Đang tải... (xem toàn văn)
ĐẶT VẤN ĐỀ Giống Klebsiella là một trong các hệ vi khuẩn có ở đường tiêu hóa, hô hấp của người, là căn nguyên của một số bệnh nhiễm khuẩn ở người, gây bệnh chủ yếu ở trẻ nhỏ. Trên thế giới loài Klebsiella là một trong những căn nguyên quan trọng gây nhiễm khuẩn ở bệnh nhi nằm điều trị tại bệnh viện đặc biệt là những trẻ sơ sinh non yếu và trẻ nhỏ. Tỷ lệ nhiễm khuẩn do Klebsiella ở trong bệnh viện đặc biệt là những đơn vị hồi sức cấp cứu rất khác nhau giữa các nước từ 10,2%26,2% . Tình trạng kháng với hầu hết các kháng sinh đang là một mối đe doạ lớn đối với thầy thuốc và người bệnh. Với kháng sinh thông thường như Ampicillin, Cephazolin, Klebsiella spp. đã kháng cao 60%100%. Phát hiện gen kháng kháng sinh nhóm quinolon lan truyền qua plasmid là mốc quan trọng trong nghiên cứu về gen kháng kháng sinh của vi khuẩn này. Nghiên cứu về cơ chế kháng kháng sinh được tiến hành với mục đích tìm căn nguyên của sự gia tăng tính kháng kháng sinh của Klesiella, trong đó cơ chế kháng cephalosporin thế hệ 3 và quinolon được nghiên cứu ở nhiều nước. Ở Việt Nam, Klebsiella là căn nguyên hàng đầu gây nhiễm khuẩn hô hấp phân lập được chủ yếu ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ nằm điều trị tại bệnh viện. Tỷ lệ Klebsiella spp kháng và đa kháng kháng sinh cao với ampicillin và cephalotin kháng 97,8% và 91,7% ở trẻ em. Những nghiên cứu tìm hiểu về tình trạng mang gen mã hóa sinh men βlactamase phổ rộng gây kháng cephalosporin thế hệ 3 và quinolon lan truyền qua plasmid chưa được thực hiện nhiều ở Việt Nam. Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài này nhằm mục tiêu: 1 Xác định tỷ lệ chủng Klebsiella phân lập được ở đường hô hấp của các bệnh nhi từ 0 đến 6 tuổi tại Bệnh viện Nhi Trung ương năm 20092010. 2 Xác định tính kháng kháng sinh của các chủng Klebsiella phân lập được. 3 Xác định tỷ lệ mang gen kháng cephalosporin thế hệ 3 và quinolon của các chủng Klebsiella phân lập được. Những đóng góp mới của luận án: Nghiên cứu đầu tiên được tiến hành trên đối tượng bệnh nhi từ 06 tuổi, đã phát hiện được cơ chế kháng kháng sinh của Klesiella, trong đó xác định được gen kháng cephalosporin thế hệ 3 và quinolon của các chủng Klebsiella phân lập được tại Bệnh viện Nhi Trung ương.
1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG - BÙI THỊ MÙI TỶ LỆ NHIỄM VÀ MANG GEN KHÁNG CEPHALOSPORIN THẾ HỆ VÀ QUINOLON CỦA CÁC CHỦNG KLEBSIELLA GÂY NHIỄM KHUẨN HÔ HẤP PHÂN LẬP TẠI BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƯƠNG, 2009-2010 Chuyên ngành: Vi sinh y học Mã số: 62.72.01.15 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC HÀ NỘI - 2014 CƠNG TRÌNH ĐÃ ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG Người hướng dẫn khoa học: GS TS Nguyễn Thanh Liêm TS Lê Thị Ánh Hồng Phản biện Phản biện Phản biện Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp viện Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương vào hồi ., ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Thư viện Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADN : Acid Deoxyribo nucleic ARN : Acid ribonucleic C3G : Cephalosporin hệ ESBL : Extended Spectrum Beta Lactamases(Men betalactamase phổ rộng) HH : hô hấp HSCC : Hồi sức cấp cứu HSN : Hồi sức ngoại MIC : Minimal Inhibitory concentration(nồng độ ức chế tối thiểu) PCR : polymerase chain reaction( phản ứng chuỗi trùng hợp) PFGE : pulsed field Get Eleetrophoness( điện di ung trường) NKHHCT : nhiễm khuẩn hơ hấp cấp tính WHO : world heath organization(tổ chức y tế giới) ĐẶT VẤN ĐỀ Giống Klebsiella hệ vi khuẩn có đường tiêu hóa, hơ hấp người, nguyên số bệnh nhiễm khuẩn người, gây bệnh chủ yếu trẻ nhỏ Trên giới loài Klebsiella nguyên quan trọng gây nhiễm khuẩn bệnh nhi nằm điều trị bệnh viện đặc biệt trẻ sơ sinh non yếu trẻ nhỏ Tỷ lệ nhiễm khuẩn Klebsiella bệnh viện đặc biệt đơn vị hồi sức cấp cứu khác nước từ 10,2%-26,2% Tình trạng kháng với hầu hết kháng sinh mối đe doạ lớn thầy thuốc người bệnh Với kháng sinh thông thường Ampicillin, Cephazolin, Klebsiella spp kháng cao 60%-100% Phát gen kháng kháng sinh nhóm quinolon lan truyền qua plasmid mốc quan trọng nghiên cứu gen kháng kháng sinh vi khuẩn Nghiên cứu chế kháng kháng sinh tiến hành với mục đích tìm ngun gia tăng tính kháng kháng sinh Klesiella, chế kháng cephalosporin hệ quinolon nghiên cứu nhiều nước Ở Việt Nam, Klebsiella nguyên hàng đầu gây nhiễm khuẩn hô hấp phân lập chủ yếu trẻ sơ sinh trẻ nhỏ nằm điều trị bệnh viện Tỷ lệ Klebsiella spp kháng đa kháng kháng sinh cao với ampicillin cephalotin kháng 97,8% 91,7% trẻ em Những nghiên cứu tìm hiểu tình trạng mang gen mã hóa sinh men β-lactamase phổ rộng gây kháng cephalosporin hệ quinolon lan truyền qua plasmid chưa thực nhiều Việt Nam Vì vậy, chúng tơi tiến hành đề tài nhằm mục tiêu: 1- Xác định tỷ lệ chủng Klebsiella phân lập đường hô hấp bệnh nhi từ đến tuổi Bệnh viện Nhi Trung ương năm 2009-2010 2- Xác định tính kháng kháng sinh chủng Klebsiella phân lập 3- Xác định tỷ lệ mang gen kháng cephalosporin hệ quinolon chủng Klebsiella phân lập * Những đóng góp luận án: Nghiên cứu tiến hành đối tượng bệnh nhi từ 0-6 tuổi, phát chế kháng kháng sinh Klesiella, xác định gen kháng cephalosporin hệ quinolon chủng Klebsiella phân lập Bệnh viện Nhi Trung ương * Bố cục luận án: Luận án gồm 120 trang bao gồm: Đặt vấn đề: trang; Chương Tổng quan: 38 trang; Chương Đối tượng phương pháp nghiên cứu: 21 trang; Chương Kết nghiên cứu: 38 trang; Chương Bàn luận: 18 trang; Kết luận: trang kiến nghị: trang Luận án gồm: 29 bảng, 18 biểu đồ, sơ đồ 17 hình Tài liệu tham khảo: 121 tài liệu Chương TỔNG QUAN 1.1.Các đặc điểm giải phẫu, sinh lý miễn dịch hệ hô hấp 1.1.1 Các đặc điểm giải phẫu Bộ máy hô hấp bao gồm đường hô hấp đường hô hấp Ranh giới phân chia nắp quản 1.1.2 Đặc điểm sinh lý: Bộ máy hô hấp trẻ em chưa hoàn chỉnh năm đầu đời 1.1.3 Cơ chế miễn dịch bảo vệ đường hô hấp Hàng rào niêm mạc Các tế bào thực bào Các yếu tố thể dịch 1.2 Các nguyên gây nhiễm trùng hơ hấp cấp tính trẻ em 1.2.1 Các ngun gây nhiễm trùng hơ hấp cấp tính trẻ em - Tác nhân virus: Đa số trường hợp NKHHCT trẻ em virus (6070%) - Tác nhân vi khuẩn: + Các loại vi khuẩn thường gặp nhiễm trùng cộng đồng: Heamophilus Influenzae, Streptococcus Pneumoniae, Moracella Catarrhalis,Staphylococcus aureus + Các loại vi khuẩn thường gặp nhiễm trùng bệnh viện: S Aureus, P Aeruginosa, Các trực khuẩn Gram âm dễ mọc khác, Klebsiella pneumoniae 1.2.2 Klebsiella NKHHCT Nhiễm khuẩn K.pneumoniae K oxytoka thường gặp người Klesiella chiếm 8% nhiễm trùng bệnh viện 14% nhiễm khuẩn huyết nguyên phát Klesiella Trong số 145 báo cáo bùng phát nhiễm trùng bệnh viện từ 1983- 1991 có 13 báo cáo quy kết Klesiella Các trung tâm kiểm sốt dịch bệnh phịng chống chủng Klesiella cho thấy có 3% nguyên nhân bùng phát dịch bệnh Klesiella Một điều tra Klesiella pneumoniae carbamenemase (KPC) bệnh nhân nhiễm khuẩn đường ruột năm 2011 thấy lan truyền rộng rãi KPC huyện liền kề Ấn Độ năm Bùng phát nhiễm khuẩn huyết trẻ sơ sinh khắp giới, nhiễm trùng khác Klesiella gặp toàn giới Thường gặp khu vực Đông Âu, Nam Á, Trung Phi châu Mỹ la tinh 1.3 Phương pháp chẩn đoán vi sinh nhiễm khuẩn hơ hấp cấp tính 1.3.1 Phương pháp thơng thường 1.3.2 Phương pháp cấy đếm 1.4 Một số kỹ thuật xác định độ nhạy cảm vi khuẩn gây bệnh với kháng sinh 1.4.1 Kháng sinh chế kháng kháng sinh Cơ chế tác động thuốc kháng sinh lên tế bào vi khuẩn: Kháng sinh ức chế trình tổng hợp vách Kháng sinh tác động màng nguyên tương Kháng sinh ức chế trình sinh tổng hợp protein Kháng sinh ức chế sinh tổng hợp acid nucleic Kháng sinh ức chế trình sinh tổng hợp acid folic Cơ chế đề kháng kháng sinh: Đề kháng tự nhiên Đề kháng thu Cơ sở di truyền học đề kháng thu được: Đề kháng thu đột biến NST: Đột biến thường xẩy giai đoạn chép bazơ purin pyrimidin trình tổng hợp ADN, ADN tổng hợp khơng cịn giống với phiên ADN hệ trước Đề kháng thu nhận gen đề kháng qua hình thức vận chuyển di truyền: Biến nạp, tải nạp, tiếp hợp Thành phần di truyền di động (transposons - gen nhảy) Cơ chế lan truyền gen đề kháng 1.4.2 Các chế đề kháng kháng sinh họ vi khuẩn đường ruột với kháng sinh nhóm beta - lactam Đề kháng tự nhiên: Đề kháng tự nhiên sinh enzym lactamaza đề kháng tự nhiên không sinh enzym -lactamaza Đề kháng thu được: Đề kháng thu làm cho vi khuẩn sinh enzym lactamaza Vi khuẩn sinh enzym penicillinaza nhận gen đề kháng nằm plasmid Vi khuẩn tăng cường sản xuất enzym penicillinaza gen đề kháng nằm nhiễm sắc thể Đề kháng thu làm cho vi khuẩn sinh enzym cephalosporinaza gen mã hóa nằm nhiễm sắc thể Đề kháng thu làm cho vi khuẩn sinh enzym lactamaza khác - Năm 1989-1990, hai tác giả Bauernfeind Papanicolaou tìm thấy lồi K pneumoniae sinh enzym -lactamaza kháng lại kháng sinh cephamycin (CMY-1, MIR-1), gen mã hóa nằm plasmi - Enzym immipenemaza tìm thấy lồi S marcescens E cloacae tác giả Yang (1990), Lee Raimondi (1991) - Các Beta Lactamase * TEM-TYPE ESBLs (Lớp A): việc thay amino acid nhiều vị trí TEM-1 beta-lactamase tạo phịng thí nghiệm mà khơng hoạt tính Sự thay đổi vị trí ESBLs làm thay đổi hình dạng vị trí hoạt hóa men, cho phép thâm nhập oxyimino-beta-lactam Trên 130 men TEM tìm thấy, đa dạng chúng có lợi cho việc theo dõi lan tràn gene đề kháng * SHV-TYPE ESBLs (lớp A): SHV-1 chia 68% amino acid với TEM-1 có cấu trúc tương tự Cũng TEM, SHV-type ESBLs có nhiều thay amino acid xung quanh vị trí hoạt hóa Hơn 50 dạng khác SHV biết * CTX-TYPE ESBLs (lớp A): Hiện nay, có 40 CTX-M biết * NHỮNG ESBLs LỚP A KHÁC: PER-1 phân lập Thổ Nhĩ Kỳ, Pháp, Ý; VEB-1 VEB-2 tìm thấy Đông Nam Á; GES-1, GES-2 IBC-2 phân lập Nam Phi, Pháp Hy Lạp PER-1 thường gặp dòng acinetobacter Hàn Quốc Thổ Nhĩ Kỳ Một số men tìm thấy Enterobacteriaceae, ngược lại ESBLs gặp (như BES-1, IBC-1, SFO-1 TLA-1) tìm thấy Enterobacteriaceae * OXA-TYPE ESBLs (lớp D): 12 ESBLs bắt nguồn từ OXA-10, OXA-1, hay OXA-2 cách thay amino acid * MEN PLASMID-MEDIATED AmpC (lớp C): AmpC betalactamases, sinh beta-lactam, mã hóa gene nhiễm sắc thể nhiều trực khuẩn gram âm Các đột biến làm gia tăng tình trạng đề kháng cephalosporin phổ rộng Enterobacter cloacae Hơn 20 AmpC beta-lactamase tìm thấy truyền qua trung gian plasmid * CARBAPENEMASES (LỚP A, B VÀ D): carbapenemases nhóm khác, gặp nhiên quan tâm, chúng có hoạt tính khơng chống lại oxyimino-cephalosporin cephamycin mà với carbapenem Plasmid-mediated IMP-type carbapenemases (hiện biết 17 loại), tìm thấy Nhật (1990s), gram âm đường ruột, pseudomonas acinetobacter sp 1.4.3 Đề kháng với kháng sinh Quinolon Sự đề kháng với nhóm kháng sinh hiểu đột biến NST Sự đột biến làm thay đổi đặc tính enzym tác động vào trình sinh tổng hợp ADN (enzym ADN - gyrase) làm cho kháng sinh không tác động vào Năm 1998, Martinez - Martinez cộng sự, lần mô tả chủng K pneumoniae mang gen kháng quinolon nằm plasmid, đồng thời gen gắn Integron khác Hơn nữa, plasmid đồng thời mang gen mã hóa enzym -lactamase phổ rộng enzyme cephalosporinase Phát có tầm quan trọng lớn, nói lên gen kháng quinolon lan truyền ngang vi khuẩn 1.5 Phương pháp xác định độ nhạy cảm vi khuẩn với kháng sinh phương pháp xác định gen kháng thuốc vi khuẩn 1.5.1 Phương pháp xác định độ nhạy cảm vi khuẩn với kháng sinh 1.5.1.1 Kỹ thuật khoanh giấy khuếch tán thạch 1.5.1.2 Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn (Minimum Inhibitory Concentration - MIC) Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn môi trường đặc Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn môi trường lỏng Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn băng giấy Etest 1.5.2.Các kỹ thuật xác định chế kháng kháng sinh 1.5.2.1 Kỹ thuật tiếp hợp mặt thạch 1.5.2.2 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 1.5.2.3 Phương pháp Real-Time PCR 1.5.2.4 Kỹ thuật phương pháp lai phân tử 1.5.2.5 Kỹ thuật giải trình tự gen 1.6 Nhiễm khuẩn hơ hấp tình hình kháng kháng sinh Klebsiella 1.6.1 Tình hình nhiễm kháng kháng sinh Klebsiella spp nước ngồi Nhiễm khuẩn hơ hấp Klebsiella spp cộng đồng gặp, thường gặp người có miễn dịch trẻ nhỏ, người già, người mắc bệnh mãn tính Nhiễm khuẩn Klebsiella spp gặp chủ yếu trẻ sơ sinh sơ sinh non yếu Tỷ lệ chủng kháng đa kháng kháng sinh cao, chủng sinh men β-lactamase phổ rộng KPC Đặc biệt chủng Klebsiella spp mang gen NDM-1 gây đề kháng loại kháng sinh có làm cho Klebsiella spp trở thành siêu vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh Tỷ lệ nhiễm khuẩn Klebsiella spp khác nước Tại Châu Âu, tỷ lệ Klebsiella spp gây nhiễm khuẩn bệnh viện từ 3% 17%; Thổ Nhĩ Kỳ 26,2% Các chủng Klebsiella spp gây nhiễm khuẩn bệnh viện đề kháng cao với kháng sinh ngoại trừ imipenem (IPM) ciprofloxacin (CIP), tỉ lệ kháng với kháng sinh thuộc nhóm cephalosporin quinolon cộng đồng 4% 21%, tỉ lệ cao gấp hai lần chủng phân lập từ nhiễm trùng bệnh viện Các chủng phân lập từ nhiễm trùng bệnh viện kháng 60%-100% ampicillin (AM) cephazolin, xuất chủng kháng với nhiều loại kháng sinh, với IPM CIP kháng 0%-12% Các chủng sinh men βlactamase phổ rộng (ESBLs) yếu tố lan tràn bùng phát nhiễm khuẩn bệnh viện đồng thời tăng tỉ lệ chủng kháng đa kháng kháng sinh Tỉ lệ chủng có men ESBLs phân lập bệnh nhân viêm phổi nhiễm trùng bệnh viện 88,9% phân lập từ bệnh nhân viêm phổi nhiễm trùng bệnh viện 11,1% Những báo cáo chế kháng kháng sinh nhóm quinolon nhà nghiên cứu cho thấy vai trò chủ yếu đột biến nhiễm sắc thể vi khuẩn Năm 1998, Martinez - Martinez cộng sự, lần mơ tả chủng Klebsiella pneumoniae kháng nhóm kháng sinh quinolon theo chế lan truyền gen P.M.G 252 plasmid Sự kháng kháng sinh nhóm quinolon xác định gen qnr nằm Integron khác Phát có tầm quan trọng lớn nói lên gen kháng quinolon lan truyền ngang vi khuẩn với Thêm vào integron đồng thời mang gen kháng kháng sinh cephalosporin hệ thứ ba (do enzym -lactmase phổ rộng enzyme cephalosporinase) 10 Tỷ lệ mang gen kháng qnr khác nước khu vực:từ 4% đến 55% tập trung cao nước Đông nam Á, đặc biệt Hàn Quốc Trung Quốc từ 20,3 đến 55% Sự kháng kháng sinh cephalosporin hệ (C3G) liên quan đến kháng quinolon theo chế plasmid nhà khoa học giới quan tâm Cũng giống quinolon, chủng kháng C3G thay đổi tùy theo vùng địa lý Những thay đổi quan trọng báo cáo châu Á - Thái Bình Dương Ở Châu Phi số liệu khơng nhiều, tỷ lệ kháng khoảng 40% Đa số chủng mang gen qnr kèm theo mang enzym ESBL (SHV-5, SHV-7, CTX-M, Veb-1, Oxa-30) -lactamase plasmid type AmpC (Fox-5) Đặc biệt chủng mang gen kháng CTX-M gen mã hóa enzym phân hủy Cefotaxime kháng sinh sử dụng nhiều điều trị có loại CTX-M phân hủy ceptazidime nhanh mạnh Cefotaxime xuất khắp nước 1.6.2 Tình hình nhiễm kháng kháng sinh Klebsiella spp nước: Nhiễm trùng đường hô hấp bệnh chiếm tỷ lệ cao nhóm bệnh trẻ em 53,3% (nghiên cứu cấu bệnh tật năm 20052008 bệnh viện Thanh Nhàn) Nhiễm khuẩn hô hấp cấp trẻ em bệnh viện có tỷ lệ cao : Sain-Paul 36,8%, khoa Nhi - Bệnh viện Bạch Mai 41,35%, Bệnh viện Đak lak 35,5% Tỷ lệ nhiễm khuẩn hô hấp, nhiễm khuẩn huyết nhiễm khuẩn tiết niệu trẻ em bệnh viện 27,62% - 42,12 Các chủng Klebsiella spp thu bệnh viện nhi kháng lại kháng sinh ngày tăng cao Các kháng sinh thông thường Ampicilline Cephalothine kháng 97,8% 91,7%, nhóm quinolon (31,9%) C3G cao nhiễm khuẩn bệnh viện trẻ em (42,4 - 57,2%) Những nhiễm khuẩn chung người lớn tỷ lệ kháng C3G từ 36,8 - 37,2% quinolon 31,8% Tỷ lệ chủng sinh beta-lactamases Klebsiella khác tuỳ bệnh viện Bệnh viện Chợ Rẫy 61%; Bệnh viện Việt Đức 39,3%; Bệnh viện Nhi Trung ương 22,68% Tỷ lệ kháng C3G cao (36,8% - 57,2%) quinolon (31,8% - 31,9%) Cho đến nay, Việt Nam có nghiên cứu Cao Thị Bảo Vân cộng với công bố kết nghiên cứu phân bố gen kháng Bêta- lactam chủng thuộc họ Enterobacterriacea phân lập Việt nam cho thấy tỷ lệ CTX-M(25,5%); SHV (38,1%) ; TEM (76,3%) 13 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Tỷ lệ phân bố tỷ lệ chủng Klebsiella phân lập từ bệnh nhi NKHHCT đến tuổi với số yếu tố liên quan 3.1.1.Sự phân bố mẫu bệnh phẩm nhiễm khuần hơ hấp theo nhóm bệnh theo khoa lâm sàng Từ tháng 7/2009 đến tháng 7/2010, có tổng số 3.567 mẫu bệnh phẩm đường hô hấp nuôi cấy xác định tác nhân gây nhiễm khuẩn đường hơ hấp cấp tính khoa Hồi sức cấp cứu, Hồi sức ngoại, Sơ sinh khoa Hô hấp đưa vào nghiên cứu Những mẫu bệnh phẩm đường hô hấp thu thập từ bệnh nhi đến tuổi phân tích chung xem xét hai nhóm: NKHHCT (1.909 mẫu) NKHHCT kết hợp (1658 mẫu) 3.1.2 Tỷ lệ ni cấy dương tính Từ tháng 7/2009 - 7/2010 có 1.181 mẫu bệnh phẩm phân lập vi khuẩn 3.567 mẫu bệnh phẩm đường hô hấp bệnh nhi sơ sinh đến tuổi, khoa Hồi sức cấp cứu, Hồi sức ngoại, Sơ sinh khoa Hô hấp bệnh viện Nhi Trung ương, cho thấy tỷ lệ ni cấy dương tính với vi khuẩn gây bệnh 33,1% Trong có 87 mẫu có lồi chiếm 7,4% 3.1.3 Tỷ lệ ni cấy dương tính hai nhóm NKHHCT NKHHCT kết hợp phân bố khoa Với 1.909 mẫu bệnh phẩm nhóm NKHHCT 1.658 mẫu bệnh phẩm NKHHCT kết hợp ni cấy tìm ngun vi khuẩn gây bệnh Tỷ lệ ni cấy dương tính phân bố theo khoa tỷ lệ nuôi cấy dương tính chung 37,4% nhóm NKHHCT 28,1 % nhóm NKHHCT kết hợp Cao khoa sơ sinh (48,8% 54,7%), sau khoa hơ hấp (37,5%) thấp khoa HSCC (21,1% 22,2%), khác biệt có ý nghĩa thống kê với p0,05 Tỷ lệ phân lập chủng K pneumoniae theo tuổi nhóm NKHHCT kết hợp: Có 467 mẫu bệnh phẩm nhóm NKHHCT kết hợp ni cấy dương tính có 95 chủng K pneumoniae phân lập, tỷ lệ nhiễm K pneumoniae trẻ độ tuổi Sơ sinh nhóm NKHHCT kết hợp 21,6%; trẻ tuổi 20,3% trẻ đến tuổi 8,3% Các tỷ lệ khơng có khác biệt với p>0,05 3.1.7.2 Tỷ lệ chủng K pneumoniae theo giới tính Trong 3567 mẫu bệnh phẩm có 267 chủng K pneumoniae phân lập Sự phân bố chủng K.pneumoniae thể bảng 3.7 Bảng 3.7 Phân bố chủng K pneumoniae theo giới tính Giới tính Số lượng K pneumoniae (+) Tỷ lệ % p Nam 2152 172 8,0 p>0,05 Nữ 1415 95 6,7 Tổng số 3567 267 7,4 Tỷ lệ K peumoniae phân lập trẻ nam nữ khơng có khác biệt,với p> 0,05 3.1.7.3 Tỷ lệ phân lập chủng K pneumoniae theo khoa lâm sàng: Bảng 3.10 Phân bố chủng K pneumoniae phân lập theo Khoa 15 Sơ sinh(1) Hồi sức cấp cứu(2) Hồi sức ngoại(3) Hô hấp(4) Số lượng 793 973 865 936 Hồi sức cấp cứu(2) 403 Khoa 106 41 39 81 Tỷ lệ % 13,7 4,0 3,9 9,0 17 4,2 K.pneumoniae (+) p p(1-2)16 ≤1 ≥4 clavulanic Ceftazidim CAZ 16 >16 ≤4 ≥16 Ceftazidim/Acid CAZ/CLV >1 ≤4 ≥16 clavulanic Piperacillin PIP ≤16 ≥128 >256 >256 Piperacillin/Acid PIP/CLV ≤16 ≥128 >256 >256 clavulanic Cefepim PEP 16 >16 ≤8 ≥32 Imipenem IPM 0,12 >0,12 ≤4 ≥16 Kết cho thấy: chủng Klebsiella pneumoniae có ESBL (+) có mức độ kháng kháng sinh nhóm β-lactamin cao: nồng độ ức chế tối thiểu 50% 90% số chủng số kháng sinh vượt lên giới hạn điểm gẫy MIC theo chuẩn CLSI cao: Piperacillin Piperacillin/Acid clavulanic >256 µg/ml; Cefoperazon >128 µg/ml 3.3 Xác định tỷ lệ chủng K peumoniae mang gen mã hóa kháng kháng sinh Cephalosporin hệ quinolon nằm plasmid 3.3.1 Xác định tỷ lệ chủng K peumoniae mang gen mã hóa kháng kháng sinh Cephalosporin hệ nằm plasmid Bằng kỹ thuật khuếch đại gen (PCR), với cặp mồi thiết kế nhằm mục đích xác định gen mã hóa kháng kháng sinh Cephalosporin hệ nằm plasmid: CTX-M-3, CTX-M-9, SHV TEM Chúng thực nghiên cứu 107 chủng K peumoniae Bảng 3.27 Tỉ lệ chủng K peumoniae mang gen mã hóa kháng C3G nằm plasmid Số chủng mang gen Gen mã hóa Tỉ lệ (%) (n=10) CTX-M-3 33 30,8 CTX-M-9 79 73,8 SHV 95 88,8 TEM 86 80,4 CTX-M (CTX-M-3+ CTX-M-9) 99 92,5 22 Tỷ lệ chủng mang gen mã hóa kháng C3G nằm plasmid cao, đặc biệt CTX-M nói chung 92,5%; SHV(88,8%) thấp CTX-M (30,8%) 3.3.2 Xác định tỷ lệ chủng K pneumoniae mang gen mã hóa kháng kháng sinh nhóm Quinolon (qnr) nằm plasmid Bằng kỹ thuật khuếch đại gen (PCR), nghiên cứu 107 chủng K pneumoniae Kết thu có 41/107 chủng có mang gen mã hóa kháng kháng sinh nhóm Quinolon plasmid, chiếm tỷ lệ 38,3% Kết cho thấy tỷ lệ chủng mang gen kháng Quinolon nằm plasmid nghiên cứu cao Tất 107 chủng đưa vào nghiên cứu gen mã hóa kháng kháng sinh, có chứa gen mã hóa kháng C3G kết phần trên, kết cho thấy đồng thời có 38,3% số chủng mang gen mã hóa kháng kháng sinh nhóm Quinolon (qnr); Trong chủ yếu qnrS (80,6 %), qnrB (17 %) gen qnrA chiếm tỉ lệ nhỏ (2,4 %) 3.3.3 Tỷ lệ chủng mang đồng thời nhiều gen kháng C3G qnr Bảng 3.29 Tỉ lệ chủng mang đồng thời nhiều gen kháng C3G Qnr Số lượng Các gen mã hóa Tỉ lệ % p (n = 107) qnr+CTX-M+SHV+TEM 24 22,4 CTX-M+SHV+TEM 91 85 p< 0,05 CTX-M-3+ CTX-M-9 11 10,3 CTX-M-3+CTX-9+SHV+TEM 8,4 Tỷ lệ chủng đồng thời mang nhiều gen mã hóa kháng C3G cao 85%, chủng đồng thời mang gen CTX-M-3 CTX-M-9 10,3%, chủng mang tất gen mã hóa kháng kháng sinh nhóm C3G 8,4% Trong số chủng đồng thời mang nhiều gen mã hóa kháng kháng sinh nhóm C3G có 22,4% chủng mang gen mã hóa kháng sinh nhóm Quinolon(qnr) Chương BÀN LUẬN 4.1 Đặc điểm phân bố chủng vi khuẩn gây bệnh nhiễm khuẩn hô hấp bệnh nhi đến tuổi Tỷ lệ ni cấy dương tính chung với vi khuẩn gây bệnh 33,1% Trong có 87 mẫu có hai lồi chiếm 7,4% Nhóm NKHHCT 37,4% NKHHCT kết hợp 28,1 % cao khoa sơ sinh Tỷ lệ 23 nhiễm khuẩn hơ hấp cấp tính nước, nước nghiên cứu khác Sự phân bố tác nhân vi khuẩn phân lập đứng đầu Klebsiella pneumoniae (22,6%) sau Acinetobacter spp (19,9%), P aeruginosa(18,4%) Các nguyên thường găp cộng đồng không cao S pneumoniae (5,1%), H influenzae(5,3%) Klebsiella pneumoniae cao (24,1%) nhóm bệnh NKHHCT Acinetobacter spp.(29,8%) nhóm bệnh NKHHCT kết hợp Sự phân bố gần giống nghiên cứu nước Tỷ lệ phân bố chủng K pnemoniae phân lập từ nghiên cứu nước cho thấy tỷ lệ phân lập Klebsiella spp bệnh viện khác tùy quốc gia thay đổi từ 10,2 - 32,2% 4.2 Tính nhạy cảm kháng sinh khả sinh enzym β-lactamase phổ rộng (ESBLs) chủng Klebsiella pneumoniae 4.2.1 Tỷ lệ phân bố chủng K pnemoniae sinh enzym β-lactamase phổ rộng (ESBLs) phân lập Trên giới tỷ lệ sinh ESBLs chủng K pnemoniae khác theo vùng địa lý từ 4,9 - 77,7% Tại Việt Nam, tỉ lệ khác bệnh viện: Bệnh viện Chợ Rẫy 61%, Bệnh viện Việt Đức 39,3%, Bệnh viện Nhi Trung ương 22,97% Như phần lớn kết nghiên cứu tương đối phù hợp với nghiên cứu nước, khoa Hồi Sức Ngoại tỷ lệ cao 71,8% giống nghiên cứu tác giả nước 4.2.2 Tỷ lệ kháng kháng sinh chủng K pnemoniae Nghiên cứu nước cho thấy K pneumoniae kháng với Cefepim (PEP) 62%, Ceftazidime (CAZ)18,4 - 99%, Tazocin (TZP) 78%, Amikacin (AK) 83%, Ciprofloxacine (CIP) 53% Imipenem (IPM) 11%, Co- trimoxazon 64%, Gentamicin 61% Trong nghiên cứu nhận thấy tỷ lệ kháng với Ampicillin (99,2%), với Cephalosporin hệ 2, từ 86,8 đến 93,8% cao so với kết nghiên cứu tác giả nước số nước 40,4 đến 51,2% chủng Klebsiella spp 75,25 đến 87,29%, cao nhiều so với nghiên cứu vi khuẩn từ dịch hút phế quản Ngô Thị Thi cộng 40,4 đến 51,2% K pneumoniae nghiên cứu kháng với Co- trimoxazon, Gentamicin, Amikacin Tobramycin cao gần nghiên cứu trước Bệnh nhi Trung ương tác giả Ngô Thị Thi 79,5%, 70%, 30,2% 79,5% Trần Thị Ngọc Anh năm 2007, nghiên cứu đề kháng kháng sinh vi khuẩn gây bệnh thường gặp bệnh viện Nhi đồng năm 2007 cho thấy vi khuẩn Klebsiella pneumoniae kháng đa kháng sinh mức cao 24 Trimethoprim/sulfamethoxazol (74%), Cefuroxime(71,2%), Cefotaxime (65,3%), Gentamycine (63,6%), Ceftazidime (53,1%), Netilmycine (43,52%), Amikacin (42,9%) Tình trạng kháng kháng sinh nghiên cứu cao nhiều Hầu hết chủng nghiên cứu chúng tơi kháng với Ampicilline, cịn nhạy cảm với Imipenem Ciprofloxacin phù hợp với nghiên cứu trước Tỷ lệ kháng với nhiều loại kháng sinh cao Kháng với đến 12 kháng sinh chiếm đa số chủng K pnemoniae phân lập (75%) nói chung 4.2.3 Mức độ kháng kháng sinh xác định kỹ thuật định lượng MIC Kết nghiên cứu tác giả nước thực chủng K pneumoniae có ESBLs (+) có điểm gãy MIC nồng độ cao Kết xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC50 MIC90 , khẳng định mức độ kháng kháng sinh nhóm β-lactam chủng K pneumoniae nghiên cứu cao, chúng có enzym ESBL (+) 4.3 Tỷ lệ chủng K peumoniae mang gen mã hóa kháng kháng sinh Cephalosporin hệ (C3G) nằm plasmid Sự phát gen mã hóa enzym ESBLs nghiên cứu nhiều quốc gia châu lục Tác giả Caio Fernando de Oliveira cộng nghiên cứu K.pneumoniae phân lập từ bệnh viện bang Rio Grande Sul- Brazil thấy TEM (89,1%), SHV (79,7%), CTX (50%) Tác giả Tehran nghiên cứu chủng K.pneumoniae phân lập từ bệnh nhân (2007) với TEM: 32,8%; SHV: 69,6%; nghiên cứu tác giả Pháp năm 2009 tỷ lệ mang gen kháng C3G K pneumoniae có tỷ lệ TEM (89,1%) cao hơn; Nhưng SHV (79,7%) CTX-M (25%) thấp nghiên cứu Đây báo động thực trạng kháng thuốc sử dụng kháng sinh Ở Việt nam, nghiên cứu Cao Thị Bảo Vân cộng cho thấy: tỷ lệ mang gen mã hóa sinh β-lactamase chủng thuộc họ Enterobacteriacea phân lập năm 2002 CTX-M chiếm 25,5%, SHV chiếm 38,1%, TEM chiếm 76,3% Như vậy, nghiên cứu chúng tơi tỷ lệ mang gen mã hóa kháng C3G chủng K pneumoniae tăng cao, đặc biệt tỷ lệ mang gen CTX-M chiếm 92,5%), SHV chiếm 88,8% TEM chiếm 80,4% 4.4 Tỷ lệ chủng K peumoniae mang gen mã hóa kháng kháng sinh quinolon (qnr) Tỷ lệ gen kháng Quinolon nghiên cứu nàycủa tương đương số nghiên cứu số nước: tác giả Hyunjoo Pai cộng tỷ lệ qnrB phân lập 40,5%, qnrA 3,8%; Myeong Hee Kim 25 cộng Hàn Quốc nghiên cứu chủng Klebsiella pneumoniae phân lập từ bệnh viện thấy tổng số chủng có mang gen qnr 40,5% Trong qnr B chiếm 85,7%, qnrS 14,3% Đài Loan, Trung Quốc từ 2,4 đến 40,5% Với tỷ lệ 38,3% mang gen kháng qnr số chủng mang gen kháng C3G nằm tỷ lệ cao so với nghiên cứu nước 4.5 Xác định chủng K peumoniae mang đồng thời gen mã hóa kháng kháng sinh Cephalosporin hệ (C3G) quinolon (qnr) Nghiên cứu thấy chủng vi khuẩn mang đồng thời nhiều gen mã hóa kháng kháng sinh nhóm C3G chiếm tới 85%, điều đồng nghĩa với việc nhiều gen mã hóa kháng thuốc truyền từ vi khuẩn sang vi khuẩn khác nhanh chóng thời gian ngắn khó kiểm sốt, ngồi cịn có tỷ lệ khơng nhỏ mang đồng thời gen mã hóa kháng Quinonol, chiếm tỷ lệ 22,4% 4.6 Xác định chủng K peumoniae mang gen mã hóa kháng kháng sinh Cephalosporin hệ (C3G) quinolon (qnr) nằm plasmid: Trong nghiên cứu chúng tôi, kỹ thuật PCR kỹ thuật Southern Blot sử dụng hai kỹ thuật sinh học phân tử có độ nhạy cảm độ đặc hiệu cao lần khẳng định gen nằm plasmid KẾT LUẬN Với 3.567 mẫu bệnh phẩm đường hô hấp bệnh nhi đến tuổi khoa HSCC, Sơ sinh, HSN khoa Hô hấp có 1.181 mẫu dương tính Tỉ lệ ni cấy dương tính 33,1% Trong có 7,4% mẫu có loài Trực khuẩn gram âm chiếm đa số tỷ lệ chủng vi khuẩn phân lập nói chung Trong loài vi khuẩn phân lập được, K.pneumoniae chiếm hàng đầu 22,61%, theo sau Acinetobacter spp 19,9% p.aeruginosa 18,37% Từ 3.567 mẫu bệnh phẩm đường hô hấp bệnh nhi đến chia thành hai nhóm NKHHCT (1.909) NKHHCT kết hợp (1.658) - Tỷ lệ ni cấy dương tính NKHHCT 37,4%; Trực khuẩn gram âm chiếm đa số, K.pneumoniae chiếm hàng đầu 24,1%, theo sau P.aeruginosa 17,4% Tỷ lệ phân lập chủng K pneumoniae khoa Sơ sinh cao chiếm 13,0%, tiếp đến khoa Hô hấp 8,7% thấp khoa Hồi sức cấp cứu 4,2% - Tỷ lệ ni cấy dương tính NKHHCT kết hợp 28,1%; Trực khuẩn gram âm chiếm đa số Acinetobacter spp chiếm hàng đầu 26 29,8%, theo sau K.pneumoniae 20,3% Tỷ lệ K.pneumoniae phân lập cao khoa Sơ sinh, sau khoa HSCC HSN - Cầu trùng Gram dương phân lập nhóm NKHHCT cao nhóm NKHHCT kết hợp Các chủng Klebsiella kháng cao với kháng sinh nhóm cephacosporin hệ 2, 3, từ 86,8% đến 95% Các chủng K.pneumoniae kháng hầu hết kháng sinh cefuroxime: 93,8%, cephalothin 95,1% ampicilin 99,2%100%, kháng sinh nhóm aminoglycoside kháng cao với tỷ lệ 65,8% đến 79,4% Còn nhạy imipenem ciprofloxcin Tỷ lệ đa kháng cao, có nhiều kiểu đề kháng, chủ yếu kiểu đề kháng đến 12 loại kháng sinh(75%) Xuất chủng kháng với tất kháng sinh thử nghiệm Tỷ lệ K pneumoniae kháng ≥9 kháng sinh bệnh nhi tử vong chiếm tỷ lệ cao chủng K pneumoniae kháng < kháng sinh, tỷ lệ K pneumoniae kháng ≥9 kháng sinh bệnh nhi tử vong nhóm NKHHCT kết hợp cao hẳn nhóm NKHHCT - Tỷ lệ sinh ESBL chủng K.pneumoniae phân lập 56,9%, cao khoa Hồi sức ngoại 71,8% có khác biệt khoa - MIC có điểm gẫy nồng độ cao, lớn chuẩn đề kháng kháng sinh MIC Kết xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC50 MIC90 khẳng định mức độ kháng kháng sinh nhóm β-lactam chủng K pneumoniae nghiên cứu cao Tỷ lệ mang gen kháng C3G qinolon nghiên cứu cho thấy: - Tỷ lệ mang gen kháng C3G cao: CTXM- 3; 30,8%; CTXM-9: 73,8%; SHV: 88,8%; TEM: 80,4% Tổng họ CTXM: 92,5%, tỷ lệ chủng mang đồng thời gen CTX-M-3 CTX-M-9 nghiên cứu 10,3% Tỷ lệ đồng thời mang tất gen kháng C3G 85% - Tỷ lệ mang gen kháng qnr 38,3% Trong qnrA: 2,4%; qnrB: 17% chủ yếu qnrS: 80,6% - Tỷ lệ đồng thời mang gen kháng C3G qnr nghiên cứu 22,4% 27 CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CƠNG BỐ Bùi Thị Mùi, Lê Thị Ánh Hồng,Nguyễn Thanh Liêm( 2011), "Tỷ lệ sinh men beta - lactamases phổ rộng tính nhạy cảm kháng sinh Klebsiella pneumoniae gây nhiễm khuẩn đường hô hấp trẻ em từ sơ sinh đến tuổi Bệnh viện Nhi Trung ương, 2009 - 2010”, Tạp chí Y học Dự phòng, XXI, tr 83 - 89 Bùi Thị Mùi, Lê Thị Ánh Hồng,Nguyễn Thanh Liêm( 2011), "Tỷ lệ mang số gen kháng cephalosporin hệ quinolon plasmid Klebsiella pneumoniae gây nhiễm khuẩn đường hô hấp Bệnh viện Nhi Trung ương, 2009 2010”, Tạp chí Y học Dự phịng, XXI, tr 201 - 209 ... định tỷ lệ chủng Klebsiella phân lập đường hô hấp bệnh nhi từ đến tuổi Bệnh viện Nhi Trung ương năm 2009- 2010 2- Xác định tính kháng kháng sinh chủng Klebsiella phân lập 3- Xác định tỷ lệ mang gen. .. vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh Tỷ lệ nhi? ??m khuẩn Klebsiella spp khác nước Tại Châu Âu, tỷ lệ Klebsiella spp gây nhi? ??m khuẩn bệnh viện từ 3% 17%; Thổ Nhĩ Kỳ 26,2% Các chủng Klebsiella spp gây nhi? ??m. .. Sain-Paul 36 ,8%, khoa Nhi - Bệnh viện Bạch Mai 41 ,35 %, Bệnh viện Đak lak 35 ,5% Tỷ lệ nhi? ??m khuẩn hô hấp, nhi? ??m khuẩn huyết nhi? ??m khuẩn tiết niệu trẻ em bệnh viện 27,62% - 42,12 Các chủng Klebsiella