ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HOÀNG ĐĂNG HIẾU SỬ DỤNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG PHÂN TÍCH ĐA DẠNG VÀ ĐỊNH DANH LOÀI CỦA TẬP ĐOÀN CÂY DÓ BẦU(AQUILARIA SP.) TẠI HÀ TĨNH LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HOÀNG ĐĂNG HIẾU SỬ DỤNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG PHÂN TÍCH ĐA DẠNG VÀ ĐỊNH DANH LOÀI CỦA TẬP ĐOÀN CÂY DÓ BẦU(AQUILARIA SP.) TẠI HÀ TĨNH Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60 42 70 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. CHU HOÀNG HÀ Hà Nội - 2012 Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu ii MỤC LỤC Trang M U 1 U 2 1.1. Tng quan v u 2   cu 2 n c u 3  kinh t u 5 1.1.4. Thc trng trn th gii 7  ng ti kh o tro 9 1.2. Mt s  dng trong vinh danh nh quan h di truyn 10 1.3. DNA barcode - m mi 12 1.3.1. Gii thiu DNA barcode 12 n c barcode 13 1.4. Mt s c s d thc vt 14   14  15 1.4.3. T gen luc lp 15  gen rbcL 17  gen matK 17  gen rpoB rpoC1 17  gen ycf5 18  hai gen trnH - psbA 18  hai gen trnL(UAA) - trnF(GAA) 19 u DNA barcode  thc vt 19 1.6. Mt s kt qu u v du ti Vi gii . 21 T LI 22 2.1.Vt liu 22 2.1.1. Thc vt 22 2.1.2. Chng vi khun 23 Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu iii t 23 t b 23 p mi s du 24 u 24 u 24 u 24 T QU O LUN 33 3.1. Kt qu ch DNA tng s 33 3.2.  gn mu ca phn ng PCR 34 3.3. Kt qu n gen vp mu 36 3.3.1. Kt qu n gen rbcL 36 3.3.2. Kt qu n gen rpoB 36 3.3.3 Kt qu n gen psbA-trnH 37 3.3.4. Kt qu n gen ITS 38 3.4. Kt qu  38 3.4.1 Kt qu tinh sch sn ph 38 3.4.2. Kt qu chuy 39 3.4.3. Kt qu bin n  bin E.coli 39 3.4.4 Kt qu chn l  hp 40 3.4.5. Kt qu t  hp 41 3.4.6. Kt qu ct ki hp 42  nucleotide cn DNA ch th 43 3.5.1. Kt qu  gen trn-psbA 44 3.5.2. Kt qu  gen rpoB 46 3.5.3. Kt qu   c lp rbcL 48 3.5.4. Kt qu  gen ITS 52 KT LUN NGH 58 U THAM KHO 59 Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu iv DANH MỤC BẢNG Trang Ba mt s mi DNA Barcode thit k cho h gen lc lp 16 B u 22 B p mn gen barcode 24 Bn dung dm ra 25 Bn dung d 25 Bn phn ng PCR 26 Bng 2.6. Chu k phn ng PCR 26 Bn phn ng ligase 28 Bng chn lc t  hp 29 Bng 2.9. n phn ng PCR kim tra khun lc 30 Bng 2.10. Chu k phn ng PCR- clony 30 B 30 Bn ng ct enzyme 31 Bng 3.1. Nhi bt mc gen cp mu 34 B vùng trnH-psbA intergenic lc lp 45 B c lp rpoB 47 Bng 3.4.  c lp rbcL 50 Bng 3.5. V   i crbcL 51 B ITS 54 B  i cITS 55 Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu v DANH MỤC HÌNH Trang u 2  u 5  vector pBT 27 t qu n di DNA tng s ca mt s mu 33 . Kt qu chy PCR - gradient ca ch th rpoB  ng nhi t 49 o C ti 58 o C 35   t qu n di sn phm PCR gen rbcLc    u u 36   t qu n di sn phm PCR gen rpoB c    u u 37 t qu n di sn phm PCR gen psbA-trnH c cu 37   t qu n di sn phm PCR gen ITS c    u u 38 t qu tinh sch sn phm PCR gen rpoB 39 t qu bin n h  bin 40 t qu n di sn phm PCR - clony khun lc mi rbcL 41 t qu t 42 t qu n di sn phm ct bng enzyme BamHI mi rbcL. 43 i git qu mi ITS 56 Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu vi BẢNG CHỮ VIẾT TẮT bp Base pair CBOL Consortium for the Barcode of Life CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate E. coli Escherichia coli EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid IPTG Isopropylthio-beta-D-galactoside ITS-rDNA Internal Transcribed Spacer-rDNA Kb Kilobase LB Luria Bertani PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic acid rDNA Ribosome deoxyribonucleic acid RAPD Random Amplyfied Polymorphism DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism Rnase Ribonuclease SDS Sodium dodecyl sulphate Sol Solution STS Sequence-Tagged Site TAE Tris - Acetic acid - EDTA Taq polymerase Thermus aquaticus polymerase TE Tris - Ethylenediaminetetraacetic acid X-gal X - 5 - brom - 4 - chloro3 - indolyl - - D - galactosidase Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu 1 MỞ ĐẦU (Aquilaria sp)                              A. crassna       A. baillonii  A. rugosa   A. malaccensis  A. sinensis A. banaensis  A. crassna                   “Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích đa dạng và định danh loài ở tập đoàn cây dó bầu (Aquilaria sp.) tại Hà Tĩnh.” Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu 2 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về cây dó bầu 1.1.1. Đặc điểm phân loại và vị trí phân bố của cây dó bầu d(Aquilaria sp.)               Aquilaria Thymeleaceae,   u Aquilaria       Aquilaria crassna; A. baillonii; A. sinensis hoặc A. chinesis; A. borneensis; A. Malaccensi; A. gollocha; A. hirta; A. rostrata; A. beccariana; A. cummingiana; A. filaria; A. khasiana; A. microcarpa; A. grandiflora; A. bancana; A. Rugosa.    A. rugosa         Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu 3    Aquilaria crassna   1.1.2. Đặc điểm sinh trưởng của cây dó bầu -  60 -    -  - 15 x 2,5 -    -   -   -    -  - - 10 [3], [43].  -      [...]... dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại Các phƣơng pháp phân loại học phân tử và xác định loài là hƣớng nghiên cứu đƣợc phát triển mạnh trên thế giới hiện nay, đƣợc xây dựng dựa trên việc nhận 10 Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu biết thành phần và cấu trúc của các gen đặc hữu của các taxon sinh vật Hiện nay, các kỹ thuật dựa trên phân tích DNA là phƣơng pháp có hiệu quả cao trong việc định. .. giống, các chỉ tiêu về lâm sinh đối với cây dó trồng, sự tƣơng thích giữa các cây trồng xen, bệnh của cây [43] Trong đó, dựa trên cơ chế hình thành trầm trong tự nhiên, hiện nay về cơ bản có 3 kỹ thuật cấy tạo trầm nhân tạo đƣợc các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu: Phƣơng pháp vật lý (gây vết thƣơng cơ giới); Phƣơng pháp hóa học (xúc tác hóa chất); Phƣơng pháp sinh học (xử lý với men vi sinh) Một số cách... năm 1993 (Arnon, 1993), trong một bài báo mà không nhận đƣợc sự chú ý nhiều từ cộng đồng khoa học, và gần đây thuật ngữ này đƣợc sử dụng lại trong nhiều nghiên cứu Về cơ bản, kỹ thuật này dựa vào việc sử dụng một khu vực DNA (4 00-800 bp) nhƣ là một tiêu chuẩn để nhận dạng các loài một cách nhanh chóng và chính xác Kỹ thuật DNA mã vạch giúp các nhà phân loại học trong công tác phân loại và xác định loài,... giá đa dạng sinh học của các khu vực này nhằm bảo vệ các loài đặc hữu quý hiếm và nguy cấp Tuy nhiên cần lƣu ý rằng DNA barcode không thể thay thế phân loại nhƣng nó là công cụ hữu ích để tạo ra thông tin về đơn vị phân loại chƣa biết Hiện nay, trên thế giới, kỹ thuật này đang đƣợc sử dụng chủ yếu bởi các nhà phân loại học và nhiều nhà khoa học ở các lĩnh vực khác nhƣ khảo cổ học, công nghiệp sinh học. .. sp Hà Tĩnh 5 T1 Aquiaria sp Hà Tĩnh 6 T2 Aquiaria sp Hã Tĩnh 7 T3 Aquiaria sp Hà Tĩnh 8 T4 Aquiaria sp Hà Tĩnh 9 T6 Aquiaria sp Hà Tĩnh 10 T7 Aquiaria sp Hà Tĩnh 11 T8 Aquiaria sp Hà Tình 12 T9 Aquiaria sp Hà Tĩnh 13 T 10 Aquiaria sp Hà Tĩnh 14 T 11 Aquiaria sp Hà Tĩnh 15 T 14 Aquiaria sp Hà Tĩnh 16 PQ64 Aquiaria sp Phú Quốc 17 Qx Aquiaria sp Phú Quốc 18 M1 Aquiaria sp Phú quốc 22 Luận văn thạc sĩ Sinh. .. thƣờng đƣợc sử dụng bao gồm: kỹ thuật isozym ( ồng enzyme), các kỹ thuật phân tích so sánh trình tự nucleotide các đoạn DNA nhƣ phƣơng pháp đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP), các kỹ thuật trên cơ sở phản ứng PCR nhƣ SSR (Simple Sequence Repeats), đa hình các đoạn DNA nhân bản ngẫu nhiên - RAPD ( Random Amplified Polymorphic DNA) [17], [24], đa hình... trạng nào đó của các cá thể, loài hay các nhóm loài Gần đây, việc sử dụng các DNA mã vạch (DNA barcode) để định danh loài đang đƣợc các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu và có những đóng góp đáng kể trong việc phân loại loài Để nhận dạng gen hay đánh giá mức độ tiến hoá loài thì các nhóm gen chính thƣờng đƣợc sử dụng là gen ribosome rRNA, gen ty thể, và gen lục lạp (thực vật) trong đó gen... năng lực kiểm soát, hiểu biết và tận dụng sự đa dạng sinh học Ngoài ra, kỹ thuật này có triển vọng nghiên cứu và ứng dụng trong khoa học cuộc sống, trong khoa học pháp y, y tế, nghiên cứu y dƣợc, sản xuất và kiểm soát chất lƣợng thực phẩm Phƣơng pháp này vô cùng có ý nghĩa trong các trƣờng hợp các mẫu vật sinh học cần giám định loài đã đƣợc qua xử lý, chế biến nhƣ các dạng chế phẩm thuốc hay thực phẩm... những thành công ban đầu trong các nghiên cứu tạo trầm trên cây dó bầu mà hiện nay, các dự án trồng cây dó bầu đã và đang thu hút sự quan tâm của các địa phƣơng trên cả nƣớc Việc nhân giống cây dó bầu và sản xuất trầm bền vững là một vấn đề cần thiết về mặt kinh tế và xã hội nhằm đem lại nguồn lợi lớn từ trầm hƣơng đồng thời góp phần bảo vệ môi trƣờng và ngăn ngừa tình trạng khai thác cây dó bầu trong. .. hệ cũng nhƣ phân loại đánh giá các loài thực vật Hiệu quả kết hợp giữa hai gen này thích hợp cho các nghiên cứu nhƣ là điều tra tƣơng tác thực vật động vật, xác định các loài cây đƣợc bảo vệ, các cuộc khảo sát đa dạng sinh học quy mô lớn và phân biệt cây giống trong các chƣơng trình tái sinh rừng phân biệt và cho mục đích xác định loài và phân loại [36] Spooner sau khi xem xét hiệu quả của psbA - trnH, .   Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích đa dạng và định danh loài ở tập đoàn cây dó bầu (Aquilaria sp. ) tại Hà Tĩnh. ” Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu. HIẾU SỬ DỤNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG PHÂN TÍCH ĐA DẠNG VÀ ĐỊNH DANH LOÀI CỦA TẬP ĐOÀN CÂY DÓ BẦU (AQUILARIA SP. ) TẠI HÀ TĨNH Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60 42 70. HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HOÀNG ĐĂNG HIẾU SỬ DỤNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG PHÂN TÍCH ĐA DẠNG VÀ ĐỊNH DANH LOÀI CỦA TẬP ĐOÀN CÂY DÓ BẦU(AQUILARIA