B GIÁO DC VÀ ÀO TO TRNG I HC M TP. H CHÍ MINH BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP Tên đ tài: Kho sát s n đnh chng E.coli và Bacillus cereus trên nn mu và điu kin bo qun khác nhau. KHOA CÔNG NGH SINH HC CHUYÊN NGHÀNH: VI SINH ậ SINH HC PHÂN T GVHD: Th.S Nguyn Vn Hòa Th.S Trn Th Ánh Nguyt SVTH: Nguyn Kim Hoàng MSSV: 1053012253 Khóa: 2010 ậ 2014 Tp. H Chí Minh, tháng 05 nm 2014 Kho sát s n đnh ca E.coli và Bacillus cereus trên nn mu và các điu kin bo qun khác nhau. 2 LI CM N u tiên em xin gi li cm n chân thành đn thy Nguyn Vn Hòa, thy Nguyn Vn Minh, cô Dng Nht Linh, cô Phm Vân An, ThS. Trn Th Ánh Nguyt, ThS. V Diu Thu, ThS. Chu Nguyên Thanh và CN. Nguyn Th Ngc Thùy đã tn tình hng dn, giúp đ em trong sut thi gian thc tp và khóa lun tt nghip. Em xin cm n Ban giám đc Trung tâm k thut tiêu chun đo lng cht lng 3 - QUATEST 3 và các nhân viên Phòng Vi sinh - GMO đã luôn to điu kin tt nht, truyn đt các kin thc khoa hc và kinh nghim qúy báu cho em đ em có th t tin cho công vic trong tng lai. Cui cùng, em xin cm n Ban giám hiu Trng i hc M Thành ph H Chí Minh, các thy cô Khoa Công Ngh Sinh Hc cùng gia đình và các bn sinh viên lp Công Ngh Sinh Hc khóa 010 đã ht lòng quan tâm h tr, tn tâm dy d và đng viên em đ em hoàn thành tt khóa lun tt nghip này. Thành ph H Chí Minh, tháng 05 nm 2014 Sinh viên Nguyn Kim Hoàng Kho sát s n đnh ca E.coli và Bacillus cereus trên nn mu và các điu kin bo qun khác nhau. 3 MC LC T VN  6 Mc tiêu 6 PHN 1: TNG QUAN 7 1.1. Tng quan v Trung tâm k thut tiêu chun đo lng cht lng 3 - QUATEST 3 7 1.1.1. Gii thiu chung v Trung tâm 7 1.1.2 Phòng vi sinh & GMO 11 1.2. i cng v Bacillus cereus và Escherichia coli 11 1.2.1 i cng v Bacillus cereus 11 1.2.2. i cng v Escherichia coli 16 PHN 2: VT LIU VÀ PHNG PHÁP NGHIÊN CU 21 2.1. Thi gian vƠ đa đim thc hin 21 2.2. Vt liu 21 2.2.1. Thit b và dng c 21 2.2.2. Hóa cht vƠ môi trng 21 2.2.3. Vt liu thí nghim 21 2.3. Phng pháp thc hin 22 PHN 3: KT QU NGHIÊN CU VÀ THO LUN 35 3.1. Kt qu kim tra đ nhim khun ca mu 35 3.2. Kt qu tng sinh chng vi sinh vt 35 3.3. Kho sát s n đnh ca Bacillus cereus trên nn mu go 36 3.4. Kho sát s n đnh ca Escherichia coli trên nn mu rau sy 40 PHN 4: KT LUN VÀ  NGH 43 4.1. Kt lun 43 4.2.  ngh 43 TÀI LIU THAM KHO 44 PH LC 46 Kho sát s n đnh ca E.coli và Bacillus cereus trên nn mu và các điu kin bo qun khác nhau. 4 DANH SÁCH CÁC CH VIT TT 1) AOAC: Association of Official Analytical Chemists 2) B.cereus: Bacillus cereus 3) DSM: Difco Sporulation Medium 4) E.coli: Escherichia coli 5) EMB: Eosin Methylene Blue Lactose 6) GMO: Genetically Modified Organism 7) IEC: The International Electrotechnical Commission 8) ISO : International organization for standardization 9) LT: Heat Labile 10) MYP: Mannitol-egg-yolk-polymyxin 11) PCA: Plate count agar. 12) ST: Heat Stable 13) TBSD: T bƠo sinh dng 14) TBX: Tryptone-bile-glucuronic medium 15) TCVN: Tiêu chun Vit Nam 16) TSB : Trypticase (tryptic) soy broth 17) VSV: Vi sinh vt Kho sát s n đnh ca E.coli và Bacillus cereus trên nn mu và các điu kin bo qun khác nhau. 5 DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIU  Hình 1: Vi khun Bacillus cereus. Hình 2: Bào t Bacillus cereus chp di kính hin vi đin t. Hình 3: Cu trúc bào t chng B. cereus S69 không hot đng quan sát di kính hin vi đin t. Hình 4 :Bào t Bacillus cereus chp di kính hin vi 100X. Hình 5: Vi khun Escherichia coli. Hình 6: Kt qu th nghim IMViC ca Escherichia coli. Hình 7: Mu go sau khi sy khô. Hình 8: Khun lc Escherichia coli trên mô trng TBX. Hình 9: Khun lc ca Bacillus cereus trên MYP. Hình 10: Khun lc Bacillus cereus có vòng phân gii hng cu trên thch máu. Biu đ 3.1: Kt qu mt đ bào t Bacillus cereus trên môi trng TSB  các nhit đ 20 o C, 30 o C, 41,5 o C ti các thi đim khác nhau. Biu đ 3.2: Kt qu mt đ bào t Bacillus cereus trên môi trng DSM  các nhit đ 20 o C, 30 o C, 41,5 o C ti các thi đim khác nhau. DANH SÁCH CÁC BNG Bng 3.3.1: Mt đ chng Bacillus cereus sau khi bo qun (CFU/g). Bng 3.3.2: Mt đ bƠo t Bacillus cereus sau khi bo qun (CFU/g). Bng 3.4: Mt đ chng Escherichia Coli sau khi bo qun (CFU/g). Kho sát s n đnh ca E.coli và Bacillus cereus trên nn mu và các điu kin bo qun khác nhau. 6 T VN  Vi sinh vt lƠ các c th sng vô cùng nh bé có các đc tính sinh lí, sinh hóa khó n đnh qua thi gian dài. Các vi sinh vt có th phát trin mnh hn hoc b cht đi do tác đng ca các điu kin bo qun, vn chuyn, yu t ngoi cnh khác nhau. Vì vy, vic to ra mt mu chun (reference material) có cha mt đ vi sinh vt n đnh trong thi gian dài là rt khó khn.  chính xác ca các kt qu phân tích và thao tác ca k thut viên là ht sc quan trng trong các nghiên cu khoa hc công ngh cng nh trong kim tra, đánh giá cht lng sn phm. Trên thc t, có rt nhiu phòng thí nghim vi sinh rt cn các mu chun có cha vi sinh vt mc tiêu có mt đ n đnh. Các mu chun này s giúp các phòng thí nghim có th t kim tra tay ngh ca nhân viên, nâng cao hiu qu kim soát cht lng, kim soát quy trình thí nghim, kim tra giá tr s dng ca phng pháp th nghim và chng minh nng lc k thut ca phòng thí nghim đi vi các bên quan tâm. Hin nay, trên th trng, các rt nhiu nhà cung cp các mu chun vi sinh (APLAC, CMS, LGC,ầ) nhng vi giá c khá cao (khong 6,5 triu/mu). Vn đ nƠy gơy khó khn cho các phòng thí nghim đ thc hin công tác đm bo cht lng. VƠ đơy cng lƠ đòi hi ca c quan qun lỦ nhƠ nc trong vic công nhn phòng th nghim, phòng xét nghim và phòng thí nghim theo ISO/IEC 17025. T nhu cu trên, tôi xin tin hƠnh đ tƠi “Kho sát s n đnh ca ca E.coli và Bacillus cereus trên nn mu và điu kin bo qun khác nhau.”.  tài nhm xây dng các mu th cha vi sinh vt mc tiêu cho chng trình kim tra đánh giá tay ngh ca kim nghim viên hoc s dng làm mu kim soát cht lng phc v quá trình kim soát quy trình phân tích ti phòng thí nghim.  tài thc hin trên E.coli và Bacillus cereus.  Mc tiêu Kho sát s n đnh ca ca E.coli và Bacillus cereus trên nn mu vƠ điu kin bo qun khác nhau. Kho sát s n đnh ca E.coli và Bacillus cereus trên nn mu và các điu kin bo qun khác nhau. 7 PHN 1: TNG QUAN 1.1. Tng quan v Trung tâm k thut tiêu chun đo lng cht lng 3 - QUATEST 3 [17]: 1.1.1. Gii thiu chung v Trung tâm QUATEST 3 là t chc khoa hc công ngh thuc Tng cc Tiêu chun o lng Cht lng ậ B Khoa hc và Công ngh, đc thành lp t tháng 5 nm 1976 trên c s Vin nh chun Quc gia trc đơy. QUATEST 3 áp dng h thng qun lý cht lng theo tiêu chun ISO 9001; lnh vc thí nghim đc công nhn phù hp vi tiêu chun ISO/IEC 17025, lnh vc giám đnh hàng hóa đc công nhn phù hp vi ISO/IEC 17020, lnh vc chng nhn sn phm đc công nhn phù hp vi ISO/IEC Guide 65 và lnh vc t vn, đƠo to đc chng nhn phù hp vi ISO 9001. Qua 30 nm hot đng, QUATEST 3 đư đc bit đn nh mt đn v hƠng đu ti Vit Nam trong lnh vc cung cp dch v k thut v tiêu chun, đo lng và cht lng. QUATEST 3 có đi ng chuyên viên, k thut viên đc đƠo to chuyên sâu và có nhiu kinh nghim, h thng phòng thí nghim vi trang thit b hin đi theo chun mc quc t. Vi n lc nơng cao nng lc k thut ca các phòng th nghim đ đc tha nhn quc t và khu vc, Phòng Th nghim Vi sinh - GMO ca QUATEST 3 đc các nc ASEAN chn là phòng th nghim đi chng (ASEAN Reference Laboratory ậ ARL) theo chng trình EC - ASEAN và Phòng Th nghim in đc các nc ASEAN tha nhn kt qu th nghim đi vi các sn phm đin gia dng theo tha thun tha nhn ln nhau trong lnh vc th nghim đin vƠ đin t ( ASEAN EE MRA). Ngoài ra, QUATEST 3 đang trin khai chng trình m rng s tha nhn ca khu vc và quc t cho các lnh vc th nghim khác. Các lnh vc hot đng chính ca trung tâm:  Dch v th nghim Các phòng th nghim ca QUATEST 3 đu đc công nhn phù hp vi tiêu chun ISO/IEC 17025, phòng th nghim thc phm và phòng th nghim vi sinh- Kho sát s n đnh ca E.coli và Bacillus cereus trên nn mu và các điu kin bo qun khác nhau. 8 GMO cng đc công nhn bi t chc công nhn ca Na Uy (Norway Accreditation Body). Các lnh vc th nghim chính bao gm: - C khí và không phá hy - Hàng tiêu dùng -  g gia dng - Vt liu xây dng - in & đin t - Tng thích đin t - Hóa cht - Môi trng - Du khí - Thc phm - Vi sinh - sinh vt bin đi gen  Dch v đo lng QUATEST 3 cung cp dch v đo lng trong các lnh vc: -  dài - Khi lng - C - Dung tích-Lu lng - in - Nhit - Hoá lý  Dch v giám đnh i tng giám đnh s phù hp bao gm: - Hàng hóa - Công ngh - Môi trng - Công trình - An toàn công nghip Kho sát s n đnh ca E.coli và Bacillus cereus trên nn mu và các điu kin bo qun khác nhau. 9  Kim tra: - Thép tròn cán nóng và thép d ng lc, - M bo him cho ngi đi xe máy - Xng, du diesel -  chi tr em - Thc phm, ph gia, nguyên liu, cht h tr ch bin thc phm và bao bì thc phm - Thy sn, sn phm thy sn - Thc n gia súc, nguyên liu thc n gia súc, phơn bón, thuc bo v thc vt - Dơy đin bc nha PVC, sn phm đin gia dng - Ximng Pooc lng các loi, tm lp fibro-ximng, dm bêtông ct thép ng lc trc PPB - Sn phm bo h lao đng  Chng nhn Hot đng chng nhn sn phm ca QUATEST 3 đc công nhn phù hp vi chun mc quc t ISO/IEC Guide 65. QUATEST 3 là t chc chng nhn (bên th ba) thc hin vic chng nhn s phù hp ca sn phm vi tiêu chun quc gia, tiêu chun quc t hoc quy chun k thut trong nhiu lnh vc: đin - đin t, c khí, hóa cht, xây dng, hàng tiêu dùng, du, khí, thc phm, rau an toàn sn xut theo quy trình VietGAP Du chng nhn ca QUATEST 3 xác nhn sn phm đáp ng yêu cu v cht lng và an toàn, to thun li cho doanh nghip nơng cao uy tín thng hiu, tham gia đu thu, đa sn phm ra th trng đng thi là du hiu giúp ngi tiêu dùng la chn khi mua sn phm.  Dch v t vn Vi đi ng hn 40 chuyên gia t vn có nhiu nm kinh nghim đc đƠo to chuyên sâu trong nc vƠ nc ngoƠi trong lnh vc qun lý cht lng, môi trng vƠ an toƠn, QUATEST 3 đư cung cp dch v t vn h thng qun lý cho gn 1000 t chc, doanh nghip và tr thành mt trong nhng đn v hƠng đu trong nc v Kho sát s n đnh ca E.coli và Bacillus cereus trên nn mu và các điu kin bo qun khác nhau. 10 cung cp dch v t vn các h thng quán lý. Hu ht các chuyên gia t vn ca QUATEST 3 đu có chng ch chuyên gia đánh giá bên ngoƠi ca IATCA (Hip hi công nhn vƠ đƠo to đánh giá viên quc t) hoc IRCA (t chc chng nhn chuyên gia đánh giá viên quc t). H thng qun lý cht lng ca QUATEST 3 cho hot đng t vn đc chng nhn phù hp vi tiêu chun ISO 9001. QUATEST 3 cung cp dch v t vn cho các t chc, doanh nghip mun xây dng và áp dng các h thng qun lý: Cht lng - ISO 9001, Môi trng - ISO 14001, An toàn thc phm - ISO 22000, An toàn thông tin - ISO/IEC 27001, Qun lý phòng thí nghim - ISO/IEC 17025, An toàn sc khe ngh nghip - OHSAS 18001, Trách nhim xã hi - SA 8000 và mt s h thng qun lý chuyên ngành khác nh: HACCP, GMP, GLP hoc áp dng các công c ci tin nng sut - cht lng nh: 5S, SPC, COQ, Kaizen, TQM, TPM, QCC, QFD, Benchmarking  Dch v đƠo to bao gm: - Ơo to v h thng qun lý - Ơo to công c ci tin nng sut - cht lng - Ơo to nghip v tiêu chun đo lng cht lng - Ơo to k thut thí nghim - Ơo to chuyên gia t vn  Thông tin vƠ tiêu chun QUATEST 3 cung cp thông tin và các tài liu liên quan đn tiêu chun, đo lng, cht lng theo yêu cu cu t chc, doanh nghip và cá nhân: - Các tiêu chun Vit Nam (TCVN) - Các quy chun k thut trong nc (QCVN) - Các tiêu chun nc ngoƠi: JIS, GOST, BS, IS, AS, DIN, NF, ANSI, KSầ - Các tiêu chun quc t: ISO, IEC, CODEX, OIMLầ - Các tiêu chun ca các hip hi chuyên ngành: ASTM, AOAC, AOCS, APHA, ASME, API, AWS,ầ - Các tp chí hoc tài liu chuyên ngành khác.  Mư s - mư vch [...]... mL u d ch ng 350C trong 48 ± 2 gi c k t qu 26 Kh o sát s nh c a E.coli và Bacillus cereus trên n n m khác nhau c 3: ng VSV m c tiêu nh m t nh m u ki n b o qu n ch ng ch ng Bacillus cereus: th c hi ng và bào t Bacillus cereus và ng m t Ch ng Bacillus cereus ng Bacillus cereus: [2,3,6] trong ng nghi m 350C ng TSB trong 24 gi Th c hi ng m t ng Bacillus cereus sau 24 gi sinh b m khu n l c Pha loãng d ch... cho vào ng nghi m vô trùng, th c hi n ki m tra m t Bacillus cereus các th bào t m ngày 0, ngày th 3, ngày th 4, ngày th 5, ngày th 6, ngày th 7 t khi b o bào t Bacillus cereus 10 mL 10 mL Ch ng Bacillus cereus sau khi Nuôi c y trong máy l c 150 vòng/ phút nhi các khác nhau X lý nhi t 75oC/15 phút và ki m tra m bào t Bacillus cereus các th i m khác nhau 29 Kh o sát s nh c a E.coli và Bacillus cereus trên. .. 15 Kh o sát s nh c a E.coli và Bacillus cereus trên n n m khác nhau Hình 4 : Ngoài gây ng B .cereus c th c ph m B .cereus còn gây b nh viêm n i nhãn sau ch d ng h p c t hi c hi u nh ng m mi n d ch và m t s b nh khác B .cereus trong nh ng nguyên nhân gây viêm vú và s y thai 1.2.2 m n m t kh u tr k p th i Vi c nhi m B .cereus ib u ki n b o qu n t gia súc, và m t s b nh khác Escherichia coli [1,2] E.coli là... 24 Kh o sát s nh c a E.coli và Bacillus cereus trên n n m khác nhau u ki n b o qu n ng t ng s vi khu n hi u khí b m khu n l c i v i m u g o: Tr n chung 1 mL 1 mL 10-1 1 mL vào m 10-2 1 mL 1 mL 10-3 1 mL 15 mL d ch m u v 1 mL 1 mL ng PCA, tr u ng 350C trong 48 ± 2 gi c k t qu 25 Kh o sát s nh c a E.coli và Bacillus cereus trên n n m khác nhau u ki n b o qu n i v i m u rau: 1 mL 1 mL 10-1 1 mL vào m 1... và Bacillus cereus trên n n m khác nhau u ki n b o qu n Log(CFU/ml) 8 7 6 20 20oCoC 5 4 30oC C 30o 3 2 41,5oCC 41,5o 1 0 0 3 Bi 4 3.2: K t qu m T hai bi nhi u K t lu n môi bào t Bacillus cereus trên 2 môi ng TSB iv bào t ng TSB, m bào t Bacillus cereus b ng DSM, m m kh o sát có m các t nhanh trong kho ng th i gian kh o sát ( 30oC và 41,5oC m iv ng DSM ng DSM có m bào t Bacillus cereus Ngày m khác nhau. .. qu n vào 3.2 K t qu ng vi sinh v t: i v i ch ng Bacillus cereus: T ng Bacillus cereus K t qu ng Bacillus cereus Bacillus cereus m nh m ch ng: D ch khu n là 2,6 x 106 CFU/mL Bào t Bacillus cereus: Log(CFU/ml) 8 7 6 o 20 20oC C 5 4 30oCC 30o 3 41,5 41,5oCC o 2 1 Ngày 0 -1 0 3 Bi 4 3.1: K t qu m các nhi 5 6 bào t Bacillus cereus 20oC, 30oC, 41,5oC t i các th 7 ng TSB m khác nhau 35 Kh o sát s nh c a E.coli. .. ph n c n vào dung d ch Skim milk 10% 32 Kh o sát s M nh c a E.coli và Bacillus cereus trên n n m khác nhau u ki n b o qu n bào t Bacillus cereus c y vào m u g c khi th c hi n b o qu n là 2 x 105 CFU/mL c ti p theo th c hi iv it ng Bacillus cereus i v i ch ng Escherichia coli: th c hi n trên m u rau s y Dung d ch b o qu n ch ng Escherichia coli là dung d ch Skim milk 10% Cân 1 g m u rau s y vào ng vô... o sát s nh c a E.coli và Bacillus cereus trên n n m khác nhau c 5: ng m u ki n b o qu n ch ng vi sinh v t cho các m u sau b o qu n i v i ch ng Bacillus cereus -500C, l y ng u nhiên 15 m Ngay sau khi ti ng Bacillus cereus và ki m tra s ng nh t gi a các m u M vô trùng và ngâm 30 phút trong 90 mL dung d c n tráng m c khi ngâm l y h t các vi khu n còn bám trên thành ng Sau khi ngâm, th c hi 1 c cho vào... o sát s nh c a E.coli và Bacillus cereus trên n n m khác nhau u ki n b o qu n ng bào t Bacillus cereus ng Bacillus cereus ng TSB trong 24 gi Chuy n 10mL d ch khu n Bacillus cereus tinh ch a 100mL m i lo 35oC i bình th y ng TSB và DSM (Difco Sporulation Medium) [12] Ti p t phút o bào t cho các bình này trong máy l c 150 vòng/ các nhi 20oC, 30oC, 41,5oC Sau khi nuôi c y t i các nhi khác nhau, l y t m... ng Bacillus cereus: th c hi n b o qu n trên m u g o 21 Kh o sát s nh c a E.coli và Bacillus cereus trên n n m khác nhau u ki n b o qu n i v i ch ng Escherichia coli: th c hi n b o qu n trên m u rau c i ng t s y s n 2 th c hi n Quy trình chung: B c1 Thu nh n và kh trùng m ng thích h p t Ki B ng VSV trên môi u ng ch ng g c B vô trùng c a m u nh m c2 ch ng Cân m u vào các ng vô trùng Hút 1mL ch ng cho vào . - EHEC (Enterohemorrhagic E. coli) : E. coli gây xut huyt  rut. - EPEC (Enteropathogenic E. coli) : E. coli gây bnh đng rut - ETEC (Enterotoxigenic E. coli) E. coli sinh đc t rut. Kho sát. hin trên E. coli và Bacillus cereus.  Mc tiêu Kho sát s n đnh ca ca E. coli và Bacillus cereus trên nn mu vƠ điu kin bo qun khác nhau. Kho sát s n đnh ca E. coli và Bacillus. Sporulation Medium 4) E. coli: Escherichia coli 5) EMB: Eosin Methylene Blue Lactose 6) GMO: Genetically Modified Organism 7) IEC: The International Electrotechnical Commission 8) ISO : International