TRƯỜNG HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA NÔNG HỌC BÀI TIỂU LUẬN QUÁ TRÌNH NHẬN BIẾT VÀ SỰ TƯƠNG TÁC GIỮA CÁC PROTEIN R VÀ PAMP/MAMP/EFFECTOR GV hướng dẫn: PGS.TS. Đỗ Tấn Dũng Sv thực hiện :Trần Thị Lan Lớp : BVTVA K54 Mã sv : 540053 HÀ NỘI, 2012 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Thế giới các loài gây bệnh thực vật rất phong phú, chúng sử dụng các chiến lược khác nhau để tấn công vào cơ thể cây trồng. Những loài vi khuẩn gây bệnh xâm nhập qua đường khí khẩu hoặc thủy khẩu hoặc qua các vết thương để rồi sinh sôi nảy nở trong khoảng gian bào . Các loài sâu , bọ cây thì dùng miệng chích hút sử dụng trực tiếp chất dinh dưỡng từ các tế bào thực vật. Nấm lại có khả năng xâm nhập trực tiếp qua các lớp tế bào biểu mô thực vật, hoặc bao phủ, xen cài hoặc xuyên sâu lớp biểu mô bằng hệ thống khuẩn ty của mình. Các loài nấm oomycetes cộng sinh gây bệnh có thể phát triển "cái miệng" của mình áp lên lớp màng tế bào vật chủ. Một cấu trúc giao tiếp được tạo thành từ sự tiếp xúc của lớp màng haustoria, chất nền ngoài bào và màng tế bào vật chủ để thực hiện các trao đổi trực tiếp giữa vật chủ và thể cộng sinh này. Ngoài ra, tất cả những nhóm gây bệnh thực vật này đều tiêm vào tế bào thực vật những chất có độc lực để phù hợp với nhu cầu sinh trưởng của chúng. Không giống như động vật, các cây cối không có những tế bào bảo vệ linh hoạt và một hệ thống miễn dịch thích ứng nhanh nhạy. Thay vào đó, thực vật chủ yếu dựa vào đặc tính miễn dịch thụ động của từng tế bào và các chất truyền tin hệ thống được phát sinh từ những vị trí bị xâm nhiễm . Nhóm tác giả này đã thống kê về tính đa dạng của các protein bảo vệ (R protein), về mức độ đa hình di truyền tại locus R giữa cây trồng và loài hoang dại, cũng như về cơ chế phản ứng nội bảo khi những protein R được hoạt hóa . Họ đưa ra giả thuyết rằng nhiều loài protein R của thực vật có thể được hoạt hóa gián tiếp nhờ những chất độc lực do vật xâm nhập tạo ra. Nhưng phản ứng này không phải là một cơ chế nhận biết trực tiếp. Thuyết bảo vệ này giả định rằng những protein R đã gián tiếp nhận biết chất xâm nhiễm khi những chất này biến đổi hoạt động nội bào của vật chủ . Ý kiến cho rằng R protein cảm nhận được những thay đổi trong cơ thể thực vật do vật xâm nhiễm cũng tương tự như cơ chế nhận biết của phản ứng tín hiệu nguy hiểm từ bản thân trong hệ miễn dịch động vật . Như vậy, về cơ bản thực vật có thể sử dụng hai hệ thống miễn dịch. Hệ thống thứ nhất là những thụ thể nhận biết cấu trúc xuyên màng (transmembrane pattern recognition receptors, PRRs). Phân tử PRR có khả năng liên kết với những cấu trúc phân tử bảo thủ của các loài vi khuẩn / vật gây bệnh (microbial-/ pathogen-associated molecular patterns, MAMP/ PAMP), ví dụ là các protein cấu trúc tiên mao. Hệ thống thứ hai hoạt động chủ yếu bên trong tế bào, liên quan đến các protein NB-LRR đa hình được mã hóa bởi các gene R . Những protein này được gọi là NB-LRR là do chúng có các domain liên kết nucleotide (nucleotide binding, NB) và vùng lặp lại giàu leucine (leucine rich repeat, LRR). Các NB-LRR protein có độ tương đồng nhất định đối với các protein CATERPILLER/NOD/NLR và các STAND ATPase ở tế bào động vật. Các chất xâm nhiễm từ các giới sinh vật gây bệnh khác nhau đều được nhận biết bởi protein NB-LRR và do đó kích hoạt cùng một loại phản ứng tự vệ. Khả năng kháng bệnh nhờ NB-LRR chỉ có hiệu quả đối với những vật gây bệnh ký sinh trong mô vật chủ (biotroph hoặc hemi-biotroph) nhưng không có tác dụng đối với những sinh vật phân hủy cấu trúc mô vật chủ trong quá trình xâm thực. Như vậy ,các sinh vật gây bệnh thực vật đã tiến hóa theo nhiều cách khác nhau để gây hại đến quá trình sinh trưởng và sinh sản của cây cối. Để chống lại, thực vật sử dụng 2 hệ thống miễn dịch khác. 8 Cách thứ nhất là nhận biết và đáp ứng lại các phân tử phổ biến ở nhiều loại vi sinh vật khác nhau bao gồm cả những sinh vật không gây hại. Cơ chế thứ hai là phản ứng lại các nhân tố gây độc xâm nhiễm một cách trực tiếp hoặc thông qua hoạt động của chúng. Để hiểu rõ về các phản ứng của cây đối với tác nhân gây hại, chúng tôi thực hiện đề tài : “ Qúa trình nhận biết và sự tương tác giữa các protein R và hệ thống PAMP/MAMP/Effector. “ 2 NỘI DUNG I- Giới thiệu về protein R VÀ PAMP/MAMP/Effector 1- Protein R Như đã biết, nhiều loại tác nhân gây bệnh có thể tiếp xúc với cây nhưng nhìn chung cây có thể kháng lại tốt với phần lớn tác nhân gây bệnh. Thậm chí tác nhân có thể tấn công và gây bệnh thì cây vẫn có thể biểu hiện tính kháng với các mức độ khác nhau. Cho tới nay, rất nhiều gen kháng R của cây đã được xác định. Các gen kháng này có thể qui định tính kháng thông qua quan hệ gen-đối-gen hoặc không. Sản phẩm của các gen này gọi là các protein kháng R Phân loại protein kháng R. Hiện nay, các protein kháng R được chia thành 5 lớp dựa trên đặc điểm cấu trúc và vị trí hoạt động của chúng trong tế bào ký chủ. Các protein trong cùng lớp nhìn chung khá bảo thủ. • Pto Lớp protein thứ nhất chỉ gồm 1 thành viên là Pto phân lập từ cà chua. Pto có 1 vùng có hoạt tính xúc tác kinase. Pto là gen kháng hoạt động trong tế bào chất. Pto là protein kháng chống vi khuẩn P. syringae pv. tomato mang gen AvrPto. Pto có hoạt tính kinase điều khiển dẫn truyền tín hiệu trong tế bào chất dẫn tới phản ứng siêu nhạy. • CNL ( CC-NB-LRR) Lớp protein kháng thứ hai gồm một số lượng lớn protein có cấu trúc gồm một vùng khóa kéo leucine (leucine-zipper – LZ) hoặc một chuỗi xoắn kép (coiled-coil – CC) ở đầu amin; một vùng có khả năng liên kết nucleotide (nucleotide binding – NB) ở vùng trung tâm; và (3) một vùng lặp giàu leucine (leucine-rich repeats - LRR) phía đầu carboxyl. Các protein của lớp này hoạt động trong tế bào chất. • TNL (TIR-NB-LRR) Lớp protein kháng thứ ba là lớp có số lượng lớn nhất và chỉ có ở cây 2 lá mầm. Về cấu trúc, lớp protein TNL tương tự lớp CNL nhưng thay vì chuỗi CC là một chuỗi TIR. Chuỗi TIR là một vùng protein tương đồng với receptor Toll (của ruồi dấm) và receptor Interleukin- 1 (của người) (TIR = Toll/Interleukin-1 Receptor). Tương tự protein kháng lớp CNL, các protein của lớp TNL cũng hoạt động trong tế bào chất. Cả 2 lớp CNL và TNL còn được xếp vào chung một họ protein kháng gọi là họ NB-LRR. Số lượng gen kháng của họ này đươc xem là chiếm số lượng lớn nhất trong các họ protein (Ví dụ trên lúa có hơn 400 gen; Arabidopsis có 150 gen). Đối với cả 2 lớp, đầu amin (chứa vùng CC hoặc TIR) chịu trách nhiệm tương tác với phân tử được bảo vệ - guardee hoặc với các phân tử phía hạ lưu của đường hướng dẫn truyền tính kháng. Phần trung tâm là vùng NBS có khả năng liên kết và thủy phân ATP và do đó chịu trách nhiệm khởi động đường hướng dẫn truyền tín hiệu. Ở đầu carboxyl, chuỗi LRR chịu trách nhiệm qui định tính đặc hiệu đối với elicitor mặc dù phần lớn là gián tiếp. • Cf Lớp protein kháng thứ tư là một số các protein Cf phân lập từ cà chua như Cf2, Cf4, Cf5, Cf9 qui định tính kháng với nấm Cladosporium fulvum mang các gen Avr tương ứng là AvrCf2, AvrCf4, AvrCf5, AvrCf9. Các protein này thiếu vùng NB; không có hoạt tính kinase. Các prtein nhóm này là các protein xuyên màng với vùng LRR nằm bên ngoài (trên bề mặt tế bào). • Xa21 Lớp protein kháng thứ 5 chỉ có protein Xa21 phân lập từ lúa. Protein Xa21 là một protein xuyên màng, có một vùng LRR nằm bên ngoài (trên bề mặt tế bào) và một vùng kinase nằm bên trong tế bào chất. Một số protein R không thuộc 5 lớp trên gồm: 3  Hml là một enzyme khử độc và kháng nấm Cochlibolus trên ngô.  Mlo là một protein màng tế bào lúa miến (barley) mà các đột biến lặn của nó qui định tính kháng nấm phấn trắng và có lẽ điều khiển âm các phản ứng phòng thủ. RPW8 là protein phân lập từ cây Arabidopsis qui định tính kháng nấm phấn trắng theo kiểu không đặc hiệu chủng. PRW8 cũng là một protein xuyên màng 2-PAMP/MAMP/Effector Tính kháng không đặc hiệu hình thành dựa trên khả năng của cây nhận biết được các các elicitor chung (general elicitor) của tác nhân gây bệnh. Hiện nay, các elicitor này được gọi là các PAMP (Pathogen-Associated Molecular Pattern). Thuật ngữ PAMP do các nhà nghiên cứu miễn dịch động vật sử dụng đầu tiên và đang dần bị thay thay thế bởi thuật ngữ MAMP (Microbe Associated Molecular Pattern) vì người ta thấy rằng các vi sinh vật không gây bệnh cũng có các PAMP giống như của tác nhân gây bệnh. Các PAMP/MAMP nhìn chung đa dạng về bản chất hóa học, thường là các chuỗi peptide, glycoprotein, lipids và oligosaccharides có nguồn gốc từ tác nhân gây bệnh và không gây bệnh. Điểm chú ý là trong quá trình gây bệnh, các tác nhân gây bệnh, thông qua các hoạt động enzyme thủy phân, cũng tạo ra các chất có nguồn gốc từ vách tế bào thực vật mà các chất này cũng đóng vai trò như elicitor kích hoạt phản ứng phòng thủ của cây. Các chất có nguồn gốc từ ký chủ như trên được gọi là các mô hình phân tử (có nguồn gốc ký chủ) được cảm ứng bởi tác nhân gây bệnh và được ký hiệu là MIMPs (Microbe-Induced Molecular Patterns). Như vây cây không chỉ nhận biết và phản ứng với các dấu hiệu có nguồn gốc từ tác nhân gây bệnh mà còn có nguồn gốc từ chính cây. Các PAMP/MAMP hiển nhiên khá bảo thủ trong một nhóm tác nhân gây hại. Một số các MAMP/PAMP chung nổi tiếng là: • Lypopolysacharid (LPS). LPS có nguồn gốc từ các vi khuẩn gram (-) như Xanthomonas, Pseudomonas…LPS cảm ứng để tạo ra sự cháy oxy hóa, hình thành các enzyme kháng sinh. • Flagellin. Là protein cấu tạo nên lông roi vi khuẩn gram (-). Mỗi lông roi bao gồm hàng ngàn tiểu phần flagellin. Flagellin chứa một motif nhân biết gồm 22 aa (đoạn fgl22). Flagellin có thể cảm ứng tạo để hình thành callose và các phản ứng phòng thủ khác như hình thành PR protein. * Harpin. Harpin là các protein được mã hóa bởi gen hrp (viết tắt của hypersensitive response and pathogenicity) của vi khuẩn gram (-). Phần lớn các loài vi khuẩn có 2 cum gen hrp. Cum lớn gồm 6-9 đơn vị phiên mã, mỗi đơn vị mã hóa 1-9 protein. Các protein harpin nằm trên màng tế bào vi khuẩn, tham gia cấu tạo nên hệ thống tiết loại III của vi khuẩn. Hệ thống tiết loại III sẽ vận chuyển Avr protein và cả harpin vào trong tế bào cây. Harpin cảm ứng để tạo phản ứng siêu nhạy/apoptosis và các phản ứng phòng thủ khác • Chitin. Chitin là các phân tử oligomer có nguồn gốc từ vách tế bào nấm. Chitin có thể cảm ứng hình thành phytoalexin và lignin hóa tế bào cây. • Glucan. Glucan có nguồn gôc từ vách tế bào nấm, đặc biệt là nấm trứng như Phytophthora. Glucan có thể cảm ứng cây hình thành phytoalexin. 4 • Glycoprotein. Glicoprotein có nguồn gốc từ vách tế bào nấm trứng như Phytophthora. Glycoprotein có thể cảm ứng cây hình thành phytoalexin II-Nhận biết và tương tác giữa các protein R và PAMP/MAMP/Effector Vai trò của Effector (chất hiệu ứng): Như đã biết, effector là phân tử có nguồn gốc từ tác nhân gây bệnh tác động lên tế bào ký chủ, nhờ đó tạo điều kiện cho sự nhiễm bệnh Sự nhận biết và tương tác này tuân theo 1 trong 2 cơ chế trực tiếp hoặc gián tiếp. * Tương tác trực tiếp – mô hình Elicitor – Receptor Quan hệ gen-đối-gen lúc đầu đã được giả thiết là dựa trên tương tác trực tiếp giữa protein R và Avr protein. Sự tương tác này được gọi là mô hình Elicitor – Receptor, trong đó elicitor là các protein Avr đóng vai trò là chất kích hoạt còn receptor các protein kháng đóng vai trò là chất tiếp nhận. Phản ứng kháng hình thành chỉ khi có sự tương tác trực tiếp giữa elicitor và receptor. Hiện nay, sự tương tác trực tiếp giữa 2 thành phần này mới chỉ được chứng minh là đúng trên một số ít trường hợp, tất cả đều liên quan đến các protein kháng lớp TIR/CC-NBS- LRR. Dưới đây là các trường hợp có tương tác trực tiếp. 1. Tương tác giữa protein AvrPi-ta (của nấm Pyricularia oryzae) và protein Pi-ta (lúa). 2. Tương tác giữa AvrL567 (của nấm M. lini) và các protein L5, L6, L7 (họ các protein kháng thuộc locus L của cây lanh) 3. Tương tác giữa AvrPopP2 (của vi khuẩn R. solanacearum) và protein RRS1 (của Arabidopsis). Mô hình tương tác trực tiếp không thể giải thích được tại sao chỉ với một số gen kháng, cây trồng có thể nhận biết được một số lượng lớn các effector của tác nhân gây bệnh * Tương tác gián tiếp – mô hình bảo vệ (Guard model) Sự tương tác giữa gen kháng R và Avr để dẫn tới phản ứng kháng gần đây đã được chứng minh chủ yếu thực hiện theo cách gián tiếp gọi là “mô hình bảo vệ”. Theo mô hình này, protein kháng R của ký chủ sẽ liên kết và “bảo vệ” một protein A. Protein được bảo vệ (guardee) này sẽ tương tác với protein Avr của tác nhân gây bệnh và hoạt hóa protein R dẫn tới kích hoạt các phản ứng dẫn tới tính kháng. Thực sự protein kháng R của cây không phát hiện protein Avr mà phát hiện hoạt động của nó có nghĩa nếu protein Avr khi có mặt trong tế bào mà không hoạt động tức không tương tác, thường thông qua hoạt tính enzyme của nó đối với phân tử được bảo vệ, thì protein kháng R sẽ không phát hiện. Mô hình bảo vệ giải thích được tại sao chỉ với một số gen kháng, cây trồng có thể nhận biết được một số lượng lớn các effector của tác nhân gây bệnh. Mô hình này đã được chứng minh bằng thực nghiệm trên nhiều trường hợp. Dưới đây là một số ví dụ: 1. AvrPphB của vi khuẩn P. syringae và protein kháng RPS5 của cây Arabidopsis. AvrPphB là một protease nhóm cystein. Sau khi được vi khuẩn đưa vào trong tế bào cây, AvrPphB sẽ cắt một phân tử protein kinase của ký chủ là PBS1. Protein kháng RPS5 sẽ nhận biết được việc cắt này và khởi động phản ứng kháng. 2. AvrRpm1 (hoặc AvrB) của vi khuẩn P. syringae và protein kháng RPM1 của cây Arabidopsis. Khi được đưa vào trong tế bào, AvrRpm1 (hoặc AvrB) sẽ phosphoryl hóa một protein của ký chủ là RIN4. Protein kháng RPM1 giám sát hiện trạng của RIN4 và do đó nhận biết sự phosphoryl hóa của RIN4 và khởi động phản ứng phòng thủ. 5 Hình 1: Sự nhận biết và tương tác giữa các protein R và PAMP/MAMP/Effector Đối với cây, sự nhận biết các elicitor chung (MAMP/PAMP) đã hình thành tính kháng cơ bản. Tính kháng này còn được gọi là tính kháng khởi động bởi MAMP/PAMP. Tính kháng này có thể hiệu quả dẫn tới cây không bị bệnh. Tuy nhiên, tác nhân gây bệnh có thể khắc phục tính kháng cơ bản bằng cách tiết vào tế bào cây các effector. Một vi khuẩn gây bệnh (vd Pseudomonas syringae) trong quá trình gây bệnh có thể tiết vào trong tế bào thực vật từ 20 -30 effector khác nhau thông qua hệ thống tiết loại III. Tương tự, các loại nấm biotroph cũng tiết vào tế bào cây nhiều effector thông qua vòi hút (haustorium) hình thành bên trong tế bào (vd nấm gỉ sắt cây lanh M. lini tiết vào tế bào tới 21 loại effector khác nhau). Nhiều effector của tác nhân gây bệnh có hoạt tính enzym, có vai trò biến đổi các protein của ký chủ nhằm tạo điều kiện cho sự gây bệnh và làm mất khả năng nhận biết của cây. Một trong các vai trò của các effector này là ức chế phản ứng phòng thủ của cây thông qua nhận biết PAMP/MAMP. Một số các protein của virus thực vật (Vd HP = Helper Component) của các potyvirus) có khả năng ức chế phản ứng phòng thủ của cây thông qua cơ chế gene silencing cũng có thể được xem là effector của virus. Nếu hoạt động của các effector này hiệu quả, cây sẽ bị nhiễm bệnh. Các effector của tác nhân gây bệnh được nghiên cứu nhiều nhất là các Avr protein. Nếu cây có gen R có thể nhận biết được các Avr protein thì một lớp phản ứng kháng thứ 2 sẽ hình thành và được gọi là tính kháng khởi động bởi effector. Tính kháng khởi động bởi effector hiển nhiên là đặc hiệu và thường tuân theo quan hệ gen-đối-gen. 6 III- KẾT LUẬN Thực vật luôn phải đối đầu với các dạng mầm bệnh khác nhau để sống và tồn tại. Ngày nay với sự phát triển của sinh học phân tử bản chất của hiện tượng kháng bệnh cũng như bản chất của những phản ứng đối với mầm bệnh đang dần được làm sáng tỏ. Đây là quá trình phức tạp, có sự tham gia của nhiều chất khác nhau để nhận biết tín hiệu từ mầm bệnh hoạt hóa đường dẫn truyền tín hiệu bằng con đường phosphoryl hóa hoặc bằng sự nhận biết R/Avr protein.Mầm bệnh luôn có khả năng thay đổi để ứng biến một cách đa dạng với các phản ứng kháng bệnh của thực vật. Ở Việt Nam nhiều loại mầm bệnh gây hậu quả nghiêm trọng .Tuy vậy nghiên cứu cơ bản về hiện tượng kháng bệnh cũng còn nhiều hạn chế. Vì vậy đây sẽ còn là một vấn đề nóng bỏng trong giai đoạn hiện nay,khi sự biến đổi khí hậu toàn cầu còn tác động lên nhiều đến sinh vật sống trên trái đất. 7 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1- Giaó trình miễn dịch thực vật – GS.TS.Đỗ Tấn Dũng( chủ biên)_TS.Hà Viết Cường _ TS.Trần Nguyễn Hà. 2- Protein và tính kháng bệnh ở thực vật _ Trần Thị Phương Liên 3- http://idoc.vn/tu sach.thuvienkhoahoc.html 8 . của phản ứng tín hiệu nguy hiểm từ bản thân trong hệ miễn dịch động vật . Như vậy, về cơ bản thực vật có thể sử dụng hai hệ thống miễn dịch. Hệ thống thứ nhất là những thụ thể nhận biết cấu. sinh vật sống trên trái đất. 7 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1- Giaó trình miễn dịch thực vật – GS.TS.Đỗ Tấn Dũng( chủ biên)_TS.Hà Viết Cường _ TS.Trần Nguyễn Hà. 2- Protein và tính kháng bệnh ở thực vật. vật gây bệnh ký sinh trong mô vật chủ (biotroph hoặc hemi-biotroph) nhưng không có tác dụng đối với những sinh vật phân hủy cấu trúc mô vật chủ trong quá trình xâm thực. Như vậy ,các sinh vật