 H   KHịAăLUNăCăNHÂNăSINHăHC  tài: NGHIểNăCUăKHăNNGăCăCHă DNA GYRASE CAăMTăSăDNăXUTă CHALCONăTNGăHP Khoa: CỌNGăNGHăSINHăHC Chuyên ngành: VI SINH _SHPT GVHD: PGS.ăTS.ăTrnăCátăông SVTH: NguynăThănhăChi MSSV: 1053010061 Khóa: 2010- 2014  Chí Minh - Tháng 6  LI CM N     hoàn thành    a c    , n thành . ThS - -  và giú. ThS, ThS              - - . Q            viên giúp  con        i CHăVITăTT ATCC American Type Culture Collection ATP Adenosin Triphosphat CFU Colony Froming Unit  CLSI Clinical Laboratory Standards Institute DMSO Dimethyl Sulfoxid DNA Desoxyribonucleic Acid EDTA Ethylendiamintetraacetic acid KS Kháng sinh LB Luria  Bertani MHA Muller  Hinton Agar MHB Mueller  Hinton Broth MIC Minimum Inhibitory Concentration  MRSA Methicillin  Resistant Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus kháng methicillin MSSA Methicillin  Sensitive Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus y methicillin OD Optical density VRSA Vancomicin  Resistant Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus kháng vancomicin SDS Sodium Dodecyl Sulfat SSB Single Stranded Binding TSA Tryptic Soy Agar TSB Tryptic Soy Broth    ii DANHăMCăHỊNH  3 Hình 1.2  3  4  8 Hình 1.5  9 Staphylococcus aureus 10 Staphylococcus aureus 10 E. coli  25   26  27 và E. coli 28 E. coli 28  MRSA, MSSA và E. coli 28 E. coli 29  trên gel agarose 30  31 Hình 3.10  31  32 se 33  34 DANHăMCăBNG  16  25  29    iii MC LC CH VIT TT i DANH MC HÌNH ii DANH MC BNG ii T V 1 CHNGă1. TNG QUAN 2 1.1. CHALCON 3 1.1.1.  3 1.1.2.  4 1.1.3.  4 1.1.4.  7 1.2. ENZYM DNA GYRASE (DNA TOPOISOMERASE II) 8 1.2.1.  8 1.2.2.  9 1.3. TNG QUAN V STAPHYLOCOCCUS AUREUS 10 1.3.1.  10 1.3.2.  11 1.3.3.  12 1.3.4.   12 CHNGă2. VT LIU 15 2.1. NG NGHIÊN CU 16 2.1.1.  16 2.1.2.  17 2.1.3.  17 2.1.4.  17 2.1.5.  18 2.1.6.  18 2.2. U 19 2.2.1.  19 2.2.2.  19 2.2.3.  20 2.2.4. Ly trích DNA plasmid 21 2.2.5.  22 2.2.6. Tt tính DNA gyrase 22 CHNGă3. KT QU VÀ BÀN LUN 24 3.1. NH TÍNH KH N 25    iv 3.2. NH N C CH TI THIU CA CÁC CHT TH VÀ KHÁNG SINH 26 3.3. KT QU TÁCH CHIT PLASMID 30 3.4. KT QU TINH SCH PLASMID 30 3.5. KT QU TH NGHIM KH C CH DNA GYRASE CA CHALCON 32 3.5.1.  32 3.5.2.  33 CHNGă4. KT LU NGH 38 4.1. KT LUN 39 4.2. KIN NGH 39 TÀI LIU THAM KHO 40    1 TăVNă Flavonoid là    ên phâ   ã   , có      [10, 27, 29, 31].     enzym DNA gyrase trong  DNA. Ngoài ra chalcon có  oxy hóa, trung hòa các  [7, 33].  tính  -  vòng      vòng benzen (vòng      vòng   pyridin, thiophen, furan vòng                  úng tô  "NghiênăcuăkhănngăcăchăDNA gyraseăcaămtăsădnăxutăchalcon tngăhp   DNA        ung  -  - DNA     2 CHNG 1. TNG QUAN    3 1.1. CHALCON 1.1.1. Tngăquanăvăchalcon Flavonoid t chu  C 6 C 3 C 6 hay nói vòng  carbon (Hình 1.1) [13]. A B Hình 1.1 Cuătrúcăflavonoidă(diphenylăpropan) Tùy th 3 C 6 C 3 C 6  chia thành 3 phân nhóm: eucoflavonoid, isoflavonoid, neoflav phân nhóm eucoflavonoid [6]. Chalcon có 2 vòng  vòng             vòng  vòng B, vòng  (Hình 1.2) Hình 1.2 CuătrúcăchalconăvƠăquyătcăđánhăsăcaăchalcon Trong các vòng  vòng  vòng (heterocyclic chalcon) [24].               vòng  flavanon, flavon, auron, benzothiazepin và pyrazolin (Hình 1.3) [19, 24].    4 Hình 1.3 Dnăchtădăvòng qua trung gian chalcon 1.1.2. Phnăngăđnhătính ch KOH vòng C  vòng A và B  [6].  2 SO 4 cid H 2 SO 4 khi n  [6].  3   [6].   dung  H + hoc OH -   . Tác d         5 trong CCl 4  vòng  5  2 SO 4 [6]. 1.1.3. Hotătínhăsinhăhcăcaăcácădnăxutăchalcon   [39],  [39, 41], kháng viêm [16, [...]... ENZYM DNA GYRASE (DNA TOPOISOMERASE II) 1.2.1 Trong quá trình sao chép, h DNA -> Protein SSB (single stranded binding protein) giúp cho DNA DNA vòng c và DNA Hình 1.4 [14, 22] DNA DNA topoisomerase II có tên là DNA gyrase DNA topoisomerase II t siêu n trái (- DNA DNA nucleotid Hình 1.5) [14, 22] 8 Hình 1.5 DNA eukaryote, DNA [14, 22] DNA gyrase 1.2.2 Ohemeng DNA Escherichia coli [34] Aiello và c DNA- ... phút DNA vòng o Ly tâm 13000 vòng Hòa trong Q1 21 Hòa TE0,1 -20oC 2.2.5 p Wizard® SV Gel and PCR Clean- - - - 95% trong chaotropic salt) DNA: vòng trong 1 vòng 13400 vòng Tách DNA: Thêm 50 µl 2dH2 Ly tâm 13400 vòng trong 1 phút 2.2.6 T DNA gyrase Enzym gyrase DNA tháo 22 enzym , khi có ATP o di trên gel agarose DNA gyrase - DNA gyrase 1X, 0,5 µg plasmid p1664 DNA gyrase - o C trong 30 phút DNA gyrase. .. Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Streptococcus faecalis nhóm mutans [7] gram Streptococcus [15] 6 chalcone '4-hydroxy-3-(3-ptolylacryloyl)-2H-chromen-2-one [21] ol [23] 1.1.4 DNA t DNA nucleotic DNA a các nucleotic, DNA gyrase giúp DNA vòng vòng DNA DNA gyrase [18] ng phân t iên c u rõ ràng chalcon quinoline E.coli, K.aerogenes, S typhimurium, S aureus, S pyogenes, và B subtilis quan acid LEU735,... pH 4,8: KOH 5M 60 ml 11,5 ml dH2O 28,5 ml DNA 17 ® SV Gel and PCR Clean- Up System (A9282) công ty Promega - Enzym gyrase (E coli), DNA gyrase 1X pH 7,5 - HCl 35 mM, KCl 24 mM, MgCl2 4 mM, DTT 2 mM, spermidin 5mM, 30 µg/ml tRNA, BSA 0,1 mg/ml, glycerol 6,5% bao Enzym gyrase (E coli DNA gyrase 1X pH 7,5 - HCl 35 mM, KCl 24 mM, MgCl2 4 mM, DTT 2 mM, ATP 1,75 mM, spermidin 5mM, 30 µg/ml tRNA, BSA 0,1 mg/ml,... amoxillin và 12,5% kháng getamicin [3] 1.3.4 h khác nhau [1]: chân lông, chân : 12 - Vi - - - - 13 - ng 14 15 2.1 2.1.1 Cá DNA gyrase : các chalcon - - Khoa ( 2.1) Kháng sinh ofloxacin (O8757- 1G) 2.1 Kí vòng Danh pháp Danh pháp OH HO 1-(2H1 hydroxyphenyl)- F16 3-(pyridin-2-yl)- -dihydroxychalcon O 2-propen-1-on 1-(2H2 hydroxyphenyl)3-(pyridin-3-yl)- 1-(pyridin-2-yl)-3P1 propen-1-on 2-propen-1-on 1-(furan-2-yl)-3-... Satorius - 2.1.6 - vòng MRSA, MSSA : 18 + u + - T DNA plasmid - DNA 2.2 P 2.2.1 o o C trong 2- 1-2x108 (CFU/ml) 2.2.2 - 30 phút que o - 5 phút cho 2% Hút 19 o C trong 16- vòng MIC) 2.2.3 -2x 107 (CFU/ml) - au: 1024; 512; 256; 128; 64; 32; 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25; 5; 0,25; 0,125 (µg/ml) - - 50o - tip Song s 35- 37oC trong 16- 20 hoàn 2.2.4 Ly trích DNA plasmid E coli mang plasmid pDG 1664 KS (+) LA... Candida albican, Bacillus DNA gyrase [14, 17, 25, 43] 9 1.3 STAPHYLOCOCCUS AUREUS 1.3.1 Hình thái Staphylococcus aureus gram - u nhau (Hình 1.6) Hình 1.6 Staphylococcus aureus gram (Hình 1.7) Hình 1.7 Hìn Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus S aureus có màu - 1,5 m vòng sá - 2TeO3 lethinase) [28, 40] 10 [28] S aureus S aureus H2 O2 H2 O + O 2 S.aureus S aureus [17] DNA S aureus [8] dòng S aureus... - 1024 µg/ml E coli 29 vòng iêu là So - , H1, P1 và T2 cephalosporins (32-64 µg/ml cefaclor, cefuroxime, cefprozil, loracarbef (MIC 32 µg/ml) 3.3 K Ly trích DNA E coli mang plasmid pDG 1664 KS (+) 1% Hình 3.8 : Hình 3.8) DNA chúng thu pl 3.4 K DNA PCR Clean- Promega 30 ... DMSO 4 MR MS MR E E 2 MS E 128 E 32 MS MR E 64 256 E E MS MR 128 E coli 16 MR 8 MS 1 MR MS MR MS E E T2 chalcon H1, T2 trên MR E MS E DMSO MR MS E E coli E: E coli; MR: MRSA; MS: MSSA 28 512 1024 256 E 64 E 32 MR E MS Hình 3.7 MR 8 MS MR E 2 MR MS E E 16 E 4 128 MR 1 MS E MR F16 MS E DMSO MS MR E MS E chalcon F16 E coli E: E coli; MR: MRSA; MS: MSSA 3.2 MIC (µg/ml) E coli MRSA MSSA P1 512 64 32 H1 512... 5hydroxychalcon (3-hydroxyphenyl)-2T2 propen-1-on 16 2.1.2 Các vi - Staphylococcus aureus - Staphylococcus aureus kháng methicillin ATCC 43300 (MRSA) - Escherichia coli ATCC 25922 2.1.3 - - Hinton Agar (MHA) - - Bertani (LB) 2.1.4 t plasmid Glucose 50mM EDTA 10mM Tris- Cl, pH 8 25mM - - SDS: NaOH 1M 2ml SDS 20% 0.5ml dH2O 7.5 ml - Ac (kali acetate) 5M, pH 4,8: KOH 5M 60 ml 11,5 ml dH2O 28,5 ml DNA 17 .   8 1.2. ENZYM DNA GYRASE (DNA TOPOISOMERASE II) 1.2.1. Tngăquanăv DNA gyrase Trong quá trình sao chép, h DNA ->  Protein.  cvà DNA  [14, 22]. Hình 1.4 Quáătrìnhătháoăxon DNA  DNA topoisomerase II có tên là DNA gyrase. DNA topoisomerase II  t. úng tô  " ;Nghiên cuăkhănngăcăch DNA gyrase caămtăsădnăxut chalcon tngăhp   DNA    