ĐạI HọC THáI NGUYÊN TRƯờNG ĐạI HọC KHOA HọC PHùNG HUY TRọNG NGHIÊN CứU ĐặC ĐIểM SINH HọC MộT Số CHủNG Baccillus thuringiensis SINH PROTEIN TINH THể DIệT CÔN TRùNG Bộ CáNH CứNG LUậN VĂN THạC Sĩ CÔNG NGHệ SINH HọC THáI NGUYÊN - 2013 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi. Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong công trình nghiên cứu khác. Thái Nguyên, ngày 20 tháng 04 năm 2013 Tác giả Phùng Huy Trọng ii LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn, tôi đã nhận đƣợc nhiều sự giúp đỡ, hỗ trợ của thầy cô, bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Tôi xin trân trọng cảm ơn tất cả những tình cảm quý báu đó. Trƣớc tiên, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Ngô Đình Bính, ngƣời thầy đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn KS. Đặng Văn Tiến cùng toàn thể cán bộ phòng Di truyền vi sinh, viện Công nghệ sinh học, viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời thời gian dài thực tập. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh, các giảng viên cùng các thầy cô giáo trƣờng Đại học Khoa học đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời thời gian học tập tại trƣờng và hoàn thành tốt luận văn của mình. Cuối cùng tôi xin cảm ơn bạn bè và gia đình, những ngƣời đã luôn ủng hộ tôi trong suốt thời gian qua! Thái Nguyên, ngày 20 tháng 04 năm 2013 Học viên Phùng Huy Trọng iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii BẢNG NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG KHOÁ LUẬN v MỞ ĐẦU 1 PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Đại cƣơng vê Bacillus thuringiensis 3 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng Bacillus thuringiensis 3 1.1.2. Vị trí phân loại, đặc điểm hình thái 5 1.1.3. Phân biệt Bt với các loài khác trong nhóm Bacillus cereus 6 1.1.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 7 1.1.5. Đặc điểm phân loại 8 1.1.6. Đặc điểm gen mã hóa protein độc tố diệt côn trùng 13 1.1.7. Phân loại gen mã hóa protein độc tố diệt côn trùng từ Bacillus thuringiensis 14 1.1.8. Các loại độc tố của Bacillus thuringiensis 15 1.1.9. Cơ chế tác động của protein tinh thể độc lên côn trùng 17 1.1.10. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình hình thành bào tử và tinh thể độc 19 1.2. Tổng quan về gen cry3, Protein Cry3 và dƣới loài Bacillus thuringiensis tenebrionis 20 1.2.1. Một số đặc điểm về gen cry3 20 1.2.2. Đặc điểm sinh hóa và huyết thanh học của Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis 21 1.3. Tổng quan về côn trùng bộ cánh cứng (Coleoptera) 22 1.4. Tách dòng gen 26 1.4.1. Khái niệm 26 1.4.2. Vectơ tách dòng 26 iv PHẦN II : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 28 2.1. Vật liệu 28 2.1.1. Sinh phẩm 28 2.1.2. Hoá chất và thiết bị 28 2.1.3. Môi trƣờng 29 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 31 2.2.1. Phƣơng pháp phân lập 31 2.2.2. Phƣơng pháp phân loại Bt bằng phản ứng huyết thanh 31 2.2.3. Phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học 32 2.2.4. Phƣơng pháp tách DNA plasmid từ vi khuẩn Bt 33 2.2.5. Phƣơng pháp PCR để khuyếch đại gen cry3A 34 2.2.6. Phƣơng pháp tách dòng gen cry3A 34 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis mang gen cry3A có hoạt tính diệt côn trùng bộ cánh cứng. 38 3.1.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis 38 3.1.2. Hình dạng tinh thể của các chủng Bacillus thuringiensis 39 3.2. Kết quả phân loại dƣới loài bằng phƣơng pháp huyết thanh 40 3.3. Hoạt tính diệt mọt thóc đỏ 41 3.3.1. Xác định nồng độ bào tử 41 3.3.2. Thử hoạt tính sinh học với mọt thóc đỏ trƣởng thành của các chủng Bt phân lập 41 3.4. Sàng lọc gen cry3A ở các chủng Bt bằng phƣơng pháp PCR 43 3.5. Kết quả tách dòng gen và đọc trình tự gen cry3A 44 3.5.1. Kết quả tách dòng gen cry3A 44 3.5.2. Xác định trình tự đoạn gen cry3A 47 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 v BẢNG NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG KHOÁ LUẬN STT Viết tắt Viết đầy đủ 1 Amp Ampicillin 2 Bp Base pair 3 Bt Bacillus thuringiensis 4 Bt.t Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis 5 DNA Deoxyribonucleotide acid 6 E. coli Escherichia coli 7 EDTA Ethylene diamine tetra - acetic acid 8 LB Môi trƣờng Lauria Betani 9 PCR Polymerase chain reaction 10 SDS Sodium dodecyl sulphate 11 Sol Solution 12 TAE Tris - Acetate - EDTA 13 X- gal 5 - Bromo - 4 Cloro - 3 indolyl ß - d galactoside 14 kDa Kilo Dalton 15 dH 2 O Deion water vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Sự phân loại Bacillus thuringiensis dựa vào kháng nguyên tiên mao H 9 Bảng 1.2. Phân loại gen cry mã hóa các protein độc tố Cry diệt côn trùng 14 Bảng 1.3. Các điểm trình tự tham khảo của vectơ pGEM - T easy 27 Bảng 3.1. Kết quả phân lập Bacillus thuringiensis trong các mẫu đất 39 Bảng 3.2 Hình dạng tinh thể của các chủng Bt phân lập 40 Bảng 3.3. Kết quả thử hoạt tính diệt âú trùng và mọt thóc đỏ trƣởng thành của các chủng Bt sau 5 ngày thử nghiệm. 42 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Tế bào vi khuẩn Bacillus thuringiensis 5 Hình 1.2. Tinh thể của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 6 Hình 1.3. Cơ chế diệt sâu của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 18 Hình 1.4. Cấu trúc không gian của protein Cry3A 21 Hình 1.5. Một số hình ảnh về côn trùng bộ cánh cứng 22 Hình 1.6. Ấu trùng và mọt thóc đỏ trƣởng thành 23 Hình 1.7. Chu kỳ sống và phát triển của mọt thóc đỏ (Tribolium castaneum) . 25 Hình 1.8. Vectơ tách dòng pGEM - T easy 27 Hình 3.1. Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus thuringiensis trên môi trƣờng MPA phân lập từ đất Nha Trang nuôi cấy ở 28 0 C sau 3 ngày 38 Hình 3.2. Hình dạng tinh thể của các chủng Bt phân lập đƣợc khi nhuộm fushin và soi dƣới kính hiển vi điện tử. 39 Hình 3.3. Hình ảnh ngƣng kết của chủng ĐNT 9.5 phân lập với type huyết thanh dƣới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần 41 Hình 3.4. Hình ảnh thử hoạt tính diệt ấu trùng và mọt thóc đỏ trƣởng thành của các chủng Bt phân lập…………………………………………………………43 Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% 43 Hình 3.6. Khuẩn lạc xanh, trắng xuất hiện trên môi trƣờng LBA sau khi nuôi cấy qua đêm. 44 Hình 3.7. Điện di sản phẩm cắt DNA plasmide tách chiết từ các dòng khuẩn lạc ĐNT 9.5 trên agarose 1%. 46 Hình 3.8. Kết quả PCR DNA plasmid các dòng khuẩn lạc của chủng ĐNT 9.5 đã biến nạp băng mồi mồi đặc hiệu gen cry3A 47 Hình 3.9: So sánh trình tự đoạn gen cry3A của chủng ĐNT9.5 với mã 2 trình tự có mã số M37207.1 và EU 332160.1 49 1 MỞ ĐẦU Côn trùng bộ cánh cứng (Coleoptera) là bộ đƣợc biết đến với số lƣợng loài lớn nhất và đã có trên 250.000 loài đã đƣợc mô tả. Trong đó, rất nhiều loài thuộc bộ cánh cứng là những côn trùng gây hại nhƣ: Anomala, Tenebrio molitar… Chúng phá hoại mùa màng, nông sản, làm giảm chất lƣợng nông sản phẩm, và đặc biệt là lƣơng thực sau thu hoạch. Bên cạnh đó có nhiều loài côn trùng thuộc bộ cánh cứng phá hại lâm sản làm thiệt hại rất lớn cho ngành công nghiệp sản xuất gỗ: Anobiidae (họ mọt gỗ), Cerambycidae (họ xén tóc), Bostrychidae (họ mọt dài)… Theo các báo cáo thống kê của nhiều nƣớc trên thế giới thì côn trùng thuộc bộ cánh cứng đƣợc xếp vào một trong những loài gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng nhất. Có rất nhiều biện pháp hoá học và sinh học đƣợc áp dụng để khắc phục tình trạng trên. Tuy nhiên các biện pháp hoá học lại thƣờng gây ra tính kháng thuốc trên côn trùng, đồng thời thuốc hoá học còn gây ảnh hƣởng đến sức khỏe cộng đồng, góp phần làm mất cân bằng sinh thái và ô nhiễm môi trƣờng. Vì vậy, tổ chức Nông lƣơng thế giới (FAO), tổ chức Y tế thế giới (WHO) và tổ chức Môi trƣờng thế giới đã khuyến cáo hạn chế đến mức tối đa việc sử dụng các hoá chất và tăng cƣờng sử dụng thuốc trừ sâu sinh học. Trong số các loại thuốc trừ sâu sinh học đã và đang đƣợc sử dụng thì loại thuốc có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) là có hiệu quả diệt sâu cao nhất. Hiện nay thuốc trừ sâu sinh học Bt chiếm hơn 90% thị phần thuốc trừ sâu sinh học trên thế giới, và ngày càng đƣợc sử dụng một cách rộng rãi. Thuốc trừ sâu sinh học Bt có rất nhiều ƣu điểm tuy nhiên nhƣợc điểm vẫn chƣa khắc phục đƣợc của chế phẩm Bt là có phổ tác dụng hẹp - chỉ đặc hiệu với một vài loài côn trùng. Bản chất của sự đặc hiệu này là do các gen mã hóa protein tinh thể diệt côn trùng trong tế bào của vi khuẩn quyết định. Trong số 70 nhóm gen cry đã đƣợc phát hiện thì gen cry3 là một trong số gen có thể mã hóa protein tinh thể diệt côn trùng bộ cánh cứng, một loài côn trùng rất khó 2 tiêu diệt hiện nay. Việc nghiên cứu sâu về gen này là hết sức cần thiết. Xuất phát từ mục đích này chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm sinh học một số chủng Bacillus thuringiensis sinh protein tinh thể diệt côn trùng bộ cánh cứng”. Mục tiêu đề tài: - Tuyển chọn đƣợc các chủng Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis có hoạt tính diệt ấu trùng và mọt thóc đỏ trƣởng thành (Tribolium castaneum) cao. - Xác định đƣợc trình tự gen cry3A từ các chủng Bt subsp. tenebrionis đã tuyển chọn. Nhiệm vụ của đề tài: - Phân lập các chủng Bacillus thuringiensis từ các mẫu đất, mẫu lá ở Nha Trang và Quảng Nam. - Sàng lọc các chủng Bt có hoạt tính diệt ấu trùng và mọt thóc đỏ trƣởng thành. - Phát hiện gen cry3A bằng phƣơng pháp PCR. - Tách dòng gen cry3A mã hoá protein tinh thể diệt côn trùng bộ cánh cứng. - Xác định trình tự đoạn gen cry3A và so sánh với trình tự trên ngân hàng gen quốc tế. [...]... trùng bộ cánh cứng (1: Mọt thóc đỏ, 2: Mọt ngô, 3: Xén tóc) Côn trùng bộ cánh cứng đƣợc biết đến là côn trùng có số lƣợng loài lớn nhất, chúng có màu sắc, hình dạng, kích thƣớc, môi trƣờng sống rất đa dạng Côn trùng bộ cánh cứng có mặt ở khắp mọi nơi trên thế giới Chúng có thể sinh sống ở hầu hết các loại môi trƣờng trừ nƣớc và vùng cực địa 23 Đặc trƣng phổ biến của côn trùng bộ cánh cứng là bộ xƣơng... protein tinh thể độc lên côn trùng Cơ chế tác động của protein tinh thể của Bacillus thuringiensis liên quan tới sự hoà tan của tinh thể trong ruột giữa của côn trùng Các tinh thể độc đều đƣợc bắt nguồn từ một protein có khối lƣợng phân tử lớn khoảng 130-140 kDa, đƣợc gọi là “tiền độc tố” Tiền độc tố này phải đƣợc hoạt hoá thì mới gây ra tính độc Trong những điều kiện bình thƣờng thì protein tinh thể. .. cây trồng công nghệ sinh học và thực phẩm chuyển gen [1] Năm 2003, Sakai và cộng sự đã công bố protein tinh thể của Bt diệt tế bào ung thƣ Năm 2005, Ohba M và Binh, N.D đã phát hiện protein của 4 dƣới loài Bt phân lập ở Việt Nam chống tế bào ung thƣ cổ tử cung của ngƣời [45] Trên thế giới từ lúc phát hiện ra vi khuẩn Bt mang gen mã hóa tinh thể protein diệt côn trùng, đã có rất nhiều nghiên cứu và ngày... gen cry mã hóa các protein độc tố Cry diệt côn trùng Trọng lƣợng phân tử protein (kDa) 130 - 138 Hoạt tính diệt côn trùng cry1A - 1M Hình dạng tinh thể Lƣỡng tháp cry2A -cry2C Cầu 69 - 71 cry3A -cry3C cry4A-cry4D cry5A-cry5E cry8 Lập phƣơng Cầu Lƣỡng tháp Lập phƣơng 73 - 74 73 - 134 81 130 Cánh vảy Lepidoptera/ Hai cánh Diptera Cánh cứng Coleoptera Hai cánh Diptera Nematode Cánh cứng Đa dạng 35 - 129... Bt subsp israelensis diệt ấu trùng muỗi và ruồi thuộc bộ hai cánh Phát hiện này đã chứng tỏ phổ hoạt tính của Bt không chỉ bó hẹp trong bộ cánh vảy (Lepidoptera) mà còn với cả bộ hai cánh (Diptera) 4 Năm 1983, phổ hoạt tính của Bt lại đƣợc nâng lên khi Krieg và cộng sự phát hiện ra dƣới loài Bt subsp tenebrionis diệt bộ cánh cứng (Coleoptera) Chủng này đƣợc phân lập từ bộ cánh cứng Tenebrio molitar... môi trƣờng pH cao (khoảng 9,5), protein tinh thể sẽ bị hoà tan Môi trƣờng pH này thƣờng thấy trong ruột giữa của ấu trùng thuộc bộ cánh vảy Với lý do này, Bt đƣợc xem là một tác nhân diệt côn trùng có tính đặc hiệu cao [16] Tinh thể độc gây độc lên côn trùng thông qua con đƣờng tiêu hoá Nhờ có hệ Enzyme protease và môi trƣờng pH kiềm ở ruột giữa của côn trùng mà tinh thể độc sẽ bị hoà tan Quá trình... cereus gồm B cereus, B thuringiensis, B anthracis, B mycoides, B megaterium Gần đây có phát hiện thêm 2 loài B weihenstephanensis và B pseudomycoides [19] Việc sinh ra protein tinh thể là một đặc tính để phân biệt Bacillus thuringiensis, tuy nhiên đó chỉ là một chỉ tiêu dùng trong mục đích phân loại 7 Bảng 1.1 Một số đặc điểm phân biệt các loài trong nhóm 1 chi Bacillus Đặc điểm Bc Bt Bmy Ba Bme +(a)... nhiều nghiên cứu tập trung vào sự tồn tại của các gen mã hóa protein tinh thể diệt sâu ở các loài phụ Bt khác nhau Các phƣơng pháp xử lí plasmid, tiếp hợp và các thí nghiệm tách dòng gen đã chứng 14 minh rằng các gen mã hóa protein diệt côn trùng thƣờng nằm trên các plasmid lớn có hệ số copy thấp Theo điều tra của Carlton và Gonzalez thì plasmid có mặt trong hầu hết các chủng Bacillus thuringiensis số. .. Axit amin: Một số axitamin nhƣ leucine, isoleucine có tác dụng ức chế sự sinh trƣởng của Bt cũng nhƣ sự hình thành tinh thể độc, nhƣng khi cho thêm axit amin valine vào thì sự ức chế bị mất đi Điều đó chứng tỏ rằng axit amin có ảnh hƣởng tới sự sinh trƣởng và hình thành tinh thể độc của Bt 1.2 Tổng quan về gen cry3, Protein Cry3 và dƣới loài Bacillus thuringiensis tenebrionis 1.2.1 Một số đặc điểm về... dao động từ 2 đến 12 trong các chủng nghiên cứu [13, 14] Các thí nghiệm lai gen đã cung cấp bằng chứng về sự tồn tại các gen tổng hợp nhiều độc tố trong một tế bào Bacillus thuringiensis 1.1.7 Phân loại gen mã hóa protein độc tố diệt côn trùng từ Bacillus thuringiensis Trong quá trình sinh trƣởng và phát triển, Bacillus thuringiensis có khả năng sinh ra 3 loại độc tố diệt côn trùng chính là Cry (Crystal . ĐạI HọC THáI NGUYÊN TRƯờNG ĐạI HọC KHOA HọC PHùNG HUY TRọNG NGHIÊN CứU ĐặC ĐIểM SINH HọC MộT Số CHủNG Baccillus thuringiensis SINH PROTEIN TINH THể DIệT CÔN TRùNG Bộ CáNH. hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu đặc điểm sinh học một số chủng Bacillus thuringiensis sinh protein tinh thể diệt côn trùng bộ cánh cứng . Mục tiêu đề tài: - Tuyển chọn đƣợc các chủng. phát hiện thì gen cry3 là một trong số gen có thể mã hóa protein tinh thể diệt côn trùng bộ cánh cứng, một loài côn trùng rất khó 2 tiêu diệt hiện nay. Việc nghiên cứu sâu về gen này là hết