Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THU TRANG THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN GSH1 NHẰM NÂNG CAO KHẢ NĂNG TÍCH LŨY ASEN TRONG THỰC VẬT LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên – 2013 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THU TRANG THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN GSH1 NHẰM NÂNG CAO KHẢ NĂNG TÍCH LŨY ASEN TRONG THỰC VẬT Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60 42 0201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ VĂN SƠN Thái Nguyên – 2013 i Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Văn Sơn, Phòng Kỹ thuật Di truyền, Viện Công nghệ sinh học , Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, dìu dắt, giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và hoàn thành khóa luận này. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới PGS. TS. Chu Hoàng Hà, ThS. Bùi Phương Thảo, cùng tập thể cán bộ Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian làm khoá luận. Tôi xin cảm ơn Phòng Đào tạo và các thầy cô giáo tại Cơ sở đào tạo sau đại học, Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã luôn quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập. Cuối cùng, tôi xin dành cho những người thân trong gia đình và bạn bè lòng biết ơn sâu sắc, những người thân yêu đã luôn bên tôi, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khoá luận. Tôi chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quí báu đó./ Thái Nguyên, ngày 25 tháng 10 năm 2013 Tác giả luận văn Nguyễn Thu Trang ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT A.tumefaciens As BAP Bp DNA dNTPs EDTA Gus GSH GSH1 IBA kb LB MS OD PCR RNase Taq Ti-plasmid T-DNA TP Agrobacterium tumefaciens Asen 6- benzenladenine base pair (cặp bazơ) Deoxyribonucleic Acid Deoxy Nucleoside Triphosphate Ethylene Diamine tetra- acetate Acid Gen mã hóa enzyme β-glucuronidase Glutathione Enzyme γ-glutamylcysteine synthetase Indole-3-butyric acid Kilo base Môi trƣờng theo Luria và Bertani Môi trƣờng cơ bản theo Murashige và Skoog (1962) Optical density (mật độ quang học) Polymerase Chain Reaction ARN polimerase Thermus aquaticus Tumor inducing plasmid (plasmid gây khối u) Transferred-DNA Transit peptide iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 2.1 Trình tự mồi nhân bản gen GSH1……………………………… 25 2.2 XbaI và SacI 26 2.3 Thành phần phản ứng ghép nối GSHI vào vector PBI121…… 26 2.4 Thành phần phản ứng colony-PCR 28 2.5 Sol 29 2.6 Thành phần dung dịch tách chiết DNA……………………… 32 2.7 Thành phần phản ứng PCR nhân gen GSHI………………… 33 3.1 Kết quả chuyển gen và chọn lọc in vitro trên cây thuốc lá K326 42 3.2 Kết quả phân tích dòng thuốc lá chuyển gen bằng phƣơng pháp PCR………………… 44 3.3 Kết quả đánh giá khả năng chống chịu As của các dòng thuốc lá chuyển gen GSH1………………………………………… 44 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Mô hình hấp thụ các chất ở thực vật 8 1.2 Sơ đồ của sự hấp thụ As và sự trao đổi chất trong thực vật …… 12 1.3 Cơ chế lây nhiễm của A. tumefaciens vào tế bào thực vật 21 2.1 Sơ đồ vector pBluesript II SK-GSH1…………………………… 25 3.1 Kết quả xử lý vector pBluescript II SK-GSH1 bằng cặp enzyme giới hạn XbaI và SacI ……………………………………………. 36 3.2 Kết quả xử lý vector pBI121 bằng cặp enzyme giới hạn 36 3.3 Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch 37 3.4 E.coli DH5α 38 3.5 Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR bằng cặp mồi GSH1- F1/GSH1-M1 39 3.6 Kết quả điện di sản phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng XbaI và SacI 39 3.7 Kết quả điện di sản phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng XbaI và SacI 40 3.8 Mảnh thuốc lá K326 trên môi trƣờng đồng nuôi cấy (A) và bắt đầu cảm ứng tạo cụm chồi trên môi trƣờng GM +Km50 (B) 41 3.9 Sự phát triển của các mảnh lá trên môi trƣờng chọn lọc GM + Km50 sau khoảng 3 tuần theo dõi 42 3.10 Cây con 2 tuần trên môi trƣờng ra rễ (A) và cây ra in vivo 1 tháng (B)…………………………………………………………. 42 3.11 Kết quả điện di DNA tổng số của các dòng thuốc lá ……………. 43 3.12 Kết quả điện di sản phẩm PCR các dòng thuốc lá với cặp mồi GSH1-F/GSH1-R………………………………………………… 43 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ v MỤC LỤC Lời cảm ơn i Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt ii Danh mục các bảng iii Danh mục các hình iv Mục lục v MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Tình hình ô nhiễm As và các biện pháp xử lý 3 1.1.1.Tình hình ô nhiễm As 3 1.1.2. Tác hại của As đến môi trƣờng và sức khỏe con ngƣời 5 1.1.3. Các phƣơng pháp xử lý truyền thống 6 1.1.4. Xử lý ô nhiễm As trong đất bằng thực vật (Phytoextraction) 7 1.1.4.1. Xử lý ô nhiễm As trong đất bằng thực vật “siêu tích tụ” 7 1.1.4.2. Thực vật biến đổi gen cho mục đích xử lý ô nhiễm kim loại nặng 10 1.2. Cơ sở khoa học của chuyển gen ở thực vật 14 1.2.1. Khái niệm về chuyển gen 14 1.2.2. Các phƣơng pháp chuyển gen thực vật 14 1.2.2.1. Các phƣơng pháp chuyển gen trực tiếp 14 1.2.2.2. Phƣơng pháp chuyển gen gián tiếp 17 1.2.3. Các hệ thống vector dùng để chuyển gen 20 1.2.3.1. Hệ vector cùng xâm nhập (CXN) 20 1.2.3.2. Hệ vector nhị thể (Binary vector) 21 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ vi 1.3. Glutathione và gen GSH1 21 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ vi CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1. Vật liệu 24 2.1.1. Nguyên liệu thực vật 24 2.1.2. Chủng vi khuẩn và các nguyên liệu DNA 24 2.1.3. Hóa chất 25 2.1.4. Thiết bị 25 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 25 2.2.1. Phƣơng pháp thiết kế vector chuyển gen 25 2.2.2. Phƣơng pháp chuyển gen vào cây thuốc lá 30 2.2.3. Các phƣơng pháp phân tích cây chuyển gen 32 CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1. Kết quả thiết kế cấu trúc vector chuyển gen 35 3.1.1. Kết quả thiết kế cấu trúc vector chuyển gen pBI121/GSH1 35 3.1.2. Tạo chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector tái tổ hợp pBI121/GSH1 39 3.2. Kết quả chuyển gen và chọn lọc in vitro giống thuốc lá K326 40 3.3. Kết quả phân tích cây chuyển gen 42 3.3.1 Kết quả phân tích các dòng cây chuyển gen bằng PCR 42 3.3.2. Kết quả đánh giá khả năng chống chịu As của các dòng cây chuyển gen 44 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ… 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………… 48 PHỤ LỤC………………………………………………… …………… 54 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 1 MỞ ĐẦU Lý do chọn đề tài Asen (As) là một trong những nguyên tố rất phổ biến trong thiên nhiên, chiếm 1,1 – 4 % tổng số nguyên tử trong vỏ trái đất. As trong đất tồn tại ở pha rắn chiếm tới 94% còn lại chỉ 6% tổng As tồn tại trong dung dịch đất, dễ dàng di chuyển ra khỏi . Nguồn phát thải As trƣớc hết là từ các ngành công nghi , chì (Pb), thủy ngân (Hg) và cadmium (Cd) . Để xử lý đất ô nhiễm As ngƣời ta thƣờng sử dụng các phƣơng pháp truyền thống nhƣ: rửa đất; cố định các chất ô nhiễm bằng hoá học hoặc vật lý; xử lý nhiệt; trao đổi ion, ôxi hoá hoặc khử các chất ô nhiễm; đào đất bị ô nhiễm để chuyển đi đến những nơi chôn lấp thích hợp, Các phƣơng pháp này thƣờng rất tốn kém về kinh phí, giới hạn về kỹ thuật và hạn chế về diện tích. Gần đây, nhờ những hiểu biết về cơ chế hấp thụ, chuyển hoá, chống chịu và loại bỏ kim loại nặng của một số loài thực vật, ngƣời ta đã bắt đầu chú ý đến khả năng sử dụng thực vật để xử lý môi trƣờng nhƣ một công nghệ môi trƣờng đặc biệt. Tuy nhiên các loài thực vật thƣờng đƣợc dùng lại có sinh khối thấp, vì vậy yêu cầu đặt ra là phải tạo ra các giống có khả năng sinh trƣởng nhanh, sinh khối lớn và có khả năng hấp thụ kim loại nặng. Cây trồng chuyển gen là giải pháp cho vấn đề này. Trong đề tài này chúng tôi lựa chọn gen GSH1 mã hóa enzyme γ- glutamyl cysteine synthetase tham gia quá trình sinh tổng hợp glutathione (GSH) - một trung gian giải độc quan trọng của kim loại nặng trong thực vật - là gen mục tiêu. Khi để thực vật tiếp xúc với kim loại nặng quá nhiều sẽ tạo ra các phản ứng oxy hóa (ROS) và tích lũy các ion kim loại (M + ). GSH khử độc [...]... tài: Thiết kế vector chuyển gen GSH1 nhằm nâng cao khả năng tích lũy Asen trong thực vật Mục tiêu nghiên cứu - Thiết kế vector chuyển gen mang gen GSH1 mã hóa enzyme γglutamylcysteine synthetase (γ-ECS) liên quan đến quá trình sinh tổng hợp GSH nhằm nâng cao khả năng tích lũy As trong thực vật - Tạo ra cây thuốc lá mang gen GSH1 Nội dung nghiên cứu - Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc gen GSH1... với arsC, kết quả các cây chuyển gen có khả năng chống chịu và tích lũy As cao nhiều lần so với đối chứng Tăng cường vận chuyển As từ rễ lên thân Một trong những đặc tính quan trọng của cây có khả năng tích lũy As cao, cây dƣơng xỉ (P.vittata) là khả năng vận chuyển hiệu quả As từ rễ lên thân [53] trong khi hầu hết các loại dƣơng xỉ không có khả năng hấp thụ As khác thƣờng có khả năng vận chuyển As... sự trao đổi chất trong thực vật và các thao tác di truyền có thể đƣợc thực hiện để nâng cao hiệu quả xử lý As của thực vật [55] Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 12 Các nghiên cứu chuyển gen nhằm nâng cao khả năng xử lý As ở thực vật cho đến nay chủ yếu tập trung vào một số hƣớng sau: Tăng cường tích lũy As trong không bào Các nghiên cứu theo hƣớng tăng cƣờng tích lũy và sinh tổng... PCs trong thực vật chuyển gen qua đó tăng cƣờng tích lũy As trong không bào đƣợc nghiên cứu nhiều và đã đạt đƣợc nhiều thành công trong thời gian vừa qua Tăng biểu hiện của phytochelatin synthase (PCS )trong sinh tổng hợp các PCs, đã làm tăng khả năng chống chịu và tích lũy As ở cây chuyển gen Gasic và Korban (2007) thấy rằng tăng cƣờng biểu hiện của PCs trong cây mù tạt Ấn Độ chuyển gen làm tăng khả năng. .. nghĩa là phục hồi Đây là một trong những hƣớng nghiên cứu mới trong lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật nhằm ám chỉ biện pháp sử dụng cơ thể thực vật trong công tác xử lý môi trƣờng Gần đây các nghiên cứu sử dụng thực vật trong xử lý kim loại nặng đƣợc đặc biệt quan tâm Nhiều loại thực vật đƣợc sử dụng để loại bỏ kim loại nặng trong đất thông qua khả năng hấp thụ và tích lũy trong các phần thân và lá... trong việc vi khuẩn đề kháng Arsenit [39] Vì vậy việc tăng cƣờng biểu hiện Lsi2 trong cây chuyển gen có khả năng sẽ làm tăng sự vận chuyển As từ rễ lên thân và qua đó tăng cƣờng sự tích lũy As trong cây Tạo cây chuyển gen có khả năng phytovolatilization As Rất nhiều loài sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm và động vật có hiện tƣợng metyl hóa Á Các dạng metyl hóa của As đƣợc phát hiện ở nhiều loài thực vật. .. có khả năng tích tụ, vừa tạo ra sinh khối lớn Gần đây, công nghệ sử dụng thực vật để làm sạch kim loại trong đất ô nhiễm hoặc trầm tích đã thu hút đƣợc sự chú ý nhờ các ƣu điểm nổi bật nhƣ thân thiện với môi trƣờng và chi phí thấp Các thành tựu thu đƣợc của thập kỷ qua đã chứng minh công nghệ gen thực vật có thể đƣợc sử dụng vào việc nâng cao khả năng xử lý kim loại của thực vật Các nghiên cứu chuyển. .. chống chịu, hấp thụ và tích lũy As trong thực vật chuyển gen Tuy nhiên có thể thấy rằng để có thể tạo đƣợc một giống cây biến đổi gen có khả năng xử lý As tốt, với hiệu quả cao có thể đem ứng dụng trong thực tế còn cần phải có nhiều nghiên cứu hơn nữa Đặc biệt để nâng cao hiệu quả xử lý As cần phải cải biến nhiều quá trình khác nhau cùng một lúc, ví dụ nhƣ phải chuyển cùng lúc nhiều gen tham gia vào quá... có thể thấy rằng gen GSH1 đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp GSH và tăng cƣờng biểu hiện GSH1 trong thực vật là một hƣớng đi đầy tiềm năng trong việc tạo ra các cây trồng chuyển gen siêu hấp thụ và tích lũy kim loại nặng nhằm góp phần giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trƣờng Hiện nay ở Việt Nam, chƣa có công bố nào về việc phân lập cũng nhƣ chuyển gen GSH1 vào thực vật Vì vậy, đề tài... cũng đã phát hiện ra nhiều loài dƣơng xỉ có khả năng tích tụ kim loại ở mức độ cao nhƣ loài Pteris cretica, P longifolia, P vunbrosa, Mặc dù số loài thực vật siêu tích tụ kim loại nặng đã đƣợc phát hiện, nhƣng đến nay công nghệ xử lý ô nhiễm môi trƣờng bằng thực vật vẫn chƣa đƣợc phổ biến ứng dụng vào thực tiễn Lý do là các loài có khả năng tích lũy kim loại cao thƣờng sinh trƣởng kém, cho sinh khối . tôi tiến hành đề tài: Thiết kế vector chuyển gen GSH1 nhằm nâng cao khả năng tích lũy Asen trong thực vật . Mục tiêu nghiên cứu - Thiết kế vector chuyển gen mang gen GSH1 mã hóa enzyme γ- glutamylcysteine. hợp GSH nhằm nâng cao khả năng tích lũy As trong thực vật. - Tạo ra cây thuốc lá mang gen GSH1. Nội dung nghiên cứu - Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc gen GSH1. - Biến nạp vector. công nghệ gen thực vật có thể đƣợc sử dụng vào việc nâng cao khả năng xử lý kim loại của thực vật. Các nghiên cứu chuyển gen đã thành công trong việc nâng cao khả năng hấp thụ và tích lũy kim