quản lên diện tích pic của Ace-K, Sac, Asp. 39 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của đường Glucose, Fructose, Cyclamate và Saccharose 40 lên diện tích pic của Ace-K, Sac, Asp 40 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của phẩm màu Tarta và Brill, Sunset và Qui 42 tới diện tích pic của Asp, Sac, Ace-K 42 Bảng 3.11. Sự phụ thuộc diện tích píc vào nồng độ Asp, Ace-K, Sac 44 Bảng 3.12. Giá trị phương sai và Ftính của Asp, Sac, Ace-K 47 Bảng 3.13. Giới hạn phát hiện (LOD) theo phương pháp lý thuyết tính theo 49 phương trình đường chuẩn 49 Bảng 3.14: Giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp 49 Bảng 3.15. Khoảng tuyến tính của Asp, Sac, Ace-K 50 Bảng 3.16. Sai số và độ lặp lại của phép đo tại các nồng độ khác nhau 51 Bảng 3.17. Diện tích píc của As, Sac, Ac-k ở các nồng độ khác nhau 53 Bảng 3.18. Kết quả độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp 53 Bảng 3.19. Kết quả diện tích pic đối với mẫu thêm chuẩn và không thêm chuẩn 55 Bảng 3.19. Kết quả phân tích Asp, Sac, Ace trong các mẫu 61 Luận văn thạc sỹ Chuyên ngành: Hóa Phân tích Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên MỤC LỤC HÌNH Trang Hình 2.1. Sơ đồ cấu tạo máy điện di muản 15 Hình 2.2. Mặt cắt ngang của mao quản 17 Hình 2.3. Cấu trúc lớp điện kép trên thành mao quản 18 Hình 2.4. Dòng EOF và lớp điện kép trong mao quản 18 Hình 2.5. Các kiểu dòng chảy và pic sắc ký trong CE. 19 Hình 2.6. Hệ thống phân tích CE: Máy điện di Agilent, máy tính, máy in 23 Hình 3.1: Phổ hấp thụ UV – VIS của asp (a), sac (b), ace- k (c) trong môi 27 trường nước ( L= 65cm, i.d=50 μm, áp suất 50 mbar, I = 50 mA, E = 25 kV) 27 Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích píc của các chất 28 vào các loại đệm 28 Hình 3.3. Điện di đồ của hỗn hợp 3 chất chuẩn asp, sac, ace-k trong điều kiện 29 Đệm borat 20 mM pH 9,00 ( L=65 cm, I=50 mA, V=25kV, t =25oC, áp suất 50 mbar) . 29 Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích píc của 30 asp, sac, ace-k vào giá trị pH của đệm borat 20 mM. 30 Hình 3.5. Điện di đồ của hỗn hợp 3 chất chuẩn asp, sac, ace-k trong điều kiện (Đệm borat pH 9,5, L=65 cm, I= 50mA, V= 25kV, t=25oC áp suất 50 mbar) 30 Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa thời gian lưu của asp, sac, ace-k 31 vào nồng dộ đệm borat pH 9,5 31 Hình 3.7. Điện di đồ của hỗn hợp 3 chất trong điều kiện đệm borat 20 mM 31 ( pH 9,5 và I=50 mA, V=25kV, L= 65 cm, t =25oC, áp suất 50 mbar) 31 Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa thời gian lưu 32 của asp, sac, ace-k vào nhiệt độ 32 Hình 3.9. Điện di đồ của hỗn hợp asp, sac, ace-k ở nhiệt độ 25oC trong điều kiện 33 ( Đệm borat 20 mM, pH 95, và I=50 mA, V=25kV, L= 65 cm, áp suất 50 mbar) 33 Hình 3.10. Đồ thị biểu diện sự phụ thuộc giữa thời gian lưu 34 của asp, sac, ace-k vào điện thế 34 Hình 3.11. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích píc 35 của asp, sac, ace-k vào bước sóng 35 Luận văn thạc sỹ Chuyên ngành: Hóa Phân tích Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên Hình 3.12. Sắc đồ các chất chuẩn trong hỗn hợp ở bước sóng 215,5 nm 35 (L=65 cm, V=25kV, I=50mA, đệm borat 20mM, pH=9,5, t = 20oC, áp suất 50 mbar) 35 Hình 3.13. Điện di đồ của hỗn hợp 3 chất trong điều kiện điện di lựa chọn 36 (L=65cm, I=50 mA, V=25 kV, áp suất 50 mbar, t =25oC, đệm borat 20 mM, pH= 9,5 ) . 36 Hình 3.14. Điện di đồ về thời gian lưu của chuẩn đơn Aspartame (hình c), 37 Acesulfame-k (hình b), Saccharin( hình a) trong điều kiện (L=65cm, I=50 mA, V=25 kV, áp suất 50 mbar, t =25oC, đệm borat 20 mM, pH= 9,5 ) 37 Hình 3.15. Điện di đồ khi thêm các yếu tố ảnh hưởng(axit benzoic 43,04 ppm, 43 axit sorbic 46,08 ppm, glucose 46,24 ppm, fructose 43,04 ppm, saccharose 41,80 ppm, cyclamate 50 ppm, sunset yellow 67,52 ppm , brilliant 18,6 ppm, quilenol 57,12 ppm , tartarin 48,64 ppm ) trong điều kiện (L=54cm, I=50 mA, V=25 kV, áp suất 50 mbar, 43 t =25oC, đệm borat 20 mM, pH= 9,5 ) 43 Hình 3.16. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích píc vào nồng độ Asp 45 và đường chuẩn của Aspartame 45 Hình 3.17. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích píc vào nồng độ Saccharin 45 và đường chuẩn của Saccharin 45 Hình 3.18. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích píc vào nồng độ Acesulfame-K 46 và đường chuẩn của Acesulfame-K 46 Hình 3.19. Đường chuẩn thêm chuẩn của Aspartame (a), Saccharin (b), 56 Acesulfame-K (c) trong mẫu Samurai 56 Hình 3.20. Đường chuẩn thêm chuẩn của Aspartame (a), Saccharin (b), 57 Acesulfame-K (c) trong mẫu Sprite 57 Hình 3.21. Đường chuẩn thêm chuẩn của Aspartame (a), Saccharin (b), 58 Acesulfame-K (c) trong mẫu Lemon C2 58 Hình 3.22. Đường chuẩn thêm chuẩn của Aspartame (a), Saccharin (b), 59 Acesulfame-K (c) trong mẫu Coca Cola 59 Hình 3.23. Đường chuẩn thêm chuẩn của Aspartame (a), Saccharin (b), 60 Acesulfame-K (c) trong mẫu Trà xanh O o 60 Luận văn thạc sỹ Chuyên ngành: Hóa Phân tích Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên MỞ ĐẦU Acesulfame-k, saccharin, và aspartame là những chất ngọt tổng hợp thường được sử dụng trong các ngành sản xuất chế biến dược phẩm, mỹ phẩm, cũng như trong thực phẩm (đặc biệt là các loại đồ uống). Các chất này có thể gây ảnh hưởng tới sức khỏe người dùng ở các mức độ khác nhau tuỳ thuộc vào liều lượng đưa vào cơ thể. Vì vậy, một vấn đề được đặt ra không chỉ với các cơ quan quản lý chất lượng an toàn vệ sinh thực phẩm, mà còn với những nhà sản xuất là phải xây dựng phương pháp phát hiện, định lượng các chất kể trên nhằm phục vụ cho công tác thanh tra, kiểm định và kiểm soát hàm lượng nằm trong tiêu chuẩn cho phép. Hiện nay việc phân tích acesulfame-k, saccharin,và aspartame có thể được tiến hành chủ yếu dựa vào kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Ưu điểm của HPLC là độ chính xác và độ lặp lại cao nhưng chi phí tốn kém và độc hại do sử dụng dung môi hữu cơ. Thêm vào đó, các chất được khảo sát là các chất phân cực, nên việc phân tích bằng HPLC trên thực tế gặp khá nhiều khó khăn. Do đó, trong đề tài nghiên cứu này chúng tôi đã chọn phương pháp điện di mao quản để xác định đồng thời hàm lượng aspartame, acesulfame-k, và saccharin trong các loại đồ uống. Phương pháp này có ưu điểm là thiết bị tương đối đơn giản, chi phí thấp và đặc biệt có thể tích hợp với nhiều loại đetectơ khác nhau như đetectơ quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis), huỳnh quang, khối phổ, điện hóa (đo dòng, đo thế và đo độ dẫn), nên sẽ cho khả năng nhận dạng và định lượng các chất một cách khá chọn lọc. Nghiên cứu được chúng tôi tiến hành nhằm thực hiện 2 mục tiêu: - Xây dựng, thẩm định phương pháp tách và định lượng đồng thời acesulfame-k, saccharin, và aspartame - một số chất chất ngọt tổng hợp hay dùng trong đồ uống, nước giải khát. - Ứng dụng phương pháp vừa xây dựng để phân tích các chất khảo sát kể trên trong một số sản phẩm đang lưu hành trên thị trường. [...]... ngành: Hóa Phân tích Trong đó điện di mao quản vùng (CZE) là kiểu điện di đơn giản nhất, được sử dụng rất rộng dãi Đây cũng là kỹ thuật được sử dụng trong nghiên cứu của luận văn này 2.2.2.5 Mao quản (cột tách) trong phƣơng pháp điện di mao quản Mao quản chính là cột tách, một bộ phận quan trọng trong điện di mao quản Đây là một trong các yếu tố chính quyết định sự điện di của hỗn hợp chất mẫu Mao quản được... bằng màng lọc 0,2μm trước khi tiến hành chạy điện di 2.2.2 Phƣơng pháp sắc ký điện di mao quản 2.2.2.1 Cơ sở lý thuyết của điện di mao quản Điện di mao quản (CE) là một kỹ thuật tách các chất Dựa trên sự di chuyển khác nhau của các phần tử chất tan trong mao quản (đường kính 25-100μm) trên nền của dung dịch chất điện giải có pH thích hợp, dưới tác dụng của điện trường nhất định được cung cấp bởi một... hai đầu mao quản. [7] 2.2.2.2 Nguyên tắc hoạt động của điện di mao quản Sơ đồ hệ thống điện di được trình bày ở hình 2.1 Quá trình điện di được thực hiện trên mao quản silica dài 25-100cm, đường kính trong 25 – 100 µm, đường kính ngoài 300 – 400 µm Sử dụng áp suất để đưa dung dịch mẫu và dung dịch đệm lên mao quản, điện thế một chiều đặt vào hai đầu mao quản tạo ra quá trình tách: các chất phân tích được... chất phân tích  Mao quản - Kích thước (chiều dài, đường kính, độ dày thành) của ống mao quản - Loại mao quản và bề mặt mao quản - Nếu mao quản có nhồi pha tĩnh xốp thì loại pha tĩnh, kích thước, cỡ hạt và độ xốp của nó cũng góp phần ảnh hưởng đến sự tách của các chất phân tích  Lượng mẫu, kỹ thuật và điều kiện nạp mẫu vào mao quản  Các chất phụ gia thêm vào pha động điện di hoặc vào mẫu phân tích. .. chất điện ly nền nên rất kinh tế và không độc hại - Có khả năng tự động hóa nên dễ dàng khi phân tích số lượng mẫu lớn 2.2.2.4 Phân loại điện di mao quản Điện di mao quản có nhiều kiểu khác nhau, nhưng tùy theo cơ chế, bản chất, và đặc điểm của sự tách (sự điện di) xảy ra trong ống mao quản mà có thể phân chia thành các loại hay các kiểu điện di với các tên gọi riêng khác nhau [7] Cụ thể như sau: 1 Điện. .. cực hạt mixen trong dung dịch và linh độ của chất 4 Sắc ký điện di mao quản gel (rây phân tử), (Capillary Gel Electrophoresis Chromatography: Gel-CEC), cơ chế tách là dựa vào linh độ của chất và tương tác các loại cỡ hạt với hạt gel 5 Sắc ký điện di mao quản hội tụ đẳng điện (Capillary Iso-electric Focusing Chromatography: CIEFC) 6 Sắc ký điện di mao quản đẳng tốc độ (Capillary Iso-Tacho-Phoresis Chromatography:... thực hiện các phép tách tự động nhiều mẫu phân tích 2.2.2.10 Điện di mao quản vùng (CZE) Điện di mao quản vùng là một kiểu được ứng dụng đầu tiên và phổ biến của kỹ thuật CE do tính đơn giản của các hoạt động tách và tính linh hoạt của nó Cơ sở tách: Dựa trên sự khác nhau về linh độ điện di của phần tử các chất trong dung dịch Khi đặt vào hai đầu mao quản một điện thế và dòng EOF đủ lớn thì thứ tự rửa... chất điện giải, thành phần pha động điện di và pH của nó - Điện thế đặt vào hai đầu mao quản - Nhiệt độ mao quản trong quá trình điện di - Mao quản, các đặc trưng và tính chất bề mặt của nó - Chất phụ gia Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên Luận văn thạc sỹ Chuyên ngành: Hóa Phân tích 2.2.2.7 Các thông số phân tích của CE  Tốc dộ dịch chuyển vi  i E  i V L L: Chiều dài tổng cộng của mao quản. .. như sau: 1 Điện di mao quản cổ điển (Capillary Electrophoresis: CE) 2 Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis: CZE), cơ chế tách: Linh độ khác nhau của các chất (phụ thuộc điện tích và kích cỡ ion) 3 Sắc ký điện di mao quản điện động học Mixen (Micellary Capillary ElectroKenetic Chromatogrphy: MEKC hay MCEKC), cơ chế tách là: Tương tác phân cực/không phân cực hạt mixen trong dung dịch... làm cho mao quản có nhược điểm là sự truyền nhiệt từ trong mao quản ra môi trường bên ngoài kém đi, ảnh hưởng đến quá trình điện di. [6] 2.2.2.6 Dòng điện thẩm (Electroosmotic flow-EOF) Là sự di chuyển của khối dung dịch trong mao quản dưới tác dụng của điện trường Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên Luận văn thạc sỹ Chuyên ngành: Hóa Phân tích Thành mao quản silica với nhóm silanol Vzet Lớp điện kép . TRẦN PHÚC NGHĨA ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SẮC KÝ ĐIỆN DI MAO QUẢN PHÂN TÍCH ACESULFAME-K, SACCHARIN, ASPARTAME TRONG ĐỒ UỐNG CHUYÊN NGÀNH: HOÁ PHÂN TÍCH MÃ SỐ: 60 44 29 Giáo. pháp sắc ký điện di mao quản 15 2.2.2.1. Cơ sở lý thuyết của điện di mao quản 15 2.2.2.2. Nguyên tắc hoạt động của điện di mao quản 15 2.2.2.3. Đặc điểm của điện di mao quản 16 2.2.2.4. Phân. pháp điện di mao quản 5 CIEFC Sắc ký điện di mao quản đẳng tốc độ 6 Cyc Cyclamate 7 CZE Điện di mao quản vùng 8 EOF Dòng điện di thẩm thấu 9 Fruc Fructose 10 GEL-CEC Sắc ký điện