B GIÁO DC VÀ ÀO TO TRNG I HC M TP.HCM BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP  TÀI: KHO SÁT TÌNH TRNG METHYL HÓA TI CÁC O CpG THUC VÙNG PROMOTER CA GEN GSTP1 TRÊN MT S LOI UNG TH KHOA CÔNG NGH SINH HC CHUYÊN NGHÀNH: VI SINH-SINH HC PHÂN T Ging viên hng dn: PGS. TS. Lê Huyn Ái Thúy ThS. Lao c Thun Sinh viên thc hin: Võ Th Ngha MSSV: 1053010489 Khóa hc: 2010 - 2014 Tp. H Chí Minh, tháng 5 nm 2014 Báo Cáo Khóa Lun Tt Nghip GVHD: PGS. TS. Lê Huyn Ái Thúy Nm hc: 2010 - 2014 ThS. Lao c Thun SV: Võ Th Ngha i LI CM N  có đc bài báo cáo khóa lun nƠy thì đơy lƠ kt qu ca mt thi gian dài tìm hiu và thc hin đ tài, ngoài nhng n lc ca bn thân thì s giúp đ, hng dn ca các thy cô góp mt phn rt ln đ em có th hoƠn thƠnh đ tài này. Li đu tiên em xin chân thành cm n Cô_PGS.TS Lê Huyn Ái Thúy lƠ ngi đƣ đng tên hng dn em trong k khóa lun tôt nghip này, em xin chân thành cm n cô đƣ hng dn, góp Ủ đ em có th hoàn thành tt bài báo cáo. Em cng xin chơn thƠnh cm n Thy_ThS Lao c Thun là mt ngi thy, ngi anh luôn tn tình quan tơm vƠ giúp đ em trong thi gian qua, trong quá trình sa bài báo cáo cng nh trong quá trình thc nghim. ng thi em cng xin cm n các bn trong phòng thí nghim Sinh Hc Phân T cng nh tt c các bn, các em khóa 2011 trong nhóm nghiên cu khoa hc khoa Công Ngh Sinh Hc trng i Hc M Thành Ph H Chí Minh đƣ giúp đ em trong quá trình làm khóa lun cng nh chia s nhng khó khn trong sut quá trình va qua. Cui cùng, con xin gi li cm n đn gia đình đƣ lƠ ch da tinh thn, tip thêm cho con ngun đng lc rt ln trong nhng lúc khó khn khi lƠm đ tài khóa lun tt nghip này. Tuy nhiên, do hn ch v kin thc cng nh thi gian nên bài báo cáo khóa lun tt nghip không tránh khi nhng thiu sót. Vì vy, em rt mong nhn đc s đóng góp ý kin quý báu ca quý Thy, Cô đ em có th hoàn thin hn nhng hiu bit v chuyên đ này. Mt ln na xin chân thành cm n mi ngi. Kính chúc mi ngi tht nhiu sc khe, nim vui, thành công trong cuc sng và trong công vic! TP. H CHệ MINH, ngƠy 22 tháng 5 nm 2014 SV. Võ Th Ngha Báo Cáo Khóa Lun Tt Nghip GVHD: PGS. TS. Lê Huyn Ái Thúy Nm hc: 2010 - 2014 ThS. Lao c Thun SV: Võ Th Ngha ii MC LC DANH MC HÌNH v DANH MC BNG vii DANH MC CH VIT TT ix PHN 1. TNG QUAN V UNG TH 1.1 TNG QUAN V UNG TH 3 1.1.1 Tình hình ung th trên th gii 4 1.1.2 Tình hình ung th  Vit Nam 5 1.2 TNG QUAN V DU CHNG SINH HC (Biomarkers) 7 1.3 EPIGENETICS 9 1.3.1 Khái nim epigenetics 9 1.3.2 o CpG 10 1.3.3 Khái nim methyl hóa DNA 11 1.3.4 C ch gơy ung th do s methyl hóa DNA 13 1.4 TNG QUAN V GEN GSTP1 15 1.4.1 GST (glutathione S-transferases) 15 1.4.2 Gen GSTP1 (Glutathione S Tranferase P1) 15 1.4.3 C ch hot đng ca GSTP1 16 1.5 Các phng pháp phát hin s methyl hóa DNA 19 1.5.1 Phng pháp bin đi BSP (Bisulfide sequencing PCR) 19 1.5.2 Phng pháp Methylation Specific PCR (MSP) 19 PHN 2. VT LIU VÀ PHNG PHÁP NGHIÊN CU Báo Cáo Khóa Lun Tt Nghip GVHD: PGS. TS. Lê Huyn Ái Thúy Nm hc: 2010 - 2014 ThS. Lao c Thun SV: Võ Th Ngha iii 2.1 VT LIU 20 2.1.1 Khai thác c s d liu 20 2.1.2. Kho sát in vitro 21 2.2 PHNG PHÁP NGHIÊN CU 23 2.2.1 Khai thác c s d liu 23 2.2.2 Kho sát in silico 23 2.3 KHO SÁT IN VITRO 24 2.3.1 Tách chit DNA 24 2.3.2 Kim tra cht lng DNA thu nhn bng phng pháp đo quang ph 26 2.3.3 Bin đi bisulfide DNA 26 2.3.4 Phn ng MSP 27 2.3.5 in di trên gel agarose 29 PHN 3. KT QU VÀ THO LUN 3.1 KHAI THÁC D LIU 30 3.1.1 Thng kê s liu tn s Methyl hóa ca GSTP1 trên ung th vú 31 3.1.2 Thng kê s liu tn s Methyl hóa ca GSTP1 trên ung th c t cung 34 3.1.3 Thng kê s liu tn s Methyl hóa ca GSTP1 trên ung th tuyn tinlit 36 3.2 KT QU KHO SÁT IN SILICO 40 3.2.1 Trình t và các nhân t phiên mã ca gen 40 3.2.2 ánh giá thông s vt lý mi 43 3.3 KT QU THC NGHIM 49 3.3.1 Kt qu tách chit DNA 40 3.3.2 Kt qu phn ng MSP trên các mu DNA bnh phm ung th vú 50 Báo Cáo Khóa Lun Tt Nghip GVHD: PGS. TS. Lê Huyn Ái Thúy Nm hc: 2010 - 2014 ThS. Lao c Thun SV: Võ Th Ngha iv 3.4 MC  LIÊN QUAN TÍNH CHT METHYL HÓA TI VÙNG PROMOTER  GEN GSTP1 VI NHÓM TUI/  TUI CA CÁC BNH NHÂN UNG TH VÚ 54 3.5 MC  LIÊN QUAN TệNH CHT METHYL HịA TI VỐNG PROMOTER  GEN GSTP1 VI GIAI ON BNH CA CÁC BNH NHÂN UNG TH VÚ 54 3.6 KHO SÁT MC  LIÊN QUAN (T SUT CHÊNH - ODD RATIO - OR VÀ NGUY C TNG I - RELATIVE RISK - RR) GIA TệNH CHT METHYL HịA VI UNG TH VÚ 55 PHN 4. KT LUN VÀ  NGH 4.1 KT LUN 54 4.2  NGH 58 TÀI LIU THAM KHO 59 PH LC 67 Báo Cáo Khóa Lun Tt Nghip GVHD: PGS. TS. Lê Huyn Ái Thúy Nm hc: 2010 - 2014 ThS. Lao c Thun SV: Võ Th Ngha v DANH MC HỊNH Hình 1.1 T l mc bnh và t l t vong trên toàn th gii nm 2012 4 Hình 1.2 T l mc bnh và t vong vì ung th ca Vit Nam nm 2012 6 Hình 1.3 Methyl hóa DNA đc nghiên cu rng rƣi nh mt du chng sinh hc 8 Hình 1.4 S methyl hóa ca cytosine to thành 5-methylcytosine 10 Hình 1.5 S b sung nhóm -CH 3 vào v trí 5’ca cytosine nh enzyme DNMTs 12 Hình 1.6 Mô hình s bin đi gen bi methyl hóa DNA to khi u 13 Hình 1.7 C ch gơy ung th ca DNA methylation 14 Hình 1.8 V trí gen GSTP1 trên NST s 11 16 Hình 1.9 Chc nng ca protein GSTP1 trong t bào 17 Hình 1.10 Mô hình mô t tng tác ca GSTP1-JNK và GSTP1- TRAF2 trong con đng diu chnh tín hiu JNK và TNF- . 18 Hình 1.11 Biu đ tn s methyl hóa ca GSTP1 qua các loi mu ung th vú khác nhau 34 Hình 1.12 Biu đ tn s methyl hóa ca GSTP1 qua các loi mu ung th c t cung khác nhau 36 Hình 1.13 Biu đ tn s methyl hóa ca GSTP1qua các loi mu ung th tuyn tin lit khác nhau 39 Hình 1.14 V trí gen GSTP1 trên nhim sc th s 11[92] 40 Hình 1.15 Các đo CpG trên vùng promoter gen GSTP1 41 Hình 1.16 S phân b ca mt s yu t phiên mã trên gen GSTP1 42 Báo Cáo Khóa Lun Tt Nghip GVHD: PGS. TS. Lê Huyn Ái Thúy Nm hc: 2010 - 2014 ThS. Lao c Thun SV: Võ Th Ngha vi Hình 1.17 Cu trúc gen GSTP1 43 Hình 1.18 V trí bt cp ca mi methyl lên gen GSTP1 46 Hình 1.19 Kt qu Annhyb mi methyl GSTP1 trên vùng trình t kho sát 46 Hình 1.20 Kt qu đin di sn phm MSP vi cp mi methyl G1-M-F và G-M-R 50 Hình 1.21 Kt qu đin di sn phm MSP vi cp mi methyl G1-M-F và G-M-R 51 Hình 1.22 Kt qu gii trình t sn phm MSP ca gen GSTP1 52 Báo Cáo Khóa Lun Tt Nghip GVHD: PGS. TS. Lê Huyn Ái Thúy Nm hc: 2010 - 2014 ThS. Lao c Thun SV: Võ Th Ngha vii DANH MC BNG Bng 1.1 Tng kt tình trng ung th trên th gii 2012 5 Bng 1.2 Trình t mi methyl s dng cho MSP 28 Bng 1.3 Chu trình nhit cho phn ng MSP vi GSTP1 28 Bng 1.4 Tn s Methyl hóa ca gen GSTP1 trên mu ung th vú 31 Bng 1.5 Thng kê tn s methyl hóa trung bình có trng s ca GSTP1 trên ung th vú 33 Bng 1.6 Thng kê tn s Methyl hóa ca gen GSTP1 trên mu ung th c t cung 34 Bng 1.7 Thng kê tn s methyl hóa trung bình có trng s caGSTP1 trên ung th c t cung 35 Bng 1.8 Thng kê tn s Methyl hóa ca gen GSTP1 trên mu ung th tuyn tin lit . 36 Bng 1.9 Thng kê tn s methyl hóa trung bình có trng s caGSTP1 trên ung th tuyn tin lit 38 Bng 1.10 Trình t mi methyl tham kho t nghiên cu trc ca phòng thí nghim sinh hc phân t 45 Bng 1.11 Thông s vt lý ca mimethyl k tha ti phòng thí nghim sinh hc phân t đi hc M TP.HCM 45 Bng 1.12 Mi tham kho t các bài báo thng kê 47 Bng 1.13 Thông s đánh giá mi theo IDT 48 Bng 1.14 Nng đ và cht lng DNA tách chit 49 Báo Cáo Khóa Lun Tt Nghip GVHD: PGS. TS. Lê Huyn Ái Thúy Nm hc: 2010 - 2014 ThS. Lao c Thun SV: Võ Th Ngha viii Bng 1.15 Tng kt kt qu methyl hóa ca GSTP1 trên 10 mu ung th vú 53 Bng 1.16 Mc đ liên quan gia tính cht methyl hóa ti vùng promoter ca GSTP1 vi ung th vú 57 Báo Cáo Khóa Lun Tt Nghip GVHD: PGS. TS. Lê Huyn Ái Thúy Nm hc: 2010 - 2014 ThS. Lao c Thun SV: Võ Th Ngha ix DANH MC CH VIT TT CpG: Cytosine phospho guanine DNMTs: DNA methyltransferase DNMT1: DNA methyltransferase 1 DNMT3A: DNA methyltransferase 3A DNMT3B: DNA methyltransferase 3B IDT: Integrated DNA technology JNK: C-Jun N-terminal kinase GSH: glutathionine HDAC (Histone deacetylase ) MSP: Methylation Specific PCR PCR: Polymerase Chain Reaction SAM: S-adenosylmethionine UTR: Untranslated Region UV: Ultraviolet WHO: World Health Organization MBD: Methylation-binding protein TRDs: Transcription re-pression domains [...]... trong b gen, chúng tr i dài trên trình t gen và xen k v i các vùng không b methyl hóa, nh 0,5-3,0 kb, trung bình xu t hi n trên kho ng m i 100kb trên b ng v o CpG hi n di Khi gen tr c kho ng i [31, 17] trong ph n promoter c a gen [17 ,39 ,84] ng thì t i nh o CpG trên vùng promoter c a gen không b methyl hóa, ch nh ng phân nhóm riêng bi t t n vùng u tiên c a gen b methyl hóa Nh ng v nh n bi t c a các nhân... n nhóm methyl này x y ra sau quá trình sao chép c a DNA [24] Trên nh ng t bào ng có kho ng 3-6% cytosine là b methyl hóa, m m trong quá trình phát tri n c i i và s phát tri n c a b nh trên nh ng t bào khác nhau S methyl hóa c a các dinucleotide CpG không ph i là m t s phân b ng u nhiên trên b ng x thu c vùng promoter c a gen [36 methyl hóa, nh o CpG b o CpG ng có kho o CpG b ng n m trên vùng promoter. .. hi hóa DNA t mc ng methyl hóa trên DNA S methyl t vai trò quan tr ng trong vi gen, mô hình b ng d u ti t bi u hi n n nhi u b nh khác nhau [15, 32, 45, 77, 80] Khi s methyl hóa quá m c x y ra trên vùng promoter c a các gen c ch kh i u s d n nh ng ho Bi u hi n c a gen b ti iv chép c a gen s b gián ti ng b t n c a gen b ng nhi c ch riêng bi t, khác nhau [11, 12] tr c ti gián tr c ti p, khi m t gen b methyl. .. m trên vùng promoter c a các gen gi nhà (housekeeping gene) S methyl hóa quá m c x y ra trên các gen này d n c ch ho ng c a chúng [24, 32] Enzyme S-adenosylmethionine (SAM) có vai trò quan tr hóa t i methyl o CpG SAM là m t h các enzyme có tên là DNA Methyltranferase (DNMTs) Có b n lo i DNA methyltransferases (DNMTs), bao g m NDMT1, DNMT3A, DNMT3B và DNMT3L H m v th methyl hóa c a b i m soát là enzyme... i vùng promoter d n làm ng ng quá trình phiên mã [28, 53] Y u t HDAC ( cg n vào vùng DNA methyl hóa làm c ch quá trình phiên mã, s g n c a HDAC vào ic t phiên mã Nh ng gen vùng promoter Facter-TF) s tr ng thái không b methyl hóa quá m tr ng thái ho nh v t i vùng kh Hình 1.7 n s ti p c n c a các y u o CpG trên ng, y u t phiên mã (Transcription ng phiên mã c a gen [51] [61] 14 - 2014 Chú thích: (A) Gen. .. v i các t khóa epigenetics, DNA methylation, breast cancer, cervical cancer, Prostate cancer nh m thu th p thông tin, d li u bao g m nh ng thông tin t ng quan v t n s methyl hóa c t cung, n ti n li t, epigenetics, methyl hóa DNA, thu th p trình t c a gen GSTP1 thông qua mã s accession number NC_000011.10 c a nhi m s c th 11 2.2.2 Kh o sát in silico 2.2.2.1 Th ng kê t n s methyl hóa Th ng kê trung bình... nhi o CpG trong vùng promoter (B) Trong mô tuy n ti n li t kh e m nh, các y u t -1 và Sp-1 liên k t v i promoter và kích thích phiên mã (C) Trong b n ti n li o CpG b methyl hóa y, h qu c a methyl hóa DNA trên nh ng gen c ch kh i u là làm gi m s bi u hi n gen vì v kích ho t ho c g i là làm im l ng gen Hi ng im l ng này là do s ng c a quá trình gi m ái l c hay làm xóa b hoàn toàn kh n k t c a các y u... c a DNA v i các ch ng l i v i quá trình stress ssis [21] Bên c trong nh GSTP1 ng b methyl hóa trên nhi u lo i cao, bao g t i t n s methyl hóa t n ti n li t [50, 59, 62, 64, 70] Chính vì th vi c Kh o sát tình tr ng methyl hóa t thu c vùng promoter c a gen GSTP1 trên m t s lo thi t trong quá trình tìm ra d u ch ng sinh h c GSTP1 cho m t s lo i ung ng chính là lý do mà chúng tôi th c hi o CpG là r t c... phiên mã, nh m mb os ng c a gen o này b methy hóa v i t n s cao hi n di n trong các t bào ung [31, 17] thành 5-methylcytosine 10 - 2014 1.3.3 Khái ni m methyl hóa DNA Methyl hóa DNA là m t hi tri ng c a epigenetics x y ra trong quá trình phát ng c a t bào Nó là m t lo i bi n nhóm methyl (-CH3) i liên k t c ng hóa tr t c thêm vào v trí C5 c a Cytosine trong c p dinucleotide CpG nh xúc tác c a enzyme S-adenosylmethionine... thành công c a mô hình methyl hóa DNA DNMT3A và DNMT3B th c hi n de novo methyl hóa t c là ho t o ra các v trí methyl hóa m i Chúng ch u trách nhi m trong vi c thi t l p mô hình methyl hóa DNA trong quá trình hình thành giao t và phôi s m [3, 46, 52] 11 - 2014 Hình 1.5 -CH3 enzyme DNMTs [4] Các enzyme DNMTs là de novo khác gen Trong tham g quá ] 12 - 2014 Hình 1.6 [54] 1.3 s methyl hóa DNA t qu c a nhi . I HC M TP.HCM BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP  TÀI: KHO SÁT TÌNH TRNG METHYL HÓA TI CÁC O CpG THUC VÙNG PROMOTER CA GEN GSTP1 TRÊN MT S LOI UNG TH KHOA CÔNG NGH SINH. “Kho sát tình trng methyl hóa ti các đo CpG thuc vùng promoter ca gen GSTP1 trên mt s loi ung th”là rt cn thit trong quá trình tìm ra du chng sinh hc GSTP1 cho mt s loi ung. QUAN TÍNH CHT METHYL HÓA TI VÙNG PROMOTER  GEN GSTP1 VI NHÓM TUI/  TUI CA CÁC BNH NHÂN UNG TH VÚ 54 3.5 MC  LIÊN QUAN TệNH CHT METHYL HịA TI VỐNG PROMOTER  GEN GSTP1 VI