ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Phạm Thu Thùy BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KHÁNG THỂ KHÁNG CD20 VÀ THỬ NGHIỆM ĐỂ PHÁT HIỆN CD20 TRONG HUYẾT THANH CỦA BỆNH NHÂN UNG THƢ LYMPHO KHÔNG HODGKIN LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Phạm Thu Thùy BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KHÁNG THỂ KHÁNG CD20 VÀ THỬ NGHIỆM ĐỂ PHÁT HIỆN CD20 TRONG HUYẾT THANH CỦA BỆNH NHÂN UNG THƢ LYMPHO KHÔNG HODGKIN LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 01 21 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS. TS. Trần Minh Đạo 2. PGS. TS. Lê Quang Huấn Hà Nội – 2014 i Lời cam đoan Tôi xin cam đoan: Luận án là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân, đƣợc thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn khoa học của PGS. TS. Trần Minh Đạo và PGS. TS. Lê Quang Huấn. Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình. Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Nghiên cứu sinh Phạm Thu Thùy ii Lời cảm ơn Trƣớc hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới: PGS. TS. Trần Minh Đạo – Giám đốc bệnh viện 198 – Bộ Công an và PGS. TS. Lê Quang Huấn – Trƣởng phòng Công nghệ Tế bào Động vật – Viện Công nghệ Sinh học – Viện Khoa học Việt Nam đã tận tình hƣớng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu để hoàn thành luận án tiến sĩ. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.T.S. Nguyễn Thị Hồng Vân – Trƣởng bộ môn Di truyền học, các thầy cô giáo Bộ môn Di truyền học và Khoa Sinh học – Trƣờng đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội đã chỉ bảo tận tình và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới T.S. Lã Thị Huyền, các cô chú, anh chị và các bạn công tác tại phòng Công nghệ Tế bào Động vật – Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam. Tôi xin chân thành cảm ơn các cô chú, anh chị và các bạn đồng nghiệp Khoa Vi sinh – Bệnh viện 198 đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa giải phẫu bệnh – Học viện quân y, Trung tâm Ung bƣớu - Bệnh viện 198 và Viện chăn nuôi đã cung cấp mẫu thí nghiệm cho tôi. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và tất cả những ngƣời thân, bạn bè đã giúp đỡ tôi trong thời gian qua. Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Nghiên cứu sinh Phạm Thu Thùy iii Mục lục Trang phụ bìa Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt vii Danh mục các bảng, biểu ix Danh mục các hình x MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. UNG THƢ MÁU 3 1.1.1. Đại cƣơng ung thƣ máu 3 1.1.2. Tình hình ung thƣ máu trên thế giới và Việt Nam 5 1.1.3. Các phƣơng pháp chẩn đoán và điều trị ung thƣ máu 7 1.1.4. Bệnh ung thƣ lympho không Hodgkin (Non-Hodgkin lymphoma) 8 1.2. KHÁNG NGUYÊN CD20 11 1.2.1. Cấu trúc gen và protein CD20 11 1.2.2. Chức năng của CD20 trong cơ thể 12 1.2.3. Kháng nguyên CD20 – mục tiêu phân tử trong điều trị ung thƣ và ung thƣ máu 14 1.2.4. Tình hình nghiên cứu kháng nguyên CD20 tái tổ hợp 16 1.3. KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG (mAb), KHÁNG THỂ SCFV VÀ KHÁNG THỂ PHAGE-SCFV 17 1.3.1. Kháng thể 17 1.3.2. Kháng thể đơn dòng (mAb) 18 1.3.3. Kháng thể đơn chuỗi (kháng thể scFv) 20 1.3.4. Kháng thể phage-scFv 22 1.3.5. Ứng dụng mAb trong chẩn đoán bệnh ung thƣ máu 25 1.3.6. Tình hình nghiên cứu và sản xuất mAb đặc hiệu kháng nguyên iv CD trên thế giới 27 1.4. KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN CD20 28 1.4.1. Cơ chế hoạt động của kháng thể đặc hiệu CD20 28 1.4.2. Một số mAb đặc hiệu CD20 đang đƣợc sử dụng trong điều trị 32 1.4.3. Tình hình nghiên cứu mAb đặc hiệu CD20 hiện nay 36 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.1. VẬT LIỆU 39 2.1.1. Sinh phẩm 39 2.1.2. Mồi 39 2.1.3. Hóa chất và trang thiết bị 40 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41 2.2.1. Các phƣơng pháp thao tác với DNA VÀ RNA 41 2.2.1.1. Tách chiết RNA từ máu của bệnh nhân và tủy gà đã gây miễn dịch 42 2.2.1.2. RT-PCR nhân bản gen mã hóa kháng nguyên CD20 và kháng thể scFv đặc hiệu CD20 42 2.2.1.3. Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pCR2.1 43 2.2.1.4. Biến nạp plasmid vào tế bào E. coli 44 2.2.1.5. Tách DNA plasmid từ vi khuẩn E. coli 45 2.2.1.6. Tạo vector tái tổ hợp chứa đoạn gen CD20 45 2.2.1.7. Tách dòng gen antiCD20Fa mã hóa kháng thể scFv-C H 2 46 2.2.1.8. Điện di gel agarose 46 2.2.1.9. Thu đoạn DNA từ gel agarose 47 2.2.1.10. Tinh sạch DNA và cắt, gắn DNA 47 2.2.1.11. Phƣơng pháp nhân gen bằng PCR 48 2.2.1.12. Xác định trình tự nucleotide 49 2.2.2. Các phƣơng pháp thao tác với protein tái tổ hợp 49 2.2.2.1. Biểu hiện gen trong tế bào E. coli 49 2.2.2.2. Tinh sạch protein tái tổ hợp 50 2.2.2.3. Điện di protein 51 2.2.3. Kĩ thuật Western blot và Dot blot 51 v 2.2.4. Gây miễn dịch gà bằng kháng nguyên CD20 52 2.2.5. Kĩ thuật phage display 53 2.2.5.1. Tạo kháng thể phage-scFv từ thƣ viện Griffin.1 53 2.2.5.2. Sàng lọc kháng thể phage-scFv đặc hiệu kháng nguyên đích 53 2.2.6. ELISA 54 2.2.7. Xác định khả năng liên kết của kháng thể scFv-C H 2 với CD20 54 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 57 3.1. TẠO KHÁNG NGUYÊN CD20 TÁI TỔ HỢP 57 3.1.1. Tách chiết RNA tổng số từ máu bệnh nhân ung thƣ lympho không Hodgkin 57 3.1.2. Nhân bản các gen mã hoá CD20 58 3.1.3. Tách dòng gen mã hoá CD20 58 3.1.4. Xác định trình tự gen mã hóa CD20 59 3.1.5. Thiết kế vector biểu hiện kháng nguyên CD20 60 3.1.6. Biểu hiện, tinh sạch và xác định hoạt tính của CD20 61 3.2. KẾT QUẢ GÂY MIỄN DỊCH GÀ BẰNG CD20 TẠO RA 64 3.3. THU NHẬN GEN MÃ HÓA scFv KHÁNG CD20 TỪ GÀ 65 3.3.1. Tạo gen tái tổ hợp mã hóa cho scFv từ gà gây miễn dịch 65 3.3.2. Tạo phage biểu lộ scFv và sàng lọc các scFv có khả năng gắn đặc hiệu với kháng nguyên đích 68 3.4. TẠO KHÁNG THỂ scFv KHÁNG CD20 69 3.4.1. Tách dòng gen antiCD20 mã hóa scFv 69 3.4.2. Thiết kế vector biểu hiện pET22b(+)/antiCD20 69 3.4.3. Tối ƣu một số điều kiện biểu hiện scFv 71 3.4.4. Tinh sạch kháng thể scFv đặc hiệu CD20 76 3.4.5. Khả năng liên kết của scFv với kháng thể cộng hợp 78 3.4.6. Độ ổn định của scFv tinh sạch 79 3.5. TẠO KHÁNG THỂ scFv-C H 2 KHÁNG CD20 81 3.5.1. Tách dòng gen antiCD20Fa mã hóa scFv-C H 2 81 3.5.2. Sàng lọc hệ vector biểu hiện scFv-C H 2 82 3.5.2.1. Nhân dòng các vector biểu hiện scFv-C H 2 82 vi 3.5.2.2. Biểu hiện kháng thể scFv-C H 2 trong hệ vector 83 3.5.2.3. Chọn vector biểu hiện scFv-C H 2 84 3.5.3. Tối ƣu một số điều kiện biểu hiện scFv-C H 2 85 3.5.4. Tinh sạch kháng thể scFv-C H 2 88 3.5.5. Độ ổn định của scFv-C H 2 tinh sạch 91 3.5.6. Khả năng liên kết của scFv-C H 2 với CD20 91 3.6. THỬ NGHIỆM scFv-C H 2 PHÁT HIỆN CD20 TRONG HUYẾT THANH BỆNH NHÂN NHL 93 3.6.1. Phát hiện CD20 trong huyết thanh bệnh nhân bằng Western blot 93 3.6.2. Phát hiện CD20 trong huyết thanh bệnh nhân bằng ELISA 95 3.6.2.1. Lựa chọn độ pha loãng huyết thanh 95 3.6.2.2. Thử nghiệm scFv-C H 2 phát hiện CD20 trong huyết thanh bệnh nhân bằng ELISA 96 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 100 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ 101 TÀI LIỆU THAM KHẢO 102 PHỤ LỤC vii Danh mục các kí hiệu, các từ viết tắt ADCC Antibody dependent cellular cytotoxicity Gây độc tế bào phụ thuộc kháng thể ADC Antibody drug conjugate Kháng thể mang thuốc AIDS acquired immune deficiency syndrome Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ALL Acute Lymphocytic Leukemia Ung thƣ tế bào lympho cấp tính AML Acute Myelogenous Leukemia Ung thƣ bạch cầu dòng tủy cấp tính CD Cluster of differenciation Cụm biệt hóa CDC Complement dependent cytotoxicity Gây độc tế bào phụ thuộc bổ thể cDNA Complementary Deoxyribonucleic acid ADN bổ sung CDR Complementarity determining region Vùng quyết định bổ trợ CLL Chronic Lymphocytic Leukemia Ung thƣ tế bào lympho mạn tính CML Chronic Myelogenous Leukemia Ung thƣ bạch cầu dòng tủy mạn tính CR Complete remission Đáp ứng hoàn toàn DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Kỹ thuật miễn dịch liên kết enzyme FDA Food and Drug Administration Cục Quản lý thuốc và thực phẩm HAMA Human against mouse allergic Hiện tƣợng mAb có nguồn gốc [...]... đề tài: Biểu hiện gen mã hoá kháng thể 1 kháng CD20 và thử nghiệm để phát hiện CD20 trong huyết thanh của bệnh nhân ung thư lympho không Hodgkin Mục tiêu của luận án 1 Tạo đƣợc kháng thể dạng đơn chuỗi (scFv-CH2) có khả năng nhận biết, gắn kết đặc hiệu với kháng nguyên CD20 2 Thử nghiệm kháng thể tạo ra (scFv-CH2) phát hiện CD20 trong huyết thanh bệnh nhân ung thƣ lympho không Hodgkin Nội dung đề tài... kháng nguyên CD20 tái tổ hợp 2 Gây miễn dịch gà bằng kháng nguyên CD20 tạo ra 3 Thu nhận gen mã hóa kháng thể scFv từ gà gây miễn dịch 4 Tạo kháng thể scFv kháng CD20 5 Tạo kháng thể scFv-CH2 kháng CD20 6 Thử nghiệm kháng thể scFv-CH2 phát hiện CD20 trong huyết thanh bệnh nhân ung thƣ lympho không Hodgkin Ý nghĩa của luận án  Lí luận: Góp phần hoàn thiện qui trình tạo kháng thể tái tổ hợp, kháng thể. .. do bệnh ung thƣ lympho không Hodgkin [49] Trong số các bệnh nhân ung thƣ lympho không Hodgkin, 85% ngƣời mắc bệnh có nguồn gốc từ tế bào lympho B và biểu hiện các chỉ thị kháng nguyên bề mặt tế bào B CD20 là chỉ thị phân tử biểu hiện chủ yếu trên tế bào B và xuất hiện khoảng 85 – 90% ở bệnh nhân NHL [52], [79], [82] CD20 không biểu hiện trong các tế bào gốc tạo máu, không dễ dàng bị đồng hóa và không. .. định sự có mặt của CD20 trong máu, huyết tƣơng và huyết thanh bệnh nhân Ở bệnh nhân ung thƣ tế bào lympho mạn tính, Manshouri và cộng sự đã xác định đƣợc CD20 có trong huyết tƣơng với nồng độ cao (từ 52,89 đến 15740 nM) [88], Alatrash và cộng sự cũng xác định CD20 trong máu ngoại biên trung bình là 257 nmol/l [15] Ở bệnh nhân ung thƣ lympho không Hodgkin và ung thƣ lympho Hodgkin, Giles và cộng sự đã... chúng tôi thử nghiệm kháng thể tạo ra để phát hiện CD20 trong huyết thanh bệnh nhân ung thƣ lympho không Hodgkin 1.2.4 Tình hình nghiên cứu kháng nguyên CD20 tái tổ hợp Kháng nguyên CD là những protein màng biểu hiện chủ yếu trên các tế bào miễn dịch (tế bào lympho) Một số lƣợng nhỏ CD đƣợc biểu hiện trên các tế bào nội mô, hồng cầu và tế bào gốc Köhler và Milstein đã chứng minh mô hình của kháng nguyên... Dot blot của kháng thể scFv đặc hiệu CD20 78 Hình 3.26 Hình ảnh Western blot của kháng thể scFv đặc hiệu CD20 79 Hình 3.27 Biểu đồ xác định hàm lƣợng kháng thể scFv bảo quản ở các thời gian và nhiệt độ khác nhau Hình 3.28 80 Ảnh điện di sản phẩm PCR gen mã hóa CH2 và kháng thể scFv 81 (A) và nối gen mã hóa scFv và CH2 (B) Hình 3.29 Ảnh điện di sản phẩm PCR gen antiCD20Fa gắn vào các vector biểu hiện 83... tử CD20 có chiều dài đầy đủ gắn vào vector biểu hiện sau đó biến nạp vào tế bào động vật và biểu hiện trên bề mặt tế bào này để nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của CD20 [26] Vùng ngoại bào của phân tử CD20 đƣợc biểu hiện trên bề mặt phage M13K07 và phage tái tổ hợp đƣợc sử dụng để gây miễn dịch ở động vật [130] Ngoài ra, gen mã hóa cho vùng ngoại bào của CD20 gắn vào vector biểu hiện pET32a(+) và. .. của Van Oers và cộng sự (85,1%) [120], nhƣng lại cao hơn nghiên cứu của Lê Thanh Tú (71%) [12] 1.2 KHÁNG NGUYÊN CD20 1.2.1 Cấu trúc gen và protein CD20 Một số kháng thể đơn dòng kháng CD20 đã thành công trong điều trị bệnh ung thƣ máu dạng ung thƣ lympho không Hodgkin [25], [35], [43] Tuy nhiên, chúng ta biết rất ít về mặt sinh học của CD20 và sự hiểu biết về phân tử này chủ yếu dựa trên cấu trúc gen. .. trình biểu hiện của CD20 13 Hình 1.4 Sự chuyển vị trí của CD20 vào “mảng” lipid sau khi gắn kháng thể 13 Hình 1.5 Sơ đồ cấu tạo của kháng thể 18 Hình 1.6 Sự biệt hóa và sinh kháng thể của lympho B 19 Hình 1.7 Sơ đồ cấu tạo của mảnh kháng thể đơn chuỗi (scFv) 20 Hình 1.8 Một số cấu trúc gắn đặc hiệu kháng nguyên 21 Hình 1.9 Cấu trúc của phage mang gen mã hóa scFv 24 Hình 1.10 Cơ chế hoạt động của rituximab... nguy cơ bị hiện tƣợng HAMA và 1 kháng thể Obinutuzumab có nguồn gốc từ ngƣời đƣợc FDA phê chuẩn tháng 11 năm 2013 [78] và ở Việt Nam cũng mới dừng lại ở việc ứng dụng các kháng thể này trong chẩn đoán và điều trị bệnh Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn và góp phần vào việc nghiên cứu tạo kháng thể mới hiệu quả trong chẩn đoán và điều trị ung thƣ máu dạng ung thƣ lympho không Hodgkin, chúng tôi thực hiện đề . Biểu hiện gen mã hoá kháng thể 2 kháng CD20 và thử nghiệm để phát hiện CD20 trong huyết thanh của bệnh nhân ung thư lympho không Hodgkin . Mục tiêu của luận án 1. Tạo đƣợc kháng thể. Phạm Thu Thùy BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KHÁNG THỂ KHÁNG CD20 VÀ THỬ NGHIỆM ĐỂ PHÁT HIỆN CD20 TRONG HUYẾT THANH CỦA BỆNH NHÂN UNG THƢ LYMPHO KHÔNG HODGKIN LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH. Phạm Thu Thùy BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KHÁNG THỂ KHÁNG CD20 VÀ THỬ NGHIỆM ĐỂ PHÁT HIỆN CD20 TRONG HUYẾT THANH CỦA BỆNH NHÂN UNG THƢ LYMPHO KHÔNG HODGKIN LUẬN ÁN TIẾN