Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM PHẠM VIỆT HẢI PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG TÁI SINH IN VITRO NHẰM PHỤC VỤ CHUYỂN GEN Ở CÂY LẠC (ARACHIS HYPOGAEA L.) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN – 2013 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM PHẠM VIỆT HẢI PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG TÁI SINH IN VITRO NHẰM PHỤC VỤ CHUYỂN GEN Ở CÂY LẠC (ARACHIS HYPOGAEA L.) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60 42 01 21 Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. Chu Hoàng Mậu THÁI NGUYÊN – 2013 THÁI NGUYÊN – 2013 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn THAI NGUYEN UNIVERSITY THE COLLEGE OF EDUCATION PHAM VIET HAI DEVELOPMENT OF REGENERATION SYSTEM IN VITRO TO SERVE THE GENE TRANSFER IN PEANUT CULTIVARS (ARACHIS HYPOGAEA) MASTER THESIS IN BIOLOGY Specialyty: GENETICS Code: 60 42 01 21 Scientific supervisor: Prof. CHU HOANG MAU Ph.D. THAI NGUYEN – 2013 THAI NGUYEN – 2013 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố. Tác giả luận văn Phạm Việt Hải Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS. Chu Hoàng Mậu đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Sau Đại học, Ban chủ nhiệm khoa Sinh – Kỹ thuật Nông nghiệp và các thầy cô giáo, cán bộ của Khoa đã quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Thị Tâm, TS. Vũ Thị Thu Thuỷ, NCS Nguyễn Thị Thu Ngà, chị Trần Thị Hồng, chị Đào Thu Thủy và các thầy cô Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại, khoa Sinh – Kỹ thuật Nông nghiệp, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên. Tôi xin cảm ơn Trung tâm nghiên cứu và Phát triển đậu đỗ, Viện cây lương thực và cây thực phẩm - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam đã cung cấp các giống lạc làm vật liệu cho các thí nghiệm của đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cha mẹ, mợ, anh chị và các em trong gia đình tôi đã giúp đỡ, động viên tôi rất nhiều trong quá trình học tập của mình. Tác giả luận văn Phạm Việt Hải Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn iii Mục lục iiii Những chữ viết tắt v Danh mục các bảng vi Danh mục các hình viii MỞ ĐẦU 1 Chƣơng I. Tổng quan tài liệu 3 1.1. Cây lạc 3 1.1.1. Nguồn gốc, phân bố, phân loại, đặc điểm sinh học cây lạc 3 1.1.2. Giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế của cây lạc…… ……………… 5 1.1.3. Tình hình sản xuất lạc trên thế giới và Việt Nam 7 1.2. Hệ thống tái sinh in vitro ở cây lạc 11 1.2.1. Cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 11 1.2.2. Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật Error! Bookmark not defined.12 1.2.3. Tái sinh cây 13 1.2.4. Nghiên cứu hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen ở cây lạc 15 1.2.5. Hệ thống tái sinh và chuyển gen gián tiếp ở cây lạc ……………… 18 Chƣơng II. Nguyên liêu và phƣơng pháp nghiên cứu 23 2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị 23 2.1.1. Nguyên liệu 23 2.1.2. Hóa chất và thiết bị 23 2.2. Phương pháp nghiên cứu 23 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iv 2.2.1. Phương pháp nuôi cấy in vitro 24 2.2.2. Phương pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu. 30 Chƣơng III. Kết quả và thảo luận 31 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ các chất đến kết quả khử trùng hạt 31 3.2. Kết quả tái sinh cây lạc từ nách lá mầm 32 3.2.1. Môi trường tạo sự nảy mầm cho hạt lạc 32 3.2.2. Môi trường cảm ứng chồi ở nách lá mầm 32 3.2.3. Môi trường kéo dài chồi của hai giống lạc 38 3.2.4. Môi trường ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh 40 3.2.5. Nhận xét về môi trường tái sinh chồi từ nách lá mầm. 41 3.3. Kết quả tái sinh từ mô sẹo phôi trục hạt lạc 42 3.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo từ phôi lạc 42 3.3.2. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh cây từ mô sẹo phôi lạc 45 3.3.3. Môi trường tạo rễ của chồi tái sinh từ mô sẹo 48 3.3.4. Nhận xét về môi trường tái sinh cây lạc từ mô sẹo phôi 49 3.4. Kết quả tái sinh thông qua sự hình thành phôi soma 49 3.4.1 Môi trường cảm ứng tạo cụm phôi soma của phôi trục hạt lạc 49 3.4.2. Môi trường tái sinh cây từ phôi soma 53 3.4.3. Khả năng ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh từ phôi soma 56 3.4.4. Nhận xét về môi trường tái sinh cây lạc từ phôi soma 57 3.5. Ra cây và chế độ chăm sóc 57 3.6. So sánh hiệu quả tái sinh từ ba hệ thống sinh khác nhau trên cùng một giống lạc…………………………………………………………………… 59 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn v NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT 2,4D 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid BAP 6 - Benzyl Amino Purin cs Cộng sự DNA Deoxyribonucleic acid EM Môi trường phát triển phôi soma GA3 Gibberellic acid GM Môi trường nảy mầm hạt IAA ß – indol axetic acid IBA Indole butyric acid KN Kinitin MS Murashige – Skoog (1962) NAA Naphthyl acetic acid PM Môi trường tiền cảm ứng phôi soma RIM Môi trường cảm ứng ra rễ của chồi RM Môi trường ra rễ cho phôi soma SEM Môi trường kéo dài chồi SIM Môi trường cảm ứng tạo chồi SM Môi trường nảy mầm phôi soma TB Trung bình Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Bảng 1.1 Tình hình sản xuất lạc trên thế giới ( 2002 - 2007) 7 Bảng 1.2 Các quốc gia sản xuất lạc nhiều nhất trên thế giới 9 Bảng 1.3 Diễn biến sản xuất lạc ở nước ta 10 Bảng 1.4 Diện tích, năng suất, sản lượng lạc của các vùng trọng điểm ở Việt Nam năm 2009 11 Bảng 1.5 Một số báo cáo chuyển gen ở cây lạc thông qua vi khuẩn A. tumefaciens (trước năm 2000). 20 Bảng 1.6 Một số báo cáo chuyển gen ở cây lạc (năm 2000-2009) 22 Bảng 2.1 Thành phần các loại môi trường nuôi cấy dùng cho hệ thống tái sinh cây từ nách lá mầm 26 Bảng 2.2 Thành phần các loại môi trường nuôi cấy dùng cho hệ thống tái sinh cây từ phôi soma 29 Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ BAP và tổ hợp BAP với NAA đến khả năng cảm ứng tạo chồi 35 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của tác động gây thương tổn đến khả năng tạo đa chồi trên môi trường cảm ứng tạo chồi tốt nhất 37 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của BAP và tổ hợp của BAP với NAA đến khả năng kéo dài chồi 39 Bảng 3.4 Hiệu quả kích thích ra rễ cho lạc của NAA và IBA 40 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của 2,4-D đến khả năng tạo mô sẹo của các giống lạc 42 Bảng 3.6 Khối lượng mô sẹo của các giống lạc ở các mức nồng 44 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vii độ 2,4-D Bảng 3.7 Ảnh hưởng của BAP và tổ hợp BAP với NAA đến tỷ lệ tái sinh chồi từ mô sẹo (%) 46 Bảng 3.8 Ảnh hưởng của BAP và tổ hợp BAP với NAA đến khả năng tạo chồi ở mô sẹo lạc sau 4 tuần tái sinh 48 Bảng 3.9 Ảnh hưởng của nồng độ khác nhau của 2,4-D đến khả năng cảm ứng phôi soma của các giống lạc (%) 50 Bảng 3.10 Ảnh hưởng của BAP và tổ hợp BAP với NAA đến khả năng tái sinh cây của phôi soma sau 8 tuần 53 Bảng 3.11 Hiệu quả tái sinh của các hệ thống tái sinh 59 [...]... tượng cây lúa, thuốc lá, đậu tương, cà chua còn đối với cây lạc, việc nghiên cứu phát triển hệ thống tái sinh và chuyển gen vẫn đang là điều khá mới mẻ Từ những lý do trên, chúng tôi đã chọn đề tài: Phát triển hệ thống tái sinh in vitro nhằm phục vụ chuyển gen ở cây lạc (Arachis hypogaea L.) 2 Mục tiêu nghiên cứu - Xây dựng quy trình tái sinh đa chồi tối ưu in vitro từ nách lá mầm lạc Ra rễ, tạo cây. .. rễ và tạo cây hoàn chỉnh - Khảo sát môi trường tạo mô sẹo từ phôi trục hạt lạc, tái sinh cây từ mô sẹo, ra rễ và tạo cây lạc hoàn chỉnh in vitro - Khảo sát môi trường cảm ứng phôi soma, tái sinh cây lạc hoàn chỉnh từ phôi soma - Tìm điều kiện tốt nhất chuyển cây lạc tái sinh in vitro ra môi trường tự nhiên - Đánh giá hiệu quả tái sinh của các hệ thống tái sinh khác nhau ở cây lạc 2 Số hóa bởi Trung... hiệu quả tái sinh cao 1.2.4 Nghiên cứu hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen ở cây lạc Một phương thức tái sinh tốt là một điều kiện tiên quyết để đạt được thành công trong các nghiên cứu chuyển đổi di truyền Vì tái sinh thành công của cây chuyển gen phụ thuộc vào hiệu quả của vi nhân in vitro và phương thức chuyển gen [75] Việc nghiên cứu chuyển gen ở cây lạc cũng sẽ khó thành công 15 Số hóa bởi Trung... http://www.lrc-tnu.edu.vn nếu trước hết không tiến hành việc tái sinh hoàn chỉnh cây lạc Nhiều khó khăn trong chuyển đổi di truyền ở lạc bao gồm các yếu tố như: tái sinh kém, thời gian tái sinh dài, thường thông qua một giai đoạn mô sẹo, và chịu ảnh hưởng của kiểu gen trên các hệ thống tái sinh vì vậy một phương pháp tái sinh có thể tránh những vấn đề này là cần thiết [27] Tái sinh cây lạc thông qua sự hình thành phôi soma... hoàn chỉnh và chuyển cây lạc tái sinh in vitro ra môi trường tự nhiên - Xác định môi trường tối ưu tái sinh in vitro cây lạc từ mô sẹo phôi trục và từ phôi soma có nguồn gốc từ phôi trục hạt lạc, so sánh hiệu quả của các hệ thống tái sinh khác nhau trên cùng một giống lạc 3 Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu điều kiện khử trùng tối ưu cho hạt lạc sử dụng trong các thí nghiệm nuôi cấy mô in vitro - Khảo... sự tái sinh cây Rudrabhatla Sairam (2005) đã tổng hợp các kết quả nghiên cứu phát triển kỹ thuật tái sinh ở cây một lá mầm và cây hai lá mầm và cho rằng sự tái sinh cây có thể được thực hiện bằng nuôi cấy in vitro từ phôi soma hoặc từ một bộ phận khác độc lập trên cơ thể và điều đó còn phụ thuộc vào genotype của giống [71] Tái sinh thực vật trong ống nghiệm thông qua hai con đường đó là: Phát sinh. .. những mục tiêu tốt nhất để chuyển gen Có thể nói đây là đối tượng nuôi cấy rất có tiềm năng để tái sinh cây hoàn chỉnh so với nuôi cấy các loại mô khác 1.2.5 Hệ thống tái sinh và chuyển gen gián tiếp ở cây lạc Các phương pháp chuyển gen có thể được sử dụng cho việc chuyển đổi di truyền ở cây lạc đó là chuyển gen thông qua trung gian A Tumefaciens hoặc thông qua các phương pháp chuyển giao DNA trực tiếp... chứng minh là thành công nhất cho sự cảm ứng đa chồi thông qua phát sinh cơ quan trực tiếp trong số các loại mô cấy thuộc cây họ đậu [31] Phương thức tái sinh cây gián tiếp từ mô sẹo phụ thuộc vào nguồn gốc mô sẹo và mô sẹo dạng phôi có nguồn gốc từ đỉnh sinh trưởng dễ tái sinh thành cây hơn [68], ngoài ra khả năng tái sinh cây cũng chịu ảnh hưởng lớn bởi thành phần và nồng độ các chất kích thích sinh. .. rộng rãi hơn ở cây lạc bởi mô lạc dễ bị nhiễm các chủng A Tumefaciens [54], thời gian tái sinh cây chuyển gen ngắn hơn, kết quả các locus gen chuyển từ việc nhiễm khuẩn A Tumefaciens ít phức tạp hơn (không tích hợp một lúc nhiều bản sao gen chuyển) so với việc được tạo ra bằng các phương pháp chuyển gen trực tiếp, do đó làm giảm nguy cơ tái sắp xếp gen chuyển và bất hoạt gen [63] Sự chuyển gen thành công... Hình 3.13 Cây tái sinh từ phôi soma với bộ rễ hoàn chỉnh 57 viii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hình 3.14 Sự sinh trưởng của cây tái sinh trong ống nghiệm ix Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 58 MỞ ĐẦU 1 Lý do chọn đề tài Cây lạc (Arachis hypogaea L.) là cây công nghiệp ngắn ngày được trồng phổ biến ở nước ta . tài: Phát triển hệ thống tái sinh in vitro nhằm phục vụ chuyển gen ở cây l c (Arachis hypogaea L. ) . 2. Mục tiêu nghiên cứu - Xây dựng quy trình tái sinh đa chồi tối ưu in vitro từ nách l mầm. trưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật Error! Bookmark not defined.12 1.2.3. Tái sinh cây 13 1.2.4. Nghiên cứu hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen ở cây l c 15 1.2.5. Hệ thống tái. http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM PHẠM VIỆT HẢI PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG TÁI SINH IN VITRO NHẰM PHỤC VỤ CHUYỂN GEN Ở CÂY L C (ARACHIS HYPOGAEA L. )