BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI = = = = = = = = NGUYỄN THỊ THỦY NGHIÊN CỨU XÁC ðỊNH CÁC CON LAI SOMA KHOAI TÂY VÀ CÁC ðẶC TÍNH NÔNG SINH HỌC CỦA CÁC DÒNG CON LAI ðÓ LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyªn ngµnh : Công nghệ sinh học M· sè : 60.42.80 Ng−êi h−íng dÉn khoa häc: GS.TS. NGUYÔN QUANG TH¹CH HÀ NỘI – 2012 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan rằng, những số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội ngày 20 tháng 09 năm 2012 Tác giả Nguyễn Thị Thủy Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… ii LỜI CẢM ƠN! ðể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tôi ñã nhận ñược sự quan tâm, giúp ñỡ và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi của Thầy Cô, Gia ñình, bạn bè, ñồng nghiệp trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy giáo NGND.GS.TS Nguyễn Quang Thạch, người ñã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo ñóng góp những ý kiến quý báu cho tôi trong suốt quá trình thực hiện ñề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh ñạo Viện Sinh học Nông nghiệp – Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tạo mọi ñiều kiện thuận lợi cho tôi về thời gian, cơ sở vật chất thiết bị trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia ñình, bạn bè, ñồng nghiệp ñã giúp ñỡ, ñộng viên tôi trong suốt quá trình học tập, ñóng góp những ý kiến quý báu cho tôi hoàn thành ñược nghiên cứu này. Hà Nội ngày 20 tháng 09 năm 2012 Tác giả Nguyễn Thị Thủy Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… iii MỤC LỤC LỜI CAM ðOAN i LỜI CẢM ƠN! ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH viii DANH MỤC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT x 1. MỞ ðẦU 1 1.1 ðặt vấn ñề 1 1.2. Mục ñích và yêu cầu 2 1.2.1. Mục ñích 2 1.2.2. Yêu cầu 2 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2 1.3.1. Ý nghĩa khoa học 2 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn 3 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1. Giới thiệu chung về cây khoai tây 4 2.1.1. Nguồn gốc 4 2.1.2. Phân loại 4 2.1.3. Yêu cầu ñiều kiện ngoại cảnh của cây khoai tây 6 2.2. Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới và trong nước 7 2.2.1. Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới 7 2.2.2. Tình hình sản xuất khoai tây ở Việt Nam 9 2.3. Tình hình bệnh virus hại khoai tây 10 2.3.1. Tìm hiểu về virus hại khoai tây 11 2.3.2. Tác hại của bệnh virus 13 2.4. Giải pháp khắc phục 15 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… iv 2.4.1. Các giải pháp về canh tác 15 2.4.2. Giải pháp công nghệ sinh học 15 2.5. Các nghiên cứu về tạo giống khoai tây bằng dung hợp tế bào trần 19 2.5.1. Nghiên cứu về tạo giống khoai tây bằng dung hợp tế bào trần trên thế giới. 19 2.5.2. Một số nghiên cứu về dung hợp tế bào trần trên ñối tượng cây khoai tây ở Việt Nam 24 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 3.1. ðối tượng, vật liệu, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 25 3.2. Nội dung nghiên cứu 26 3.3. Phương pháp nghiên cứu. 27 3.3.1. Các phương pháp nghiên cứu trong phòng 27 3.3.2. Các phương pháp ngoài ñồng 32 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 4.1. Chọn lọc các con lai soma (heterozygous) qua phân tích ñộ bội, isozym và chỉ thị phân tử 33 4.1.1. Xác ñịnh ñộ bội của các dòng lai soma tái sinh ñược sau dung hợp (phương pháp flow cytometry) 33 4.1.2. Xác ñịnh con lai soma bằng phương pháp Isozyme 34 4.1.3. Xác ñịnh con lai soma bằng chỉ thị SSR trên máy Beckman Coutler 37 4.2. ðánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển và hình thành củ trong ñiều kiện in vitro của các con lai soma heterozygous (dị nhân) xác ñịnh ñược 43 4.2.1. ðánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của con lai soma heterozygous (dị nhân) trong ñiều kiện in vitro. 44 4.2.2. ðánh giá khả năng tạo củ của các dòng “bố mẹ” và con lai của chúng. 45 4.3. ðánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển và các yếu tố hình thành năng suất của các dòng “bố mẹ” và con lai soma trong ñiều kiện chậu vại 47 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… v 4.3.1. ðánh giá sinh trưởng và phát triển của các con lai soma dị nhân và các dòng nhị bội gốc 47 4.3.2. Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các con lai soma dị nhân và dòng “bố mẹ” gốc 47 4.3.3. Các chỉ tiêu hình thái củ và chất lượng chế biến của củ 49 4.4. Một số chỉ tiêu phẩm chất chế biến, ăn tươi của các dòng lai soma và “bố mẹ” của chúng 51 4.5. ðánh giá tính kháng bệnh PVX, PVY của các con lai và dòng “bố mẹ” gốc 52 4.5.1. ðánh giá tính kháng bệnh virus PVX, PVY của các con lai và dòng “bố mẹ” nhị bội thông qua kiểm tra gen kháng 52 4.5.2. ðánh giá khả năng kháng virus PVX, PVY thông qua lây nhiễm nhân tạo. 54 5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 58 5.1. Kết luận 58 5.2. ðề nghị 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 PHỤ LỤC 67 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… vi DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 2.1. Diện tích, năng suất và sản lượng khoai tây các khu vực trên thế giới năm 2011 (FAOSTAT) 8 Bảng 2.2. Sản lượng khoai tây trên thế giới giai ñoạn 1991 – 2007 9 Bảng 2.3. Nhóm virus chính hại khoai tây (Beemster và DeBokx 1987; Burton 1989; Brunt và cs. 1996) [15] 12 Bảng 3.1. Các dòng lai soma tái sinh ñược từ 4 tổ hợp dung hợp 25 nghiên cứu 25 Bảng 4.1. Kết quả xác ñịnh ñộ bội các dòng lai soma tái sinh sau dung hợp 34 Bảng 4.2. Trình tự và nhiệt ñộ gắn mồi sử dụng trong phân tích PCR 37 Bảng 4.3. Kết quả ñánh giá ña hình các dòng “bố mẹ” nhị bội 38 Bảng 4.4. Kết quả xác ñịnh con lai soma bằng chỉ thị phân tử SSR 43 Bảng 4.5. ðánh giá ñộng thái tăng trưởng chiều cao, số lá của các con lai và “bố mẹ” của chúng sau 4 tuần theo dõi trong ñiều kiện in vitro trên tổ hợp B208+B186 44 Bảng 4.6. Kết quả ñánh giả khả năng tạo củ các con lai soma dị nhân xác ñịnh ñược trong ñiều kiện in vitro của tổ hợp B208 + B186 45 Bảng 4.7. ðộng thái tăng trưởng chiều cao, số lá các con lai của tổ hợp lai B208+B186 47 Bảng 4.8. Năng suất, các yếu tố cấu thành năng suất các con lai soma dị nhân và các dòng nhị bội gốc của tổ hợp B208+B186 48 Bảng 4.9. Một số kết quả ñánh giá ñặc ñiểm thực vật học củ các con lai soma dị nhân của tổ hợp B208+B186 49 Bảng 4.10. Một số chỉ tiêu hóa sinh của các dòng lai soma dị nhân và “bố mẹ” của chúng 51 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… vii Bảng 4.11. Trình tự các mẫu khoai tây kiểm tra sau lây nhiễm 15 ngày ñược tra vào các giếng của bản ELISA 55 Bảng 4.12. Kết quả sau khi lây nhiễm nhân tạo 15 ngày 56 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… viii DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang Hình 2.1. Sơ ñồ tạo giống khoai tây sử dụng tổng hợp kỹ thuật: Lai tạo, nuôi cấy bao phấn (nuôi cấy hạt phấn), nhị bội hóa và dung hợp tế bào trần. (Wenzzel và cộng sự 1976) [63] 21 Hình 4.1. Kết quả phân tích ñộ bội của dòng khoai tây “bố mẹ” và con lai tái sinh bằng phương pháp dòng chảy tế bào (flow cytometry) 33 Hình 4.2. Hình ảnh xác ñịnh con lai soma bằng isozym với hai hệ enzym khác nhau 36 Hình 4.3. Kết quả phân tích con lai của tổ hợp lai B208+B186 sử dụng mồi STM - 3023 40 Hình 4.4. Kết quả phân tích con lai của tổ hợp lai A15+A56 sử dụng mồi STM - 3023 41 Hình 4.5. Kết quả phân tích con lai của tổ hợp lai A15+B208 sử dụng mồi STM - 3023 41 Hình 4.6. Kết quả phân tích một số con lai của tổ hợp lai A16+B208 sử dụng mồi STM - 3023 42 Hình 4.7. Hình ảnh cây “bố mẹ” và các dòng con lai sau 30 ngày theo dõi trong ñiều kiện in vitro 45 Hình 4.8. Khả năng tạo củ của các con lai sau dung hợp trong ñiều kiện in vitro sau 60 ngày 46 Hình 4.9. Hình dạng củ của các dòng con lai của tổ hợp B208+B186 50 Hình 4.10. Kết quả ñiện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi ñặc hiệu GM339 liên kết chặt với gen Nb – gen kháng virus PVX 53 Hình 4.11. Kết quả ñiện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi ñặc hiệu STM 0003 liên kết chặt với gen Ry sto là gen kháng virus PVY 54 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… ix Hình 4.12. Kết quả test Elisa kiểm tra ñộ sạch bệnh của các dòng con lai và bố mẹ trước và sau lây nhiễm nhân tạo với chủng virus PVX; A1, A2, A3: Trước khi lây nhiễm với lần lượt các chủng virus PVX, PVY-O, PVY-N; B1, B2, B3: Sau khi lây nhiễm 15 ngày với lần lượt các chủng PVX, PVY-O, PVY-N 57 [...]... sĩ khoa h c nông nghi p …………………… 1 dung h p t bào tr n Vi c xác ñ nh ñư c các con lai soma và ñánh giá chúng là h t s c c n thi t Trên cơ s ñó chúng tôi ti n hành ñ tài: Nghiên c u xác ñ nh các con lai soma khoai tây và các ñ c tính nông sinh h c c a các dòng con lai ñó” 1.2 M c ñích và yêu c u 1.2.1 M c ñích Xác ñ nh ñư c con lai soma heterozygous (d nhân) sau dung h p, ñánh giá các ñ c tính có l i... Hàng lo t con lai soma c a Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p …………………… 18 S etuberosum và S tuberosum và dòng BC1 th hi n kháng t t v i PVY và tính r t kháng v i PVX (Gavlirenco và cs, 2003) Nghiên c u c a Polgar và cs (2002) ñã t o ñư c 150 dòng lai soma gi a khoai tây Hungari và S brevidens cùng m t vài th h BC K t qu cho th y t t c con lai và h u h t dòng BC... (ñánh giá m t s ñ c ñi m nông sinh h c và kh năng kháng virus PVX, PVY c a các con lai xác ñ nh ñư c) nh m ch n l c các dòng tri n v ng ñ phát tri n thành gi ng kháng virus ph c v s n xu t 1.2.2 Yêu c u Nghiên c u xác ñ nh con lai soma - ðánh giá ñư c ñ b i c a con lai sau dung h p - Xác ñ nh con lai soma b ng k thu t Isozyme, b ng ch th phân t ðánh giá con lai - ðánh giá kh năng sinh trư ng, phát tri... tri n các phương pháp tách, dung h p, nuôi c y và tái sinh các th lai soma ñư c ti n hành r t m nh m (haberlach và cs,1985; Austin và cs, 1985a; Fish và cs, 1988; Perl và cs , 1988; Schilde, Rentschler và cs, 1988; Deimling và cs,1998; Masson và cs, 1988; Hunt và Helgeson, 1989; Chaput và cs, 1990; Wenzel, 1992; Thach et al., 1993) Các công trình nghiên c u t o các con lai soma t h p ñư c các ñ c tính. .. gen khoai tây d i có ñ c tính kháng b nh và d ch h i (virus, Phytophtora infestan, r p truy n b nh ) r t ñi n hình làm nguyên li u dung h p tr c ti p v i các dòng khoai tây tr ng ñ t o các con lai soma mang ñ c tính ch ng ch u virus m c sương và r p truy n b nh Các dòng lai này s ñư c s d ng làm v t li u lai l i (BC) v i chính b m c a chúng K t qu t o ra các dòng khoai tây tr ng tr t mang ñ c tính. .. cây dihaploid (2x), lai t o các cây dihaploid (có các ñ c tính khác nhau) ñ t o con lai 2x t h p ñư c các ñ c tính mong mu n c a b m S d ng k thu t dung h p t bào ñ t h p các ñ c tính mong mu n các d ng 2x K t qu thu ñư c con lai soma 4x (tetraploid) Các dòng lai soma này ñư c ch n l c ñ phát tri n thành gi ng có ñ c tính mong mu n Các dòng t b i kh i ñ u (4x ) Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i –... khác ch có 2% là dòng lai soma ða s các con lai soma thu ñư c có bi u hi n tính kháng virus c a c hai ñ i tư ng khoai tây dung h p, con lai ñư c xác ñ nh b ng k thu t RFLP và phân tích isozyme v i 2 lo i enzym esterase và peroxidase Lu Wenhe và c ng s (2004) cho r ng dung h p t bào tr n không ch vư t qua rào c n lai t o thông thư ng mà còn thu ñư c các th lai soma, do Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N... n tính kháng cao v i m t s nhóm virus và kháng vector truy n b nh (Austin và cs, 1985b; Fish và cs, 1987; Vankonen và cs, 1994b) [12], [29], [61] Tùy thu c vào thành ph n gen c a con lai soma mà bi u hi n m t s các bi n ñ i v tính tr ng hình thái và ph n ng l i s xâm nhi m virus PVX b i vector (Thieme và cs, 2000) M t s con lai soma ñư c lai l i thành công v i dòng khoai tây tr ng mà v n bi u hi n tính. .. ñ khoai tây ñã khoai tây ñã ñư c tìm th y ng d ng các k thu t c a công ngh sinh h c hi n ñ i (tin sinh h c, ch th phân t ) nh m nhanh chóng t o các gi ng khoai tây theo ñ nh hư ng mong mu n D.Milbourne và c ng s (1998) ñã thành công trong vi c phân l p, ñánh giá và l p b n ñ SSR cho khoai tây Các nhà nghiên c u ñã thi t k và t ng h p thành công 120 c p m i v i v trí chính xác trên ADN c a khoai tây. .. nhi u tác gi nghiên c u thành công Các tác gi này th a nh n có th t h p ñư c các ñ c tính kháng b nh (virus PVY, PVX, m c sương, r p) c a b m vào con lai soma và các ñ c tính này có th quan sát rõ trên ñ ng ru ng Tuy nhiên nh ng dòng con lai soma có nhi u bi n d trên ñ ng ru ng c n ph i ch n l c [31], [12], [29], [27], [25], [54] Th ch và c ng s (1993) ñã ch n l c thành công 14 dòng khoai tây nh b i . ñề tài: Nghiên cứu xác ñịnh các con lai soma khoai tây và các ñặc tính nông sinh học của các dòng con lai ñó”. 1.2. Mục ñích và yêu cầu 1.2.1. Mục ñích Xác ñịnh ñược con lai soma heterozygous. DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI = = = = = = = = NGUYỄN THỊ THỦY NGHIÊN CỨU XÁC ðỊNH CÁC CON LAI SOMA KHOAI TÂY VÀ CÁC ðẶC TÍNH NÔNG SINH HỌC CỦA CÁC DÒNG CON. tươi của các dòng lai soma và “bố mẹ” của chúng 51 4.5. ðánh giá tính kháng bệnh PVX, PVY của các con lai và dòng “bố mẹ” gốc 52 4.5.1. ðánh giá tính kháng bệnh virus PVX, PVY của các con lai