Thông tin tài liệu
I HC QUC GIA HÀ NI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Lại Phƣơng Liên NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN PHÂN ĐOẠN S7 CỦA CÁC CHỦNG VIRUS GÂY BỆNH LÚA LÙN SỌC ĐEN LUC Hà Ni 2013 I HC QUC GIA HÀ NI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Lại Phƣơng Liên NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN PHÂN ĐOẠN S7 CỦA CÁC CHỦNG VIRUS GÂY BỆNH LÚA LÙN SỌC ĐEN Chuyên ngành: Di truyn hc Mã s: 60420121 LUC NG DN KHOA HC: PGS.TS. Phm Xuân Hi PGS.TS. Nguyn Th Hng Vân Hà Ni 2013 i LỜI CẢM ƠN Tôi xin gi li cc ti PGS.TS. Phạm Xuân Hội và PGS.TS. Nguyễn Thị Hồng Vân n tình ch bng d tôi trong sut quá trình hc tp và nghiên c hoàn thành lu này. Tôi xin bày t lòng bi ti ThS. Nguyễn Duy Phƣơng, CN. Nguyễn Hoàng Quang cùng các cán b, anh ch em trong B môn Bnh hc Phân t Thc vt, Vin Di truyn Nông nghing d tôi rt nhiu trong thi gian thc tp ti B môn. i li ci toàn th các thy cô giáo trong b môn Di truyn hc, khoa Sinh hi hc Khoa hc T i hc Quc gia Hà No u kic hc tp và nghiên cu trong mng hc tp khoa hc, giúp cho tôi có nhng kin thc b ích trong suc. Cui li bi n bè,nhng và tu ki tôi hoàn thành lut nghip. Tôi xin chân thành c Hà Ni, ngày 10 tháng 12 Hc viên thc hin L ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BVTV Bo v thc vt bp Base pair (C) cDNA complementary (DNA b sung) ddNTP Dideoxyribonucleoside triphosphate DNA Axit deoxy ribonucleic dNTP Deoxynucleotidetriphosphates dsRNA Double stranded RNA (ARN s) FDV Fiji disease virus (Virus bnh Fiji) EDTA Axit Ethylenediaminetetra acetic ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay (xét nghim hp th min dch liên kt vi enzyme) EtBr Ethidium Bromide IRRI International Rice Research Institute (Vin nghiên cu lúa quc t) Kb Kilobase LB ng Luria Bertani Lùn s MRCV Mal de Río Cuarto virus (Virus Mal de Rio Cuarto) MRDV Maize rough dwarf virus (Virus lùn ngô) NLRV Nilaparvata lugens virus (Virus nilaparvata lugens) NN&PTNT Nông nghip và phát trin nông thôn OD Optical Density (m quang hc) ORF Open reading frame (c m) OSDV Oat Sterile-Dwarf Virus (Virus lùn yn mch) PCR Polymerase chain reaction (Phn ng chui trùng hp) RBSDV Rice black streaked dwarf virus (Virus lùn s RGSV Rice grassy stunt virus (Virus lúa c) RNA Axit ribonucleic RRSV Rice ragged stunt virus (Virus lùn xon lá) iii RSV Rice stripe virus (Virus lúa sc) RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction RTSV Rice tungro spherical virus (Virus Tungro hình cu) RTBV Rice tungro bacilliform virus (Virus Tungro dng thng) RDV Rice dwarf virus (Virus bnh lúa lùn) RGDV Rice gall dwarf virus (Virus vt u lùn lúa) SRBSDV Southern rice black-streaked dwarf virus (Virus lùn s TAE Tris base Acetic - EDTA iv DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bng 1 Các cp oligo nucleotide s dng trong nghiên cu. 22 Bng 2 Các biu hin ca bnh lùn s 35 Bng 3 Kt qu sàng lc mu bnh b-ELISA và RT-PCR mc 40 Bng 4 Trình t các mc hic thit k phc v cho phn ng RT-PCR 42 Bng 5 So sánh mng nht trình t n S7 phân lp ca các mu Vit Nam và Trung Quc 54 v DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1 Cây lúa b nhim bnh lùn s 8 Hình 2 Rng Sogatella furcifera truyn virus SRBSDV 9 Hình 3 Cu trúc phân t các Fijivirus 11 Hình 4 T chc b gen ca các Fijivirus 11 12 Hình 6 n RNA sa virus SRBSDV trên gel polyacrylamide 12,5%. 14 Hình 7 S xut hin ca protein P7-1 trong t bào vector truyn bnh (ry Sogatella furciferai kính hin t 16 Hình 8 Xét nghim virus SRBSDV b-ELISA 17 Hình 9 Vector nhân dòng pGEM-T và mt s v trí ct ca các enzyme ct gii hn trên vector pGEM-T 32 Hình 10 Triu chng mt s mu lúa thu thp ti các tnh Vit Nam 37 Hình 11 Mt s kt qu kim tra ELISA vi các mu thu thp các tnh Vit Nam 38 Hình 12 Mt phn kt qu n di kim tra sn phm RT-PCR mt c ca các mu lúa 39 Hình 13 Hình n di genome ca SRBSDV phân lp t 12 mu lúa 40 Hình 14 Kt qu n S7 phân lc ca SRBSDV trên gel agarose 1% (chng Thái Bình-2) 42 Hình 15 Kt qu n di sn phm PCR vi cp mc hiu ca phân n S7 43 Hình 16 Kt qu n di sn phm DNA tinh sch bng b kit GenJET TM Gel Extraction trên gel agarose 1% 45 Hình 17 minh ha quá trình dòng hóa S7 vào vector pGEM-T 46 Hình 18 Kt qu bin np sn phm phn ng gn vào E.coli chng 46 vi DH5 Hình 19 Kt qu n di kim tra sn phm plasmid tinh sch trên gel agarose 1% 47 Hình 20 Kt qu n di sn phm PCR t plasmid tinh sch S dng cp mi S7-Fw/S7-Rv 48 Hình 21 Kt qu n di sn phm PCR t plasmid tinh sch s dng cp mi T7-Fw/SP6-Rv 49 Hình 22 Kt qu n di sn phm ct gii hn vector tái t hp pGEM-T/S7 bng enzyme EcoRI 50 Hình 23 Mt phn kt qu gii trình t n S7 ca virus SRBSDV (mu Ngh An) 50 Hình 24 Trình t amino acid suy din cc m nm trên n S7 (mu Ngh An) 51 Hình 25 Mt phn kt qu so sánh trình t n S7 ca các mc ti Vit Nam và trên th gii 53 Hình 26 Mt phn kt qu so sánh trình t n S7 ca các mc ti Vit Nam và trên th gii 53 Hình 27 Hai cây ph h da trên toàn b trình t S7 (A) và trình t gen P7-1 (B) 55 vii MỤC LỤC M U 1 - TNG QUAN TÀI LIU 3 1.1. GII THIU CHUNG V CÁC VIRUS HI LÚA VIT NAM 3 1.1.1. Các virus gây bnh trên lúa 3 1.1.2. Tình hình nghiên cu virus hi lúa Vit Nam 3 1.2. BNH LÙN S 5 1.2.1. Gii thiu chung v bnh lùn s 5 1.2.1.1. Ngun gc phát sinh bnh lùn s 5 1.2.1.2. Din bin bnh lúa lùn si Vit Nam 6 m bnh hc ca bnh lùn s 7 1.2.2.1.Du hiu nhn bit 7 1.2.2.2. Vector truyn bnh 8 m sinh hc ca virus SRBSDV 10 1.2.3.1. Phân loi 10 m hình thái ca SRBSDV 12 m di truyn ca virus SRBSDV 12 1.2.3.4. n S7 và kh n hóa ca SRBSDV 14 1.2.3.5. Chu 16 1.2.4. Tình hình nghiên cu bnh lùn s Vit Nam 17 1.2.4.1. Các nghiên cnh virus SRBSDV 17 1.2.4.2. Các nghiên cu v quy trình ch 19 - VT LIU 21 2.1. VT LIU 21 2.1.1. ng nghiên cu 21 2.1.2. Hóa cht 21 2.1.3. Thit b 22 viii 2.2. 22 2.2.1. Thu mu 22 2.2.2. Xét nghim mu 22 c ELISA gc hiu - "Sandwich ELISA" 23 2.2.2.2. RT-PCR mc 25 n di DNA trên gel agarose 1% 26 2.2.3. Tinh sch dsRNA ca SRBSDV bng ct CF-11 26 2.2.4. Tng hp cDNA t dsRNA 28 2.2.4.1 Thit k cp mi 28 2.2.4.2. Tng hp cDNA si 1 28 2.2.4.3. Tng hp cDNA st PCR 29 2.2.4.4. Tinh sch sn phm PCR t gel agarose bng b kit Fermentas 30 2.2.5. Nhân dòng sn phm PCR bng b kit pGEM®-T Easy Cloning 31 2.2.5.1. Phn ng gn sn phm PCR vào vector pGEM-T 31 2.2.5.2. Bin np DNA vào t bo kh bin E.colich 32 2.2.6. Tinh sch plasmid t vi khun E.coli bng b kit GenJET TM Plasmid Miniprep 33 2.2.7. Ct enzyme gii hn 33 2.2.8. Gii trình t 34 ng di truyn S7 35 KT QU VÀ THO LUN 36 3.1. Thu thp và bo qun mu 36 3.2. Kt qu sàng lc mu bnh b-ELISA và RT-PCR mc 38 3.2.1. Kt qu xét nghim mu bnh s d- ELISA 38 3.2.2. Sàng lc mu bnh b-c 39 3.3. Phân lp h gen ca các mu SRBSDV 39 3.4. Phân ln S7 ca SRBSDV thu thp t mu lúa bnh 41 3.5. Nhân bn S7 b-PCR 43 3.5.1. Thit k n mc hiu cho phn ng RT-PCR phc v nhân bn S7 43 3.5.2. Nhân bn S7 b-PCR 43 [...]... truyền bệnh là rầy lƣng trắng (Sogatella furcifera), do đó có vai trò quan trọng trong nghiên cứu tính đa dạng di truyền và sự tiến hóa của virus Dựa vào thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu đa dạng di truyền phân đoạn S7 của các chủng virus gây bệnh lúa lùn sọc đen với những mục tiêu chính nhƣ sau: - Phân lập và giải trình tự phân đoạn S7 của vius SRBSDV trên các mẫu lúa. .. loại bệnh virus gây thành dịch, bao gồm bệnh vàng lá di động, bệnh tungro, bệnh lúa cỏ, bệnh lúa lùn xoắn, bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam [15] Hiện nay, virus gây bệnh vàng lụi lúa (Rice yellow stunt virus – RYSV) đang gây hại tại Bắc giang và đang có nguy cơ thành dịch [14] Các nghiên cứu về virus ở Việt Nam hiện mới tập trung ở khâu phát hiện sau đó áp dụng các biện pháp canh tác nhƣ nhổ bỏ cây bệnh, di t... nƣớc trồng lúa châu Á Tuy nhiên có 5 bệnh virus gây hại nghiệm trọng và phổ biến nhất là: bệnh vàng lùn (bệnh lúa cỏ), bệnh lúa lùn xoắn lá, bệnh Tungro, bệnh lúa sần lùn, bệnh vàng lá tạm thời.[17,24,26,23,34] 1.1.2 Tình hình nghiên cứu virus hại lúa ở Việt Nam Việt Nam hiện có 12/16 loại vius gây hại trên lúa, các bệnh do vius gây ra thành các đợt dịch thƣờng nối tiếp nhau ở các vùng trồng lúa khác... cũng xác định đƣợc môi giới truyền bệnh là rầy lƣng trắng giống nhƣ nghiên cứu của các tác giả Trung Quốc Dựa vào các nghiên cứu trên, Bộ NN & PTNT thống nhất gọi lại tên bệnh tại Việt Nam là bệnh lùn sọc đen (LSĐ) và virus gây bệnh là virus lùn sọc đen phƣơng Nam (SRBSDV) 1.2.4.2 Các nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đoán virus SRBSDV Năm 2010, Viện Bảo vệ Thực vật đã nghiên cứu phát triển quy trình... 13] Các nghiên cứu về quan hệ giữa virus vàng lùn và lùn xoăn lá với rầy nâu, các loại rầy (rầy nâu, rầy nâu nhỏ và rầy lƣng trắng) và biện pháp phòng trừ môi giới truyền bệnh và bệnh virus hại lúa cũng đã đƣợc nghiên cứu khá đầy đủ và bài bản tại Viện Bảo vệ thực vật [7] Các nghiên cứu về virus hại lúa tại Viện Di truyền Nông Nghiệp và Viện Công nghệ Sinh học lại tập trung vào các nghiên cứu phân. .. sinh bệnh lùn sọc đen phương Nam Từ năm 2001, một bệnh lúa lùn mới đã xuất hiện trên lúa (Oryza sativa) tại một số vùng thuộc tỉnh Quảng Đông và Hải Nam, phía Nam Trung Quốc Cây lúa nhiễm bệnh thấp lùn, lá xanh đậm, ở mặt sau lá và các đốt thân xuất hiện các nốt sần nhỏ Ban đầu, virus gây bệnh chỉ đƣợc coi nhƣ là một biến chủng của virus lùn sọc đen Mãi tới gần đây, dựa vào các kết quả nghiên cứu về... bệnh lùn sọc đen đã tạm thời lắng xuống, chỉ còn rải rác ở một vài tỉnh thành Tuy nhiên, bệnh vẫn chƣa đƣợc phòng trị hoàn toàn, có nhiều khả năng tái bùng phát thành dịch 1.2.2 Đặc điểm bệnh học của bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam 1.2.2.1.Dấu hiệu nhận biết Biểu hiện bệnh của cây lúa nhiễm virus SRBSDV rất giống với biểu hiện của bệnh lùn sọc đen do virus RBSDV gây ra Triệu chứng chung của lúa nhiễm bệnh. .. không ổn định và gây tình trạng mất an ninh lƣơng thực Trong số các tác nhân gây bệnh trên lúa, virus là mầm bệnh nguy hiểm nhất do khả năng phát tán rất rộng, đồng thời rất khó kiểm soát Ở Việt Nam, virus gây ra một số bệnh rất nguy hiểm, ảnh hƣởng nghiêm trọng tới sản lƣợng lúa nhƣ bệnh vàng lùn, bệnh lùn xoắn lá, bệnh lùn sọc đen Trong các năm từ 2009 đến 2010, dịch bệnh lúa lùn sọc đen lần đầu tiên... S7 trong plasmid tái tổ hơ ̣p bằng cách xử lí với enzyme cắt giới hạn EcoRI 49 3.8 Giải trình tự phân đoạn S7 của SRBSDV .50 3.9 Phân tích đa dạng di truyền phân đoạn S7 của các mẫu SRBSDV 52 3.9.1 So sánh trình tự phân đoạn S7 của các mẫu SRBSDV Việt Nam với các mẫu SRBSDV trên thế giới .52 3.9.2 Phân tích đặc điểm di truyền 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN... cả các phân tử RNA đều đƣợc lắp ráp trong cùng một phân tử virus hình cầu Họ Reoviridae là một họ đa dạng về ký chủ Trong số 12 chi của họ, có tới 8 chi hại ngƣời và động vật, một chi hại nấm và 3 chi gây hại thực vật là (1) Phytoreovirus (ví dụ virus lúa lùn RDV (Rice dwarf virus) ), (2) Oryzavirus (ví dụ virus lúa lùn xoắn lá RRSV (Rice ragged stunt virus) , (3) Fijivirus (ví dụ virus lúa lùn sọc đen . KHOA HỌC TỰ NHIÊN Lại Phƣơng Liên NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN PHÂN ĐOẠN S7 CỦA CÁC CHỦNG VIRUS GÂY BỆNH LÚA LÙN SỌC ĐEN Chuyên ngành: Di truyn hc Mã s: 60420121 LUC. ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Lại Phƣơng Liên NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN PHÂN ĐOẠN S7 CỦA CÁC CHỦNG VIRUS GÂY BỆNH LÚA LÙN SỌC ĐEN LUC Hà Ni. trong nghiên c dng di truyn và s tin hóa ca virus. Da vào thc t trên, chúng tôi tin hành thc hi Nghiên cứu đa dạng di truyền phân đoạn S7 của các chủng virus gây
Ngày đăng: 08/01/2015, 08:32
Xem thêm: nghiên cứu đa dạng di truyền phân đoạn s7 của các chủng virus gây bệnh lúa lùn sọc đen, nghiên cứu đa dạng di truyền phân đoạn s7 của các chủng virus gây bệnh lúa lùn sọc đen