Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM DƢƠNG VĂN HẠNH ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ MẪU ĐẬU ĐEN (Vigna cylindrica) ĐỊA PHƢƠNG TRỒNG TẠI TỈNH BẮC GIANG BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ RAPD LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN – 2013 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM DƢƠNG VĂN HẠNH ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ MẪU ĐẬU ĐEN (Vigna cylindrica) ĐỊA PHƢƠNG TRỒNG TẠI TỈNH BẮC GIANG BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ RAPD Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC Mã số: 60.42.01.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học : GS.TS. Chu Hoàng Mậu THÁI NGUYÊN – 2013 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa có ai công bố trong một công trình nào khác. Tác giả Dƣơng Văn Hạnh Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS Chu Hoàng Mậu đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh, KTV Lê Đức Huấn và các các cán bộ phòng thí nghiệm Sinh học, khoa Khoa học sự sống, trường Đại học khoa học đã tạo điều kiện giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong thời gian làm thực nghiệm. Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô giáo Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại, cảm ơn các thầy cô và cán bộ Khoa Sinh – KTNN, trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành bản luận văn thạc sĩ. Tôi xin cảm ơn sự động viên, khích lệ của gia đình, bạn bè và đồng nghiệp trong suốt thời gian làm luận văn. Tác giả Dƣơng Văn Hạnh Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ iii NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT DNA Axit deoxyribonucleic AFLP Fragment Length Polymorphism ( Sự đa hình chiều dài các phân đoạnADN được khuếch đại) ASTT Áp suất thẩm thấu CS Cộng sự EDTA Ethylene Diamin Tetraaxetic Acid Kb Kilobase PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) RAPD Random Amplified Polymorphism DNA (Phân tích ADN đa hình được nhân bản ngẫu nhiên) RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Sự đa hình chiều dài cácphân đoạn ADN cắt hạn chế) SSR Simple Sequence Repeats TBE Tris - Boric acid - EDTA TAE Tris - Acetate - EDTA TE Tris - EDTA Tris Trioxymetylaminometan Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ iv MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Những chữ viết tắt iii Mục lục iv Danh mục các bảng v Danh mục các hình vi MỞ ĐẦU 1 1. Lý do chọn đề tài 1 2 2 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Cây đậu đen 3 1.1.1 Nguồn gốc và phân loại 3 1.1.2. Đặc điểm nông sinh học của cây đậu đen 3 1.1.3. Thành phần hoá sinh của hạt đậu đen 9 1.1.4. Vị trí, tầm quan trọng của cây đậu đen 11 1.2. Ngiên cứu tính đa dạng và mối quan hệ di truyền ở thực vật 17 1.2.1. Một số kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích quan hệ di truyền ở thực vật 17 1.2.1.1. Kỹ thuật RAPD 17 1.2.1.2. Kỹ thuật AFLP 19 1.2.1.3. Kỹ thuật RFLP 20 1.2.1.4. Kỹ thuật SSR 20 1.2.2. Sử dụng kỹ thuật RAPD trong nghiên cứu sự đa dạng và mối quan hệ di truyền ở thực vật 21 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1. Vật liệu 23 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 2.1.1. Vật liệu thực vật 23 2.1.2. Hoá chất và thiết bị 24 2.1.3. Địa điểm nghiên cứu 25 2.2. Phương pháp nghiên cứu 25 2.2.1. Phương pháp sinh học phân tử 25 2.2.1.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số 25 2.2.1.2. Phương pháp xác định hàm lượng và độ tinh sạch DNA tổng số 26 2.2.1.3. Phương pháp RAPD 26 2.2.1.4. Phân tích số liệu RAPD 28 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái, kích thước, khối lượng 28 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1. Đặc điểm hình thái , kích thước và khối lương 1000 hạt của các mẫu đậu đen nghiên cứu 29 3.2. Phân tích sự đa dạng trong hệ gen của các mẫu đậu đen bằng kỹ thuật RAPD 31 3.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số từ lá đậu đen 31 3.2.2. Kết quả nhân bản các phân đoạn DNA bằng kĩ thuật RAPD 32 3.3. Phan tích ính đa dạng và khoảng cách di truyền của các mẫu đậu đen nghiên cứu 43 3.3.1. Hệ số giống nhau và khác nhau và các phân đoạn DNA đặc trưng của các mẫu đậu đen nghiên cứu 43 3.3.2. Mối quan hệ và khoảng cách di truyền giữa các mẫu đậu đen dựa trên phân tích RAPD 45 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47 1. Kết luận 47 2. Đề nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 1. Tài liệu tham khảo tiếng Việt 48 2. Tài liệu tham khảo tiếng Anh. 49 3. Các trang Web 50 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ v DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1.Thành phần dinh dưỡng của đậu đen đã nấu chín trong 1 cốc đậu đen tương đương với 172g 10 Bảng 2.1. Nguồn gốc các mẫu đậu đen nghiên cứu 23 Bảng 2.2. Trình tự nucleotide của 12 mồi sử dụng trong nghiên cứu 26 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng RAPD 27 Bảng 2.4. Chu trình nhiệt của phản ứng RAPD 27 Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái, kích thước và khối lượng của 8 mẫu đậu đen 29 Bảng 3.2. Tỷ lệ phân đoạn đa hình khi sử dụng 12 mồi RAPD 33 Bảng 3.3. Hàm lượng thông tin đa hình (PIC) của các mồi ngẫu nhiên trong phản ứng RAPD khi nhân bản DNA của 8 mẫu đậu đen địa phương 35 Bảng 3.4. Hệ số giống nhau và khác nhau của 8 mẫu đậu đen nghiên cứu 44 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ vi DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Cây đậu đen 4 Hình 2.1. Hình ảnh hạt của các mẫu đậu đen nghiên cứu 24 Hình 3.1. Ảnh điện di DNA tổng số của 8 mẫu đậu đen nghiên cứu 31 Hình 3.2. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M2 của 8 mẫu đậu đen 36 Hình 3.3. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M3 của 8 mẫu đậu đen 37 Hình 3.4. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M5 của 8 mẫu đậu đen 38 Hình 3.5. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M7 của 8 mẫu đậu đen 40 Hình 3.6. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M11 của 8 mẫu đậu đen 42 Hình 3.7. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M12 của 8 mẫu đậu đen 43 Hình 3.8. Sơ đồ về mối quan hệ di truyền của 8 mẫu đậu đen trên cơ sở phân tích RAPD với 12 mồi ngẫu nhiên 45 Nhóm I Nhóm II P I P II Nhóm I Nhóm II P I P II Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Đậu đen (Vigna cylindrica) là cây trồng cạn, ngắn ngày có giá trị kinh tế cao. Khó có thể có tìm thấy một cây trồng nào có tác dụng nhiều mặt như cây đậu đen. Sản phẩm của nó làm thực phẩm cho con người, thức ăn cho gia súc nguyên liệu cho công nghiệp, hàng xuất khẩu, đặc biệt là dùng làm thuốc chữa bệnh, gần đây còn có khả năng chống ung thư và là cây cải tạo đất tốt. Vì thế cây đậu đen có vai trò hết sức quan trọng trong nền kinh tế và y học. Hiện nay, cả nước đã có nhiều nơi sản xuất đậu đen, đặc biệt là ở các vùng trung du miền núi phía Bắc, tuy nhiên chưa hình thành được các vùng chuyên canh như một số giống đậu và cây trồng khác. Các giống đậu đen ở nước ta hiện nay rất phong phú, trong đó có các giống đậu đen địa phương. Đây là nguồn vật liệu quý cho công tác chọn tạo giống đậu đen phù hợp với điều kiện sản xuất của từng vùng, miền khác nhau [8]. Đánh giá sự đa dạng di truyền của các giống đậu đen địa phương tạo cơ sở cho công tác chọn tạo giống đang được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Hiện nay, các nhà khoa học đã sử dụng nhiều phương pháp mới trong nghiên cứu sự đa dạng di truyền của các giống cây trồng nói chung và của cây họ đậu nói riêng như RAPD, RFLP, AFLP, SSR, STS, Các phương pháp này không những phát huy hiệu quả mà còn khắc phục nhược điểm của các phương pháp truyền thống bởi hiệu quả sàng lọc cao, tiết kiệm thời gian và tin cậy. Trong những năm gần đây nhiều công trình nghiên cứu sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để phân tích sự đa dạng di truyền của cây họ đậu đã được công bố. Chu Hoàng Mậu và đtg (2002) đã đánh giá hệ gen của một số dòng đậu tương đột biến bằng kỹ thuật phân tích đa hình của DNA được nhân bản ngẫu nhiên”, Vũ Thanh Trà và Trần Thị Phương Liên (2006) nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương địa phương có phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắt bằng chỉ thị SSR. Năm 2002, Coulibaly và đtg thuộc Đại học [...]... số mẫu đậu đen (Vigna cylindrica) địa phƣơng trồng tại tỉnh Bắc Giang bằng chỉ thị phân tử RAPD Xác định được sự sai khác trong hệ gen và mối quan hệ di truyền của một số mẫu giống đậu đen địa phương trồng tại tỉnh Bắc Giang bằng chỉ thị phân tử RAPD 3.1 Phân tích sự đa dạng của một số đặc đi m hình thái, khối lượng và một số chỉ tiêu của các mẫu đậu đen nghiên cứu 3.2 Sử dụng kỹ thuật RAPD (Random... bảng 2.1 Bảng 2.1 Nguồn gốc các mẫu đậu đen nghiên cứu Tên giống Ký hiệu 1 Đậu đen BG1 Lục Nam – Bắc Giang 2 Đậu đen BG2 Lục Ngạn – Bắc Giang 3 Đậu đen BG3 Sơn Động – Bắc Giang 4 Đậu đen BG4 Lạng Giang – Bắc Giang 5 Đậu đen BG5 Yên Thế – Bắc Giang 6 Đậu đen BG6 Tân Yên – Bắc Giang 7 Đậu đen BG7 Việt Yên – Bắc Giang 8 Đậu đen BG8 Hiệp Hòa – Bắc Giang TT 23 Nguồn gốc Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/... của các tác giả khác ở Trung Quốc, Hoa Kỳ, Ấn Độ, Nhật Bản đã đề cập đến tính đa dạng di truyền của cây họ đậu bằng các chỉ thị SSR, SNP, ITS, tuy nhiên đối với cây đậu đen nghiên cứu sự đa dạng di truyền bằng kỹ thuật sinh học phân tử mới chỉ được bắt đầu Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi đã lựa chọn và tiến hành đề tài luận văn thạc sĩ là: Đánh giá sự đa dạng di truyền của một số mẫu đậu đen. .. phẩm RAPD chỉ ra được một số băng đặc hiệu tương ứng với các mồi ngẫu nhiên để phân biệt một số giống trong nhóm nghiên cứu [22 ] Li và đtg (2002) đã phân tích 10 giống đậu tương trồng và đậu tương dại ở bốn tỉnh của Trung Quốc đã bổ sung dữ liệu về sự đa dạng chỉ thị phân tử RAPD của các giống đậu tương này [21] Trong những năm gần đây kỹ thuật RAPD được sử dụng rộng rãi để phân tích di truyền của. .. nay, kỹ thuật RAPD đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu và xác định quan hệ di truyền ở thực vật Kỹ thuật RAPD cũng được ứng dụng trong việc đánh giá sự đa dạng di truyền giữa các loài và trong phạm vi một loài phân tích và đánh giá hệ gen của thực vật nhằm xác định những thay đổi của các dòng chọn lọc ở mức phân tử Phương pháp này còn được ứng dụng trong việc đánh giá hệ gen của giống và... Đào (2009), đánh giá sự đa dạng di truyền ở mức phân tử của 16 giống đậu tương với 10 mồi ngẫu nhiên bằng kỹ thuật RAPD tổng số phân đoạn DNA thu được là 766 Trong phạm vi vùng phân tích có 56 phân đoạn DNA được nhân bản, trong đó có 21 băng vạch cho tính đa hình (tương ứng 37,5%) [6] Kỹ thuật RAPD còn là một công cụ rất có hiệu quả trong việc tìm ra các chỉ thị phân tử để phân biệt các giống hay các... nào ở Việt Nam về đánh giá đa dạng di truyền bằng kỹ thuật RAPD đối với cây Đậu đen 22 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU VÀ ĐỊA ĐI M NGHIÊN CỨU 2.1.1 Vật liệu thực vật Vật liệu nghiên cứu của đề tài là hạt của 8 mẫu đậu đen khác nhau, thu thập ở 8 huyện thuộc tỉnh Bắc Giang Nguồn gốc của các giống đậu tương nghiên cứu được... thể sống lành mạnh chỉ với đậu hũ và các loại sản phẩm khác của đậu đen Nói chung, đậu đen có lượng đạm chất cao hơn các các loại ngũ cốc khác từ hai đến năm lần Hạt đậu đen có nhiều sinh tố nhóm B, nhiều sắt, kali, rất nhiều chất xơ Đa số hạt đậu đều có rất ít chất béo và năng lượng, ngoại trừ đậu đen lại có nhiều chất béo tốt ở dạng chưa bão hòa Đậu đen có ít năng lượng nhưng chứa nhiều nước [28] Một. .. là phương pháp hiệu quả trong việc xác định kiểu gen, phân tích quần thể và nguồn gốc loài, nghiên cứu di truyền và lập bản đồ di truyền Kỹ thuật RAPD được sử dụng rất nhiều để đánh giá đa dạng di truyền của rất nhiều loài sinh vật khác nhau như Lúa, Ngô, Đậu đen, Khoai tây, Đậu xanh, Đậu đũa, Chè, Cà Phê trên thế Giới và Việt Nam Tuy nhiên chưa có một công trình nghiên cứu nào ở Việt Nam về đánh giá. .. 15 bp chứa vị trí nhận biết của enzyme giới hạn, phần thay đổi dài khoảng 2 - 4 bp Sản phẩm PCR được đi n di trên gel polyacrylamide có độ phân giải cao Sự đa hình được xác định bởi sự có mặt hay vắng mặt của một phân đoạn DNA Kỹ thuật AFLP có ưu đi m là phân tích đa hình di truyền trong khoảng thời gian ngắn, lượng DNA đòi hỏi ít, cho sự đa hình cao Kỹ thuật này được đánh giá là nhanh chóng và có hiệu . hệ di truyền của một số mẫu giống đậu đen địa phương trồng tại tỉnh Bắc Giang bằng chỉ thị phân tử RAPD. 3.1. Phân tích sự đa dạng của một số đặc đi m hình thái, khối lượng và một số chỉ. văn thạc sĩ là: Đánh giá sự đa dạng di truyền của một số mẫu đậu đen (Vigna cylindrica) địa phƣơng trồng tại tỉnh Bắc Giang bằng chỉ thị phân tử RAPD . Xác định được sự sai khác trong hệ. 8 mẫu đậu đen 36 Hình 3.3. Ảnh đi n di sản phẩm RAPD với mồi M3 của 8 mẫu đậu đen 37 Hình 3.4. Ảnh đi n di sản phẩm RAPD với mồi M5 của 8 mẫu đậu đen 38 Hình 3.5. Ảnh đi n di sản phẩm RAPD