Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 1 Mở đầu Ngày nay cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme đượac sản xuất càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm,nông nghiệp,chăn nuôi,y tế…Hàng năm luợng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với trên 500 triệu USD,được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau. Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại enzyme đơn cấu tử,xúc tác cho phản ứng phân hủy.Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên. Protease la enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất như: chế biến thưc phẩm ( đông tụ sữa làm cho phomát,lsmf mềm thịt,bổ sung để tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia.xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực phẩm…(sản xuất chất tẩy rửa,thuộc da,y tế,nông nghiệp…) Qua nhiều năm ,việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp protease đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều hơn.Tuy nhiên giá thành chế phẩm protease còn khá cao,do đó cũng hạn chế việc sử dụng rộng rãi enzyme trong sản xuất.Các chế phẩm thu được sau quá trình nuôi cấy sản xuất enzyme chưa phải là chế phẩm có độ tinh khiết cao vì protein chỉ chiếm 20-30%. Vì vậy, việc nghiên cứu cải tiến phương pháp tách và tinh chế enzyme nhằm thu đượ chế phẩm có độ tinh khiết cao rất cần thiết. Để tách và tinh chế enzyme nói chung và protease nói riêng thì có một số phương pháp hóa – lý khác nhau. Có thể chia làm ba nhóm chính sau: - Phương pháp kết tủa - Phương pháp sắc ký - Phương pháp phân tách hệ hai pha nước Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 2 Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật. Tuy nhiên, nguồn enzyme phong phú nhất là nguồn từ vi sinh vật, có hầu hết ở các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn,… Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghiệp và đời sống. Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 3 Phần I – Tổng quan về enzyme protease 1.Giới thiệu chung Nhóm enzyme protease xúc tác quá trình thủy phân liên kết peptid ( -CO-NH) n trong phân tử protein, polypeptid đến sản phẩm cuối cùng là các acid amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận chuyển acid amin. H 2 N–CH–CO–NH–CH–CO -… NH–CH-COOH +H2O R 1 R 2 R X H 2 N-CH-COOH + H 2 N-CH-CO…NH-CH-COOH R 1 R 2 R X Mô hình enzyme protease Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 4 Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật ( vi khuẩn, nấm, virus) đến thực vật ( đu đủ, dứa, ) và động vật (gan, dạ dày bê, ). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất. Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng. Cấu trúc không gian enzyme protease Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 5 1.1 Phân loại Protease Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4). Peptidase (protease) (E.C.3.4) Sơ đồ phân loại protease Protease được phân chia thành 2 loại : endopeptidase và exopeptidase. • Dựa vào vị trí tác động trên mạch polipeptide, exopeptidase được phân chia thành 2 loại : + Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một acid amin,một dipeptide hoặc tri peptide. + Carboxypeptide: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một acid amin hoặc một dipeptide. * Dựa vào động học của cơ chế xúc tác ,endopeptidase được chia thành 4 nhóm: Metallo proteinase Exopeptdase (E.C.3.4.11-17) Serine proteinase Cystein proteinase Aspartic proteinase Carboxypeptidase Aminopeptidase Endopeptidase (E.C.3.4.21-99) Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 6 + Serin proteinase: là những protein chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin.Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin.trypsin,elastase.Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin Carsberg, subtilisin BPN. Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng. + Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động. Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vài protein động vật và protein kí sinh trùng.Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng. + Aspatic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin. Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính. + Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA. Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành 3 nhóm: - Protease acid: pH 2-4 - Protease trung tính: pH 7-8 - Protease kiềm: pH 9-11 1.2 Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật Các công trình nghiên cứu protease vi sinh vật ngày càng nhiều. Các kết quả nghiên cứu cho thấy ngay cả các protease của cùng một loài vi sinh vật cũng có thể khác nhau vê nhiều tính chất. Căn cứ vào cơ chất phản ứng, pH hoạt động Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 7 thích hợp,…các nhà khoa học đã phân loại các protease vi sinh vật thành 4 nhóm sau: P-xerin, P-thiol, P-kim loại, P-acid Một số tác giả khác chia protease ra 3 nhóm, dựa vào hoạt động pH của chúng bao gồm: protease acid, protease trung tính, protease kiềm. Trong 4 protease kể trên, các protease – xerin và protease – thiol có khả năng phân giải liên kết este và liên kết amide của các dẫn xuất acid của acid amin. Ngược lại các protease kim loại, protease acid thường không có hoạt tính esterase của các dẫn xuất của acid amin. Nhiều protease ngoại bào của vi sinh vật đã được nghiên cứa tương đối kỹ về cấu tạo phân tử, một số tính chất hóa lý và cơ chế tác dụng. Kết quả nghiên cứu cho thấy trọng lượng phân tử của các enzyme này tương đối bé, nhất là các P-xerin. Các P-xerin có trọng lượng phân tư thấp vào khoảng 20.000 – 27.000 dalton. Tuy nhiên, cũng có một số p-xerin có trọng lượng phân tử lớn hơn như các enzyme Pelicillium cyoneo-fulvum (44.000), Asp (52.000),… Trọng lượng phân tử của các protease kim loại lớn hơn so với P-xerin ( vào khoảng 33.800 – 48.400). Protease thiol và nhiều protease – acid cũng có trọng lượng phân tử vào khoảng 30.000 – 40.000 dalton. 1.3 Cấu trúc trung tâm hoạt động ( TTHĐ) của protease. Trong TTHĐ của protease vi sinh vật (VSV) ngoài gốc aa đặc trưng cho từng nhóm còn có một số gốc aa khác. Các kết quả nghiên cứu chung về TTHĐ của một số protease VSV cho phép rút ra một số nhận xét chung như sau: -TTHĐ của protease đủ lớn và bao gồm một số gốc aa và trong một số trường hợp còn có cả các cofactơ kim loại. + Các protease kim loại có TTHĐ lớn hơn vào khoảng 21 A 0 , có thể phân biệt thành 6 phần dưới TTHĐ ( subsite), mỗi phần dưới trung tâm hoạt động tương ứng với mỗi gốc aa trong phân tử cơ chất. Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 8 + Đối với các protease acid, theo nhiều nghiên cứu cấu trúc TTHĐ của các tinh thể protease acid của Phizopus chinenis và endothia đã cho thấy phân tử các phân tử protease này có 2 hạt, giữa chúng có khe hở vào khoảng 20 A 0 . Khe hở này là phần xúc tác của các enzyme, các gốc asp-35 và asp-215 xếp đối diện nhau trong khe ấy. - Đối với các protease không chứa cysteine, TTHĐ của chúng có tính mềm dẻo hơn vì cấu trúc không gian của chúng không được giữ vững bởi các cầu disulphide. Mặc dù TTHĐ của các protease VSV có khác nhau nhưng các enzyme này đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptid theo cùng một cơ chế chung như sau: E+S enzyme – S Enzyme-S + P1 enzyme + P2 Trong đó: E: Enzyme, S: cơ chất, Enzyme-S: phức chất enzyme-cơ chất, P1, P2: là sản phẩm đầu tiên và thứ 2 cưa phản ửng. Phần II – Nguồn thu nhận Enzyme protease là protein được sinh vật tổng hợp trong tế bào và là chất tham gia xúc tác cho mọi phản ứng sinh học. Chính vì thế, mọi vi sinh vật đều được xem là nguồn thu nhận để sản xuất enzyme. Nhưng vẫn chủ yếu là 3 nguồn chính: động vật, thực vật, vi sinh vật. 2.1 Nguồn động vật - Tụy tạng: đây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài nhất và có nhiều enzyme nhất. Dạ dày bê: trong ngăn thứ tư của dạ dày bê có tồn tại enzyme thuộc nhóm Protease tên là renin. Enzyme này từ lâu đã được dùng phổ biến trong công nghệ phomat. Renin làm biến đổi cazein thành paracazein có khả năng kết tủa Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 9 trong môi trường sữa có đủ nồng độ Ca 2+ . Đây là quá trình đông tụ sữa rất điển hình, được nghiên cứu và ứng dụng đầy đủ nhất. Trong thực tế nhiều chế phẩn renin bị nhiễm pepxin ( trong trường hợp thu chế phẩm renin ở bê quá thì. Khi đó dạ dày bê đã phát triển đầy đủ có khả năng tiết ra pepxin) thì khả năng đông tụ sữa kém đi. Gần đây có nhiều nghiên cứu sản xuất protease từ vi sinh vật có đặc tính renin như ở các loài Edothia Parasitica và Mucor Purullus. Ngoài ra, người ta còn nghiên cứu thu nhận enzyme từ ruột cá basa. Dịch trích ly enzyme thu được từ ruột cá basa có tổng hoạt tính cao nhất là 15.78 UI/gCKNT trong điều kiện trích ly : tỷ lệ mẫu/dung môi: 1/1 (w/w), pH 9.5: nhiệt đọ 35 0 C: thời gian trich ly 10 phút. 2.2 Nguồn thực vật Có 3 loại protease thực vật như Bromelain, Papain và Ficin. Papain thu được từ nhựa củ lá, thân, quả đu đủ ( Carica papaya) còn Bromelain thu được từ quả chồi dứa, vỏ dứa ( pineapple pant). Các enzyme này được sử dụng để chống lại hiện tượng tủa trắng của Bia khi làm lạnh ( chilling proofing) do kết tủa protein. Những ứng dụng khác của proease thực vật này là trong công nghệ làm mềm thịt và trong mục tiêu tiêu hóa. Ficin thu được từ nhựa cây cọ ( Ficus carica). Enzyme được sử dụng thủy phân protein tự nhiên. Nguồn protease thu từ thực vật Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 10 Thu nhận từ hạt cốc nảy mầm: Malt là loại hạt hòa thảo nảy mầm trong những điều kiện nhân tạo( nhiệt độ, độ ẩm, thời gian) xác định gọi là qui tắc ủ malt. Quá trình sản xuất malt bao gồm các khâu sau: + Thu nhận, xử lí, làm sạch, phân loaị và bảo quản hạt. + Rửa, sát trùng và ngâm hạt. + Uơm mầm ta sẽ thu được malt tươi. + Sấy malt tươi. + Xử lí và bảo quản malt khô. Hoạt tính protease trong hạt ban đầu không đáng kể nhưng khi nảy mầm đã tăng lên 4-8 lần, tăng nhanh hơn hoạt tính amylase và đạt cực đại vào khoảng ngày nảy mầm thứ 5. Sự thủy phân protein bắt đầu bằng tác dụng của protienaza để tạo thành albumoza, polypeptit, pepton và sau đó dưới tác dụng của peptidaza tạo thành các acidamin. Tuy nhiên sự biến đổi này thường không hoàn toàn vì các điều kiện nảy mầm thường không phải là điều kiện tối thích cho hoạt động của hệ enzyme proteaza của hạt. Tuy nhiên, vì nhiệt độ nảy mầm tương đối thấp và thời gian nảy mầm tương đối dài sẽ có sự thủy phân protein tương đối sâu sắc để tạo thành một lượng đáng kể các polypeptit và các acidamin. Tác động này chỉ diễn ra với nội nhũ, trong khi protein ở lớp ngăn cách nội nhũ với vỏ và cả phần vỏ malt thì không bị biến đổi cả trong cả quá trình chế biến về sau. 2.3 Nguồn vi sinh vật Vi sinh vật là nguồn thu nhận enzyme khổng lồ, enzyme protease phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn,…gồm các loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và một số loại nấm men. 2.3.1 Vi khuẩn [...]... không kèm theo sự tích lũy enzyme protease trong canh trường, chỉ sau khi kết thúc pha sinh trưởng mới xảy ra sự tổng hợp enzyme cực lớn Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 34 Enzyme protease b Quy trình thu nhận enzyme protease Nuôi cấy Thu nhận phế phẩm chế phẩm enzyme thô đem sử dụng Enzyme thô chế phẩm enzyme thô đem tinh chế nghiền mịn trích ly Lọc bã kết tủa enzyme dùng trong chăn nuôi... phẩm enzyme , người ta có thể phân lập giống vi sinh vật có trong tự nhiên hoặc giống đột biến có lựa chọn theo hướng có lợi nhất, chỉ tổng hợp ưu thế một loại enzyme nhất định cần thiết nào đó Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 13 Enzyme protease Phần III – Thu nhận và làm sạch enzyme protease từ vi simh vật và thực vật 3.1 Thu nhận và làm sạch enzyme Protease từ vi sinh vật Nguồn thu protease. .. phâm enzyme tinh sạch tinh chết kết tủa thu nhận chế phẩm enzyme tinh khiết enzyme kết tinh Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 35 Enzyme protease 4.3 Quy trình thu nhận enzyme protease từ nấm mốc Asp.oryzae Nguyên liệu dinh dưỡng (bột bắp, nấm men, pepton) Nước Khoáng hỗn hợp H p thanh trùng Làm ngu i đ n 300C Đ lên khay Giống Asporyzae Nuôi cấy ở nhiệt độ phòng Thu nhận sinh khối (enzyme. .. tổng hợp enzyme Protease Ví dụ: VI khuẩn Bac Subtilis có khả năng sinh tổng hợp protease ở môi trường tinh bột >8% Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 19 Enzyme protease Nhiều xạ khuẩn ưu nhiệt, trong đó Micromonospora vulgaris 42, mọc tốt và sinh tổng hợp protease cao ở môi trường có tinh bột Tăng nồng đọ tinh bột từ 0,25 – 1,5% sinh khối cũng tăng đồng thời với hiệu suất tổng hợp enzyme Nếu... gây tổn thương lớn 3.6 Tách và làm sạch chế phẩm enzyme Một điều cần nói thêm nữa là enzyme thường chứa ở các tế bào vi sinh vật gọi là các enzyme trong tế bào (intracellular), nhuwnh nó cũng có thể được các vi sinh vật tiết ra môi trường sống Đó là các enzyme ngoài tế bào (extracellular) Enzyme vi sinh vật thương chiết là enzyme ngoại bào Các phân tử enzyme không có khả năng đi qua màng tế bào và màng... nhận enzyme protease từ nấm mốc Aspergillus oryzae a Sinh trưởng và sinh tổng hợp protease từ nấm Khi nuôi vi sinh vật tạo protease có hai quá trình liên quan mật thiết với nhau Quá trình tổng hợp sinh khối vi sinh vật và quá trình tích tụ enzyme trong tế bào hoặc ngoài môi trường Ở một số vi sinh vật, quá trình sinh tổng hợp protease tiến hành song song với quá trình sinh trưởng, nghĩa là sự tích tụ enzyme. .. sản xuất cá chế phẩm enzyme vi sinh vật bao gồm các giai đoạn chủ yếu: Tuyển chọn và cải tạo giống vi sinh vật Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật Môi trường nuôi cấy vi sinh tổng hợp enzyme Tách và làm sạch chế phẩm enzyme Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 14 Enzyme protease Các công đoạn sản xuất chế phẩm enzyme 3.1.1 Tuyển chọn và cải tạo giống vi sinh vật cho enzyme có hoạt lực cao... vật tổng hợp enzyme Protease Cần phải chọn môi trường vì thành phần môi trường dinh dưỡng cso ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật trong thành Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 18 Enzyme protease phần môi trường phải có đủ các chất bảo quản được sự sinh trưởng bình thường của vi sinh vật và tổng hợp enzyme Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người... mạch nha, y học, nghiên cứu khoa học Enzyme nói chung rất dễ giảm hoạt tính dưới tác dụng của các tác nhân bên ngoài do đó khi tách và tinh chế enzyme để tránh sự biến hình protein ảnh hưởng lớn đến hoạt tính enzyme cần tiến hành nhanh chóng ở nhiệt độ thấp, độ pH thấp không có mặt các chất gây biến hình enzyme Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 26 Enzyme protease 3.6.1 Phương pháp kết tủa... ba loại protease: acid, kiềm và trung Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 11 Enzyme protease tính Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu là các protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2.5-3 Một số nấm mốc nhưA.candidatus, P.camerberti, P.roqueforti…cũng có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất phomat Nấm mốc 2.3.3 Xạ khuẩn Về phương diện tổng hợp protease, . giả khác chia protease ra 3 nhóm, dựa vào hoạt động pH của chúng bao gồm: protease acid, protease trung tính, protease kiềm. Trong 4 protease kể trên, các protease – xerin và protease – thiol. nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng. Cấu trúc không gian enzyme protease Enzyme protease. đó. Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 14 Phần III – Thu nhận và làm sạch enzyme protease từ vi simh vật và thực vật 3.1 Thu nhận và làm sạch enzyme Protease