BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC  ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT GÂY RỐI LOẠN NỘI TIẾT LÊN DAPHNIA MAGNA Ngành: Công nghệ Sinh học Mã ngành: 111 GVHD: ThS. VÕ THỊ KIỀU THANH SVTH : NGUYỄN DUY TÂN LỚP :06DSH MSSV:106111029 -Tp.HCM, tháng 7 năm 2010- LỜI CẢM ƠN Để có những kiến thức quý báu, để có thể hoàn thành tốt đồ án này, em xin chân thành cám ơn các Thầy Cô đã tạo mọi điều kiện và truyền đạt những kiến thức quý báu trong suốt 4 năm học đại học. Em xin chân thành cám ơn cô Võ Thị Kiều Thanh đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu để em hoàn thành tốt đề tài này. Con xin khắc ghi công ơn to lớn của ba mẹ đã dạy bảo, ủng hộ và tạo mọi điều kiện để cho con học tập tốt nhất. Cám ơn các bạn ở Viện Sinh học Nhiệt Đới đã giúp đỡ và đóng góp ý kiến cho tôi trong suốt thời gian tôi làm đồ án này. Cám ơn các bạn 06DSH đã luôn bên tôi, chia sẽ và giúp đỡ tôi trong suốt quãng đường đại học. Sinh viên thực hiện Nguyễn Duy Tân CÁC CHỮ VIẾT TẮT CNBĐSH: Công nghệ biến đổi Sinh học DNA: Deoxyribonucleid acid RNA: Ribonucleid acid BOD: Biochemical Oxygen Demand COD: Chemical Oxygen Demand DO: Dissolved Oxygen Eds: Endocrine disruptors ECDs: Endocrine disrupting chemical substances D. magna: Daphnia magna Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Võ Thị Kiều Thanh SVTH: Nguyễn Duy Tân 1 Chương 1: MỞ ĐẦU Ô nhiễm môi trường nói chung và nước thải nói riêng đang là một vấn đề thời sự thu hút rất nhiều sự quan tâm của các cơ quan chức năng và người dân. Hầu hết các nhà máy trên khắp thế giới hiện nay thường xử lý nước thải theo nguyên tắc “xả thẳng hay đổ bỏ”, dẫn đến việc nước thải không được qua xử lý hay xử lý rất sơ sài được thải ra môi trường một cách tràn lan. Nó không những làm ô nhiễm nguồn nước ở các kênh rạch, ao hồ,… tiêu diệt dần dần các hệ sinh vật trong nước, mà nó còn thấm vào gây ô nhiễm các mạch nước ngầm làm thiếu nước sạch cho sinh hoạt và sản xuất. Ở Việt Nam, tình hình ô nhiễm nguồn nước do các nhà máy gây ra càng ngày càng nghiêm trọng, làm cho số lượng các ao hồ bị ô nhiễm đang tăng đến mức báo động. Thậm chí nhiều nơi còn rơi vào tình trạng không thể phục hồi, không một loài thủy sinh nào có thể sống được như: kênh Nhiêu Lộc ở thành phố Hồ Chí Minh, sông Thị Vải ở Đồng Nai,… Các số liệu quan trắc chất lượng nước ở nước ta thông thường chỉ chú ý đến các yếu tố lý hóa như giá trị pH, COD, BOD, NH 4 , một số kim loại nặng (Cu, Zn, Cadium…), một số thuốc trừ sâu… nhưng chưa có nghiên cứu đánh giá về nồng độ của chất gây rối loạn hệ nội tiết hiện diện trong nguồn nước. Chất gây rối loạn nội tiết (Endocrine disruptors hay Endocrine disrupting chemical substances), viết tắt là EDs hay ECDs, là những chất có thể tồn tại trong đất, nước, không khí, khi xâm nhập vào cơ thể chúng làm rối loạn chức năng của hệ nội tiết gây tác động ảnh hưởng đến sức khỏe của người và động vật. Qua các tài liệu nghiên cứu đã cho thấy những hợp chất này có thể là nguyên nhân gây ra các bệnh ung thư ở người, làm giảm lượng tinh trùng ở nam giới, ung thư vú ở phụ nữ, gây quái thai,… Đối với hệ động vật Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Võ Thị Kiều Thanh SVTH: Nguyễn Duy Tân 2 dưới nước có thể gây ảnh hưởng với nồng độ rất thấp (ng/l), làm biến đổi hình dạng và biến đổi giới tính ở cá… Trong những nghiên cứu gần đây của phòng CNBĐSH (ThS. Lê Thị Ánh Hồng) đã xây dựng phân tích được nồng độ chất gây rối loạn nội tiết và phân tích được nồng độ chất gây rối loạn nội tiết trên hệ thống kênh rạch Tp.HCM. Nhưng chúng tôi chưa đi sâu nghiên cứu ảnh hưởng của chất gây rối loạn nội tiết, đại diện là 17α-Ethynylestradiol và 17β-Estradiol lên thủy sinh động vật, cụ thể là Daphnia magna. Daphnia magna là thực phẩm của ấu trùng tôm, cá và là loài được sử dụng trong thử nghiệm độc tính đã được tiêu chuẩn hóa quốc tế, do đó được xem là loài có liên quan đến sinh thái cho việc ứng dụng để đánh giá chất gây rối loạn nội tiết trong môi trường. Vì những lý do đã nêu trên, chúng tôi xây dựng đề tài “Khảo sát sự ảnh hưởng của chất gây rối loạn nội tiết lên Dapnnia magna” để tìm hiểu sự ảnh hưởng của chất gây rối loạn nội tiết lên số lượng sống sót, sự phát triển và sự sinh sản của Daphnia magna. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Võ Thị Kiều Thanh SVTH: Nguyễn Duy Tân 3 Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tổng quan về chất gây rối loạn nội tiết [16],[25] 2.1.1. Khái niệm về hormone Hormone là các chất hóa học do các tế bào hay nhóm tế bào tiết trong cơ thể người và động vật sản sinh ra, được vận chuyển trong máu hay dịch não tủy đến điều khiển, đều hòa hoạt động của các tế bào hay các cơ quan nơi có các cơ quan thụ cảm hormone (hormone receptor). Sự kết hợp hormone và receptor mang tính đặc hiệu cao (tương tự khi ta muốn mở cửa phải dùng đúng chìa khóa vậy) và dẫn đến những quá trình sinh lý đặc thù cho mỗi loại hormone trong cơ thể. Để phát huy được tác dụng, các hormone phải kết hợp được với các receptor của chúng. Ví dụ: hormone sinh dục estrogen (chủ yếu do buồng trứng và nhau thai tiết ra) được vận chuyển đến kết hợp với receptor tại nhiều cơ quan như tử cung, âm đạo, tuyến vú, mô mỡ,… có tác dụng duy trì các đặc điểm sinh dục của phụ nữ, các động vật cái và chức năng của các cơ quan trong hệ sinh dục, quy định các đặc tính liên quan đến sự khác biệt giới tính của các quá trình sinh lý, sinh hóa trong cơ thể. 2.1.2. Khái niệm về Estrogen Estrogen là một loại hormone do một số cơ quan sinh dục nữ tiết ra. Đó là từ tế bào vỏ trong và tế bào hạt của nang noãn (hay nang trứng), thể vàng (hay còn gọi là hoàng thể) và nhau thai. Các thành phần này đều nằm ở buồng trứng, riêng nhau thai có ở tử cung trong thời kỳ có thai. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Võ Thị Kiều Thanh SVTH: Nguyễn Duy Tân 4 Estrogen tồn tại tự nhiên trong cơ thể ở ba dạng: 17β-estradiol (ký hiệu E2), estrone và estriol. Trong đó 17β-estradiol là estrogen được bài tiết nhiều nhất và có tác dụng sinh học mạnh nhất. Còn estriol là estrogen yếu nhất, nó là dạng chuyển hóa của 17β-estradiol và estrone. Cả ba loại đều có bản chất hóa học là steroid được tổng hợp từ cholesterol. Estrogen trong máu lưu hành dưới 3 dạng: dạng tự do (là dạng hoạt động), dạng gắn với một protein (để lưu hành trong máu), và cuối cùng là dạng liên hợp (để thải ra ngoài). Estrogen tự do khi đến tế bào đích (target cell) sẽ khuếch tán qua màng tế bào để đến kết hợp với một thụ thể (receptor) trong bào tương (hay còn gọi là tế bào chất) thành một phức hợp. Phức hợp này sẽ đi vào nhân tế bào, gây ra hai hiệu quả: sao chép DNA để nhân đôi tế bào và tăng tổng hợp RNA. Sau đó estrogen rời khỏi thụ thể và ra khỏi tế bào, thời gian lưu lại trong nhân tế bào tùy thuộc vào từng loại estrogen đó là hoạt tính mạnh hay yếu của mỗi loại estrogen. 2.1.3. Khái niệm về chất gây rối loạn hệ nội tiết Các chất gây rối loạn nội tiết (Endocrine Disruptors), là các chất xâm nhập vào cơ thể từ bên ngoài, hoạt động gần giống như các hormone trong hệ nội tiết và gây ra các xáo trộn chức năng sinh lý của các nội tiết tố. Các EDs được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất là những chất ảnh hưởng đến các hormone sinh dục nữ (estrogen), hormone sinh dục nam (androgen), hormone thể vàng (progesteron), hormone tuyến giáp (thyroid hormone), trong đó các chất ảnh hưởng tương tự hay ức chế estrogen được quan tâm nhiều hơn cả. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Võ Thị Kiều Thanh SVTH: Nguyễn Duy Tân 5 2.1.4. Nguồn gốc và nồng độ gây hại của các chất gây rối loạn nội tiết Các chất gây rối loạn nội tiết hiện diện ngay trong các phụ gia thực phẩm, trong mỹ phẩm, thuốc bảo vệ thực vật, trong đồ nhựa, trong nước sinh hoạt bị ô nhiễm, chúng có thể được sản xuất có chủ định để dùng trong công nghiệp hoặc là sản phẩm của quá trình biến đổi từ nhiều chất khác nhau. Sự xuất hiện của chúng từ nhiều nguồn khác nhau như:  Các hóa chất do con người sản xuất như phenol, dioxin, furan… Ước lượng có khoảng 539 chất đang tồn tại.  Các chất bảo vệ thực vật, các chất chống côn trùng và sinh vật gây hại, có khoảng 255 chất liên quan.  Dược phẩm và mỹ phẩm đã biết khoảng 58 chất .  Các chất vô cơ.  Các chất sử dụng trong sinh hoạt mà đặc biệt là các sản phẩm làm từ nhựa.  Các chất có nguồn gốc từ sinh vật, chủ yếu là các dẫn xuất steroids như:  Estrogen gồm các dẫn xuất chính như: estrone, 17β-estradiol, estriol  Androgen gồm các dẫn xuất chính như: testosterone, 5α- dihydrotestosterone… Tác động của các chất gây rối loạn nội tiết lên sinh vật như làm tỉ lệ trứng nở giảm dần, hiện tượng đực hóa ở những con cái và cái hóa ở con đực, hiện tượng thay đổi thời gian trưởng thành sinh sản, hiện tượng trọng lượng dạ con tăng bất thường ở chuột chưa trưởng thành, hiện tượng lưỡng tính ở cá. Những tổn thương vĩnh viễn ở chim và bộ gặm nhấm, sinh sản dị dạng ở động vật lưỡng cư và chim,… Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Võ Thị Kiều Thanh SVTH: Nguyễn Duy Tân 6 17β-estradiol, ethinylestradiol và estrone là những chất thường được nghiên cứu nhiều hơn các hormone nữ khác bởi vì sự ảnh hưởng của chúng đối với động vật ở nồng độ rất thấp so với các chất khác, với nồng độ 0.1ng/l ethinylestradiol hoặc 1ng/l 17β- estradiol đã có thể gây nên những ảnh hưởng trên cá. Các nhà khoa học đang nghi ngờ các chất gây rối loạn nội tiết gây ra những ảnh hưởng trên người như làm giảm khả năng sinh sản, giảm lượng tinh trùng, gây hại cho hệ sinh sản cả nam và nữ, dậy thì sớm, gây ung thư vú ở nữ, ung thư hệ sinh sản nam và nhiều tác động khác. 2.1.5. Quá trình tác động của các chất gây rối loạn nội tiết lên sinh vật Cơ quan thụ cảm của các hormone estrogen, androgen, hormone tuyến giáp là các protein thành viên của liên nhóm cơ quan thụ cảm nhân. Chúng thực hiện được chức năng khi kết hợp được với hormone. Phức hợp hormone + receptor thông qua các yếu tố đáp ứng trên DNA (hormone response element) dẫn đến quá trình sao mã, giải mã của các gene đích và biểu hiện ở sự duy trì, phát triển và thực hiện chức năng của các cơ quan. Thật không may, những thụ quan này lại là những chiếc khóa có tính “chung chạ” nên có thể nhận những chiếc “chìa khóa rởm”. Các chất có khả năng trở thành những chiếc “chìa khóa rởm” này sau khi vào cơ thể người và động vật, theo máu đến kết hợp được với các cơ quan thụ cảm của hormone sẽ dẫn đến các trường hợp sau:  Bắt chước tác dụng của hormone  Cạnh tranh với hormone  Ức chế tác dụng của hormone Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Võ Thị Kiều Thanh SVTH: Nguyễn Duy Tân 7 2.2. Tổng quan về thủy sinh động vật [5],[6],[7] 2.2.1. Các loại sinh vật ở thủy vực nước ngọt Thủy sinh vật nước ngọt rất đa dạng, và được phân bố khá rộng rãi. Tuy nhiên mỗi vùng địa hình đều có những loài thủy sinh đặc trưng riêng. Có thể phân biệt thành 3 vùng địa hình cảnh quan chủ yếu: vùng đồi núi, vùng đồng bằng và vùng đất ven biển. 2.2.1.1. Phân bố loài thủy sinh vật vùng đồi núi Vùng đồi núi có các thủy vực đặc trưng là sông, suối vùng núi, hồ tự nhiên và nhân tạo. Trong các sông suối vùng núi thường thấy phát triển các loài tảo nước ngọt ôn đới như Ulothrix zonata, Strotonostoc commune fulvaceum, Hapalosiphon welvvischii, Phormidium subcapitatum, Oscillatoria granulate, Lyngbya truncicola, Ceratoneis arcus,… hoặc ở các loài ưa nước chảy như Cladophora glomerata, C.rhifoides, Ulothrix tenerrina, Chaetomorpha sp. Trên tảng của chúng có các loài bì sinh như Chamaesiphon incrustans, Cocconeis placentula. Giữa các tảng đá trên sông suối, thường gặp các tập đoàn Nostochopsislobatus. Bên bờ suối hay sông còn thường gặp các dạng tảo sợi như Spirogyra rhifoides,… Ở trong các hồ tự nhiên thì thành phần loài tảo nước ngọt đặc trưng bởi sự phong phú của tảo silic, trong đó có các tảo bám như Gomphonema constrictum, Cocconeis placentula và các loài nhiệt đới khác. Thành phần thực vật nổi trong hồ chứa chủ yếu là tảo lam, tảo silic và tảo lục. Thành phần loài cá nước ngọt vùng núi có các loài đặc trưng như: Cyprinus multitaeniata, Lissochilus laocaiensis, Altigena lemassoni, Onychostoma gelarchi và các loài khác thuộc giống này, Leptobarbus hoevenii, Bagarius yarreli, Gymnostomus [...]... mà còn gây tác động tiêu cực tiềm tàng khác là biến đổi chất lượng của những cá thể trên cơ sở tích tụ các chất gây độc như một số kim loại nặng, các hóa chất bảo vệ thực vật trong các cơ quan nội tạng của một số loài cá, thân mềm, giáp xác Các tia phóng xạ ngoài tác hại gây chết, chúng còn ảnh hưởng đến sự phát triển của sinh vật ở giai đoạn đầu như đẻ sớm, không phát triển hết các giai đoạn của thai,…... dùng cho Daphnia magna ăn theo định kỳ 2 lần một tuần với khoảng 2ml/4l môi trường nuôi cấy Số lượng tế bào tảo được tính dựa trên thành phần Carbon Đối với Daphnia magna, thành phần carbon khoảng 48%, số lượng tảo cho mỗi Daphnia magna ăn là 2.28 x 107 tế bào/ Daphnia magna/ ngày (tương đương 0.2 mgC/ Daphnia/ ngày) Sinh khối tảo thường lắng xuống đáy của beaker nuôi cấy, cần phải khuấy lên lớp tảo... va chạm vào Daphnia magna làm ảnh hưởng đến chúng Đặt beaker nuôi cấy lên một nền đen, Daphnia sẽ di chuyển lên trên nên chúng ta sẽ dễ dàng làm sạch đáy beaker 3.3.1.2.4 Thay môi trường nuôi cấy Bắt đầu nuôi cấy với khoảng 150 con Daphnia con cùng lứa (ít hơn 24 giờ tuổi) trong 1.5 lít môi trường M4 Beaker được đậy bằng một dĩa thủy tinh, ghi ngày theo ngày tháng sinh của Daphnia con Ngày Daphnia sinh... Micropipette và pipette Pasteur… 3.2 Vật liệu Daphnia magna được nuôi tại phòng Công nghệ biến đổi sinh học, Viện sinh học Nhiệt đới trong môi trường COMBO SVTH: Nguyễn Duy Tân 22 Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Võ Thị Kiều Thanh Chất gây rối loạn nội tiết (Endocrine Disruptors) : 17α-Ethynylestradiol ;17βEstradiol 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Kỹ thuật nuôi cấy Daphnia magna trên môi trường COMBO 3.3.1.1 Môi... thí nghiệm Daphnia phải được thay mới sau 4 tuần nuôi cấy 3.3.1.2.7 Điều kiện bất lợi Trong trường hợp có sự bất lợi của môi trường nuôi cấy đối với Daphnia magna như tỷ lệ tử vong cao, không có hoặc khả năng sinh sản của Daphnia magna kém cần chú ý những điểm sau:  Chu kỳ chiếu sáng (xem xét tình trạng làm việc của đồng hồ hẹn giờ)  Ánh sáng (đèn chiếu sáng bị cũ hay bị hư hỏng)  Nồng độ của dung... hàm lượng các chất này trong nước quá cao có thể làm cho chúng tê liệt và chết Do vậy chúng thường được nuôi trong môi trường nước đã được kiểm tra và đạt tiêu chuẩn an toàn D .magna có thể ăn rất nhiều các loại thức ăn khác nhau nhưng nguồn thức ăn chính của nó là các loại tảo đơn bào tươi, vi khuẩn, nấm men,… Nguồn thức ăn của D .magna ảnh hưởng rất nhiều đến màu sắc của nó Nếu thức ăn của nó là tảo... sản của D .magna SVTH: Nguyễn Duy Tân 19 Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Võ Thị Kiều Thanh 2.3.2 Ứng dụng  Thức ăn cho ấu trùng cá và một vài loài thủy sinh D .magna được biết đến nhiều từ khi thú chơi cá cảnh bắt đầu phát triển ở các nước châu Âu, do D .magna là một loại thức ăn cho cá rất có giá trị dinh dưỡng D .magna có hàm lượng protein chiếm 50% tổng chất khô của cơ thể, ở con trưởng thành lượng chất. .. có sản sinh ra những độc tố gây hại trực tiếp ngay cho các loài sinh vật khác Một số các đầm nuôi ven biển bị tác động của thủy triều đỏ (sự nở rộ của loài tảo giáp có tính độc), thủy triều xanh (nở rộ tảo silic) đã gây bệnh hoặc làm chết hàng loạt các đối tượng nuôi như tôm he, cua, cá Các nhóm sinh vật tự nhiên khác ở vùng cửa sông, ven biển cũng bị ảnh hưởng tiêu cực của thủy triều đỏ Sau thời kỳ... này là cơ sở vật chất ban đầu, là xuất phát điểm quyết định chất lượng môi trường nước và trầm tích đáy Trong điều kiện cân bằng, các chất dinh dưỡng này được hấp thu để trở thành sinh khối của các chuỗi thức ăn tự nhiên trong quá trình biến đổi vật chất và năng lượng của hệ sinh thái hồ Nếu vượt quá khả năng hấp thụ của hệ sinh thái thì nguồn dinh dưỡng thừa này sẽ là nguyên nhân gây nên tình trạng... Hiện trạng ô nhiễm một số thủy vực nước ngọt và sự ảnh hưởng đến thủy sinh vật 2.2.2.1 Hiện trạng ô nhiễm một số thủy vực nước ngọt Hiện trạng ô nhiễm hữu cơ, ô nhiễm vi sinh vật và ô nhiễm các chất dinh dưỡng đang phổ biến tại hầu hết các thủy vực tiếp nhận nước thải của các đô thị như các kênh mương tiêu thoát tại các đô thị lớn Sự ô nhiễm bởi một số các chất độc hiện đang diễn ra tại một số cơ sở sản . giá chất gây rối loạn nội tiết trong môi trường. Vì những lý do đã nêu trên, chúng tôi xây dựng đề tài Khảo sát sự ảnh hưởng của chất gây rối loạn nội tiết lên Dapnnia magna để tìm hiểu sự ảnh. độ chất gây rối loạn nội tiết và phân tích được nồng độ chất gây rối loạn nội tiết trên hệ thống kênh rạch Tp.HCM. Nhưng chúng tôi chưa đi sâu nghiên cứu ảnh hưởng của chất gây rối loạn nội tiết, . MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC  ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT GÂY RỐI LOẠN NỘI TIẾT LÊN DAPHNIA MAGNA Ngành: Công nghệ Sinh học Mã ngành: 111 GVHD: ThS.