Đang tải... (xem toàn văn)
Báo cáo thực hành môn Virus học Báo cáo thực hành môn Virus học trình bày về: kỹ thuật tiêm trứng và kỹ thuật kết tủa khuếch tán trên thạch, tham quan công ty navetco, phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu, qui trình tách chiết DNA tổng số và chạy PCR, phản ứng ELISA phát hiện kháng thể kháng virus gây bệnh Gumboro.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP & TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN PHAN VĂN HÙNG BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH MÔN VIRUS HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Khóa học: 2010 – 2014 GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Ts. Nguyễn Tất Toàn An Giang, Tháng 04 năm 2014 2 3 Bài I KỸ THUẬT TIÊM TRỨNG VÀ KỸ THUẬT KẾT TỦA KHUẾCH TÁN TRÊN THẠCH I. Kỹ thuật tiêm virus Newcastle(Tiêm xoang niệu mô) 1. Mục đích Xác định sự hiện diện của virus Newcastle trong phôi trứng gà, ứng dụng sâu hơn là sản xuất Vắc xin. 2. Dụng cụ - hóa chất Hình 1: Một số dụng cụ và hóa cần thiết Nước muối sinh lý 10- 20% Cồn Iod Parafin lỏng Kim tiêm 3. Chuẩn bị nguyên liệu Chuẩn bị trứng gà đã ấp từ 9 – 11 ngày tuổi 4 Muối sinh lý 10-20% Hình 2: Trứng 9 – 11 ngày tuổi Chuẩn bị vắc xin Newcastle nhược độc, sử dụng ở nồng độ 10 -3 , liều lượng là 0.1-0.2ml/trứng Hình 3: Vắc xin Niu-cát xơ Pha vắc xin với nước muối sinh lý ở nồng độ 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 . Hình 4: Khử trùng hủ vắc xin Niu-cát xơ trước khi đem pha Hình 5: Cho vắc xin vào nước muối sinh lý 5 Hình 6: Lắc để trộn điều vắc xin Tiến hành pha loãng với các nồng độ 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 Hình 7: Virus Niu-cát-xơ ở 3 nồng độ 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 Sử dụng ở nồng độ 10 -3 để tiêm vào trứng, đối với virus Newcastle. Ta tiến hành tiêm ở xoang niệu mô, liều lượng là 0,1-0,2 ml/trứng. 4. Quy trình thực hiện Hình 8: Trứng đã ấp từ 9 – 11 ngày tuổi 6 Hình 9: Soi trứng, xác định buồn hơi thật, vị trí phôi và làm dấu vị trí phôi Hình 10: Xác trùng vỏ trứng bằng cồn và Iod Hình 11: Tiến hành đục lỗ, sau đó xác trùng lại lần nữa Hình 12: Tiến hành tiêm(liều tiêm 0,1-0,2 cc/trứng) 7 Lưu ý : Tiêm về phía đối diện phôi không tiêm trực tiếp lên phôi Hình 13: Dùng parafin hơi nóng bịt kín lỗ khoan sau đó tiến hành ủ ở 37 0 c 5. Xem kết quả II. kỹ thuật tiêm Virus Đậu mùa(kỹ thuật tạo buồng hơi giã) 1. Mục đích Xác định sự hiện diện của Virus đậu mùa trong phôi trứng gà, thông qua bệnh tích biểu hiện trên màng CAM(nốt pock trên màng CAM). Ứng dụng sản xuất Vắc xin để phòng bệnh đậu mùa 2. Dụng cụ - hóa chất Nước muối sinh lý, cồn, Iod, nút bóp cao su… 3. Chuẩn bị nguyên liệu Chuẩn bị trứng gà đã ấp 9 – 11 ngày tuổi. Chuẩn bị vắc xin đậu gà nhược độc, pha loãng thành các nồng độ 10 -1 ,10 -2 ,10 -3 . Sử dụng nồng độ 10 -3 , liều tiêm 0,1-0,2 ml/trứng. Cách pha loãng thực hiện tương tư như trên. Hình 14: Vắc xin Đậu gà 8 4. Quy trình thực hiện Hình 15: Chuẩn bị trứng đã ấp 9-11 ngày tuổi Hình 16: Soi trứng, đánh dấu vị trí buồng hơi giã, khử trùng vỏ trứng, đục lỗ Hình 17: Dùng núp bóp cao su hút không khí ở buồn hơi giã ra, cho màng cam tuột khỏi vỏ lụa Hình 18: Đục lỗ trên vỏ 9 Hình 19 : Tiêm Virus Đậu mùa vào màng cam, hướng tiêm lệch một góc 30 - 45 0 III. KỸ THUẬT KẾT TỦA KHUẾCH TAN TRÊN THẠCH 1. Mục đích Xem sự khuếch tán của kháng nguyên(kháng thể gà) và kháng thể(kháng thể thỏ) khuếch tán trên mặt thạch như thế nào ? 2. Chuẩn bị Kháng nguyên : là kháng thể gà Kháng thể : là kháng thể thỏ Chuẩn bị môi trường : 12,5gr Agar + 80gr NaCl + 5gr phenol trong 1 lít nước cất Hình 20: Đun môi trường trên bếp cách thủy Dùng vải lượt, lọc môi trường vừa nấu xong 10 [...]... Khi tiêm virus Đậu ở màng CAM không gây chết phôi, nhưng gây xuất huyết, phôi có màu đỏ tươi và virus này tạo nốt Pock trên màng CAM Còn tiêm virus Newcastle ở xoang niệu mô thì sau 24 giờ ấp trứng (sau khi tiêm) virus làm chết phôi Phôi đã chết nên không có màu đỏ tươi (Hình 6) 19 Hình 2: Tiêm ở xoang niệu mô làm phôi chết Nốt Pock trên màng CAM: Bệnh tích gây thủy thủng, dày lên tạo thành nốt pock... được ở màng lọc 0.22µm thực hiện kiểm tra phản ứng HA trên kính * Nếu mẫu làm phản ứng HA trên kính cho kết quả âm tính, tức virus trong huyễn dịch có kích thước lớn hơn 0.22µm * Nếu mẫu làm phản ứng HA trên kính cho kết quả dương tính, tức virus trong huyễn dịch có kích thước lớn hơn 0.22µm 6 Kết quả và thảo luận Quan sát phôi của trứng tiêm bệnh phẩm ở màng CAM màu đỏ tươi do virus Đậu gây xuất huyết... mô Thử nghiệm phản ứng HA trên kính Xác định kích thước của virus Newcastle 17 5.1 Phản ứng HA trên kính Phản ứng này dùng để xét nghiệm nhanh các virus Newcastle có khả năng gây ngưng kết hồng cầu của một số loài Chuẩn bị Huyễn dịch hồng cầu 10% Gốc virus Newcastle chuẩn làm đối chứng Lam kính Nước trứng Thời gian xảy ra phản ứng là 1 phút Thực hiện` Nước trứng ly tâm 1500- 3000 vòng/phút, lấy nước... với nước muối sinh lý, ly tâm Thực hiện thao tác này đến khi nào hồng cầu được rửa thậtt sạch (thường thực hiện thao tác ly tâm khoảng 3 – 4 lần) Lần cuối cùng loại bỏ phần nước trong bên trên, phần hồng cầu pha với nước muối sinh lý để được hồng cầu 1% 22 Hình 5: Hồng cầu 1% Tiến hành Cho nước muối sinh lý vào các hàng từ lỗ 1 đến 12, mỗi lỗ 50µl Cho thêm 50µl huyễn dịch virus vào lỗ thứ 1, trộn đều... HA trên kính và ghi nhận kết quả Lấy dịch nước đã lọc được ở màng lọc 0.45µm thực hiện kiểm tra bằng phản ứng HA trên kính, có 2 trường hợp xảy ra: + Nếu mẫu làm phản ứng HA trên kính cho kết quả âm tính, tức virus trong huyễn dịch có kích thước lớn hơn 0.45µm 18 + Nếu mẫu làm phản ứng HA trên kính cho kết quả dương tính, tức virus trong huyễn dịch có kích thước nhỏ hơn 0.45µm Ở trường hợp HA dương tính... nấm men Có rất nhiều ứng dụng quan trọng trong y học, cũng như trong di truyền, nhưng ứng dụng quan trọng nhất đó chính là chuẩn đoán bệnh tìm ra tác nhân gây bệnh, qua đó xóm đưa ra biện pháp can thiệp kiệp thời Được ứng dụng rất nhiều trong việc chuẩn đoán bệnh trên động vật Đặc biệt hiện nay một số bệnh quan trọng như virus heo tai xanh(PRRS ), hay virus vịt cúm gia cầm(H5N1),… II Quy trình ly trích... ẩm Thực hiện xong ta chuyển vào tủ ủ, ủ ở 370c, sau 48h để quan sát kết quả Bài 2 THAM QUAN CÔNG TY NAVETCO I Mục đích Học hỏi tìm hiểu thêm về quy trình sản xuất Vắc xin của công ty, và một số vấn đề liên quan về công ty Một số thiết bị và những ứng dụng Công nghệ sinh hocj vào sản xuất vắc xin được anh Tú nhiệt tình hướng dẫn Hai điểm mới và nỗi bật nhất , đáng quan tâm nhất đó là : cách nuôi Virus. .. hiện diện của virus Newcastle 20 Hình 4: Phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA) 21 Bài 2: Phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA: Haemagglutination) 1 Nguyên lý Trên bề mặt virus Newcastle có cấu trúc kháng nguyên haemagglutine, có khả năng kết hợp với các thụ thể trên bề mặt hồng cầu của loài gà, vịt… nên nó làm ngưng kết các loại hồng cầu này lại với nhau 2 Mục đích Xác định hiệu giá pha loãng mà ở đó virus còn khả... nước trứng lên lam sau đó nhỏ một giọt hồng cầu rồi trộn lẫn với nhau Quan sát Nếu có sự ngưng kết hồng cầu thì trong nước trứng có virus Newcastle, kết quả dương tính (+) và không có sự ngưng kết hồng cầu cho kết quả âm tính (-) 5.2 Xác định kích thước của virus Newcastle Thực hiện - Trước tiên lấy huyễn dịch nước trứng với HA (+) đem li tâm - Dùng kim tiêm hút lấy phần nước phía trên - Bơm kim tiêm... đọc kết quả Ta tiến hành 3 lần lặp lại 4 Kết quả Phản ứn HA dương tính: xảy ra ngưng kết hồng cầu ở: Hàng I: từ vị trí thứ 1 - 6 (n = 6), đóng nút tại vị trí thứ 7 Vậy hiệu giá pha loãng mà ở đó virus còn khả năng gây ngưng kết hồng cầu là 1/ 64 Hàng II: xảy ra hiện tượng “ nhảy cóc” Hàng III: từ vị trí thứ 1 - 8 ( n = 8), đóng nút tại vị trí thứ 9 Vậy hiệu giá pha loãng mà ở đó virus còn khả năng . nay một số bệnh quan trọng như virus heo tai xanh(PRRS ), hay virus vịt cúm gia cầm(H5N1),… II. Quy trình ly trích ARN cho bệnh PRRS, DNA cho bệnh Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) và chạy PCR 1.Chuẩn. nghiệm phản ứng HA trên kính Xác định kích thước của virus Newcastle 5.1. Phản ứng HA trên kính Phản ứng này dùng để xét nghiệm nhanh các virus Newcastle có khả năng gây ngưng kết hồng cầu của. tiêm ở xoang niệu mô - Khi tiêm virus Đậu ở màng CAM không gây chết phôi, nhưng gây xuất huyết, phôi có màu đỏ tươi và virus này tạo nốt Pock trên màng CAM. Còn tiêm virus Newcastle ở xoang niệu