ĐẶT VẤN ĐỀ Sự ra đời của sinh dược học đã mở ra một quan điểm mới trong ngành dược học nói chung và khoa học bào chế nói riêng. Sinh dược học đã gắn kết ý nghĩa “sinh học” với kỹ thuật bào chế, đánh giá chất lượng và sử dụng thuốc… Vì vậy, nhiều dạng thuốc mới có hiệu lực tốt đã ra đời và được sử dụng trong điều trị. Trên cơ sở hiểu biết về sinh học thời khắc, bệnh học thời khắc đã tập trung nghiên cứu về nhịp sinh học và các chu kỳ phát triển của một số bệnh (tim mạch, hen, khớp, loét dạ dày - tá tràng,….). Bào chế thời khắc chủ yếu dựa trên công nghệ bào chế thuốc giải phóng có kiểm soát và giải phóng theo chương trình. Thuốc giải phóng theo nhịp (GPTN) phải phù hợp với nhịp sinh học của cơ thể và chu kỳ của bệnh. Hiện nay, viên diltiazem giải phóng theo nhịp chưa có trên thị trường thuốc Việt Nam. Vì vậy, để nâng cao hiệu quả dự phòng và điều trị của diltiazem đối với bệnh nhân bị cơn đau thắt ngực, luận án tiến hành đề tài: “Nghiên cứu bào chế và đánh giá sinh khả dụng của viên nén diltiazem giải phóng theo nhịp” với các mục tiêu sau: 1. Bào chế được viên nén diltiazem giải phóng theo nhịp 60mg có thời gian tiềm tàng từ 5-6 giờ. 2. Xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở và đánh giá được độ ổn định của chế phẩm nghiên cứu. 3. Đánh giá được sinh khả dụng của viên nghiên cứu trên chó thực nghiệm. * Những đóng góp mới của luận án: 1 - Đã tối ưu hoá công thức và xây dựng được kỹ thuật bào chế viên nén DIL GPTN 60 mg theo phương pháp bao màng mỏng ở qui mô phòng thí nghiệm (công suất 3000 viên/mẻ). Chế phẩm có đầy đủ đặc tính của viên GPTN. Đây là dạng bào chế hiện đại trên thế giới, nhưng còn mới mẻ ở nước ta. - Đã tiêu chuẩn hoá chất lượng và đánh giá được độ ổn định của chế phẩm bào chế được. - Đã xây dựng được phương pháp xử lý mẫu và ứng dụng phương pháp HPLC-MS/MS để định lượng DIL trong huyết tương chó. Bước đầu đánh giá được sinh khả dụng và xác định được một số thông số dược động học của viên nén DIL GPTN 60mg trên chó thực nghiệm. * Bố cục, cấu trúc luận án: Luận án bao gồm 135 trang. Trong đó đặt vấn đề: 2 trang; chương 1 (tổng quan tài liệu) 33 trang; chương 2 (nguyên vật liệu, trang thiết bị, đối tượng và phương pháp nghiên cứu) 20 trang; chương 3 (kết quả nghiên cứu) 59 trang; chưong 4 (Bàn luận) 19 trang; Kết luận và kiến nghị: 2 trang. * Tài liệu tham khảo: Luận án tham khảo 118 tài liệu. Trong đó có 8 tài liệu tiếng Việt, 110 tài liệu tiếng Anh. CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1. Thuốc giải phóng theo nhịp 1.1.1. Bệnh học thời khắc 2 Do các cơ quan trong cơ thể sống hoạt động theo nhịp sinh học, nên bệnh cũng diễn biến theo chu kỳ, theo quy luật của bệnh học thời khắc. Các bệnh có nhịp ngày đêm (circadian rhythms) thể hiện rõ ràng gồm có: Bệnh hen, bệnh viêm khớp, bệnh tim mạch, bệnh viêm loét dạ dày - tá tràng và một số bệnh khác. 1.1.2. Bào chế thời khắc Theo S. Arora: “Thuốc giải phóng theo nhịp là một hệ thống phân phối dược chất “đúng nơi”, “đúng thời điểm” và” đúng liều”. Những thuốc này phù hợp với chu kỳ sinh học của cơ thể và chu kỳ của bệnh”. Thuốc GPTN thực chất là dạng thuốc giải phóng có kiểm soát. Đặc điểm chính của dạng thuốc này là thời gian tiềm tàng (Tlag - lag time). 1.1.3. Kỹ thuật bào chế thuốc giải phóng theo nhịp Hiện nay, hệ phân phối thuốc theo nhịp được phân loại thành 3 nhóm chính: hệ kiểm soát thời gian, hệ kiểm soát bởi tác nhân kích thích và hệ được điều khiển từ bên ngoài. 1.2. Diltiazem và bào chế diltiazem giải phóng theo nhịp 1.2.1. Diltiazem hydroclorid Công thức hoá học; tính chất lý, hoá; phương pháp định lượng; dược động học, tác dụng dược lý và chỉ định; tương tác thuốc và một số biệt dược kiểm soát giải phóng. 1.2.2. Một số nghiên cứu về kỹ thuật bào chế dạng thuốc giải phóng theo nhịp của diltiazem 3 * Dạng viên nén: Được bào chế theo phương pháp bao khô và bao màng mỏng, với TD trương nở trong viên nhân, màng bao là một polyme không thấm nước hoặc bị ăn mòn bởi pH đường tiêu hoá. * Dạng hạt và pellet: Được thực hiện chủ yếu bằng thiết bị tầng sôi, với polyme tạo màng là các Eudragit. 1.3. Tương đương sinh học và một số phương pháp đánh giá tương đương sinh học của chế phẩm diltiazem giải phóng theo nhịp Phương pháp chiết DIL từ dịch sinh học (phương pháp chiết lỏng-lỏng, chiết pha rắn và tủa protein); định lượng DIL trong dịch sinh học (phương pháp HPLC, sắc ký lỏng khối phổ, sắc ký khí,…) và đánh giá SKD trên chó hoặc người. Trong đó, định lượng DIL trong dịch sinh học bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ và xử lý mẫu bằng chiết lỏng-lỏng được sử dụng nhiều, cho kết quả tin cậy. CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu - Nguyên liệu, hoá chất, tá dược đạt tiêu chuẩn các Dược điển, hoặc tinh khiết phân tích hay tiêu chuẩn của nhà sản xuất, đáp ứng yêu cầu nghiên cứu. Diltiazem hydroclorid đạt tiêu chuẩn BP 2005. 4 - Thiết bị được sử dụng là các thiết bị bào chế và phân tích tin cậy của các trường đại học và viện kiểm nghiệm có uy tín trong nước. - Thuốc đối chiếu: Viên nén qui ước Tildiem 60 mg: SĐK VN-5756-08 (hãng Sanofi), hạn sử dụng: 03/2012. - Động vật thí nghiệm: Chó đực ta khoẻ mạnh, cân nặng 10-12 kg, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp nghiên cứu bào chế Bào chế viên nén DIL GPTN gồm 2 giai đoạn chính là: Bào chế viên nhân và bao màng kiểm soát giải phóng DC cho viên nhân, cụ thể: * Bào chế viên nhân DIL: Viên nhân được bào chế bằng phương pháp xát hạt ướt. TD độn, TD siêu rã và DC được nghiền mịn, rây qua rây 0,315mm và trộn đều. Thêm TD dính lỏng (PVP 5% trong ethanol 96%) vào nhào ẩm, ủ khối bột trong 30 phút. Xát hạt qua rây có kích thước 1 mm. Hạt được sấy ở 50-60°C trong 40 phút, sửa hạt. Sấy tiếp ở 50-60°C đến khi độ ẩm hạt còn nhỏ hơn 4%. Hạt khô được trộn với 2% TD trơn (talc:magnesi stearat). * Bào chế viên nén DIL GPTN: Viên nhân được bao màng theo 2 phương pháp (phương pháp bao khô và bao màng mỏng). 2.2.2. Phương pháp đánh giá tiêu chuẩn chất lượng và độ ổn định của viên nén diltiazem giải phóng theo nhịp a) Đánh giá tiêu chuẩn chất lượng * Đánh giá một số chỉ tiêu của hạt và bột: Khối lượng riêng biểu kiến, độ trơn chảy, độ ẩm. 5 * Đánh giá một số chỉ tiêu của viên nén: Lực gây vỡ viên, độ mài mòn, khối lượng màng bao, định tính, độ đồng đều khối lượng, độ đồng đều hàm lượng; độ hoà tan theo USP 30. b) Phương pháp đánh giá độ ổn định: Theo quy định của FDA và của tổ chức y tế thế giới. Nghiên cứu dài hạn: Điều kiện thực tại phòng thí nghiệm (18 tháng) và điều kiện lão hoá cấp tốc (6 tháng). 2.2.3. Phương pháp đánh giá sinh khả dụng của viên nén diltiazem giải phóng theo nhịp trên chó thực nghiệm a) Xây dựng và thẩm định phương pháp HPLC – MS/MS để định lượng diltiazem trong huyết tương chó * Xây dựng phương pháp: Xử lý mẫu huyết tương theo phương pháp chiết lỏng-lỏng. Lấy 1ml huyết tương chó cho vào ống nghiệm chiết. Sau đó, thêm 500 µl dung dịch nội chuẩn felodipin nồng độ 1,0µg/ml. Thêm 1,0ml dung dịch amoniac 0,1M và 7ml hỗn hợp dung môi diethylether-cloroform (7:3). Lắc đều trong khoảng 10 phút, ly tâm, lấy lớp dung môi. Bốc hơi dung môi dưới dòng khí nitơ, thu lấy cắn. Hòa tan cắn trong 1 ml pha động. Sau khi lọc qua màng lọc 0,45 µm, tiêm vào cột sắc ký 10µl. * Điều kiện sắc ký: Khảo sát các điều kiện sắc ký của phương pháp HPLC-MS/MS gồm: Cột C18 (50 x 3 mm; 2,1µm), nhiệt độ cột: 40°C, pha động: Methanol-amoni acetat 2 mM (90:10), tốc độ dòng: 0,3 ml/phút, thể tích tiêm mẫu: 10µl, kiểu phổ khối: MS/MS, nguồn ion hóa ESI (+). b) Thẩm định phương pháp định lượng diltiazem trong huyết tương: Độ đặc hiệu - chọn lọc của phương pháp, đường chuẩn và khoảng tuyến tính, xác định giới hạn định lượng dưới, độ đúng và độ chính xác trong ngày và khác ngày, hiệu suất chiết, độ ổn định. c) Đánh giá sinh khả dụng trên chó 6 * Thiết kế nghiến cứu - bố trí thí nghiệm: Theo phương pháp thiết kế chéo đôi, ngẫu nhiên đơn liều của FDA được thực hiện trên 6 chó. * Lấy và bảo quản mẫu huyết tương: Lấy mẫu máu tại thời điểm: 0- 1 - 2 - 3 - 4 - 5 - 6 - 7 - 8 - 9 - 10 - 11 - 12 - 24 giờ (thuốc thử); 0 - 1 - 2 - 3 - 4 - 5 - 6 - 7 - 8 - 9 - 10 - 11 - 12 - 16 - 24 giờ (thuốc chứng). * Xác định các thông số dược động học và đánh giá kết quả: Với AUC , C max , MRT sử dụng ‘‘khoảng tin cậy 90%’’; Tmax so sánh theo phương pháp thống kê phi tham số. 2.2.4. Công cụ tính toán số liệu, thiết kế thí nghiệm và tối ưu hoá Bố trí thí nghiệm: Theo mô hình mặt hợp tử tại tâm sử dụng phần mềm Modde 8.0. Tối ưu hoá: Bằng phần mềm Inform 3.1. Tính toán các thông số dược động học: Bằng phần mềm Kinetica 4.4. Các số liệu thống kê: Bằng phần mềm EXCEL 2003. Các kết quả được xử lý và biểu thị trong luận án dưới dạng: Giá trị trung bình ( X ), độ lệch chuẩn (SD) và độ lệch chuẩn tương đối (RSD %). CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Kết quả nghiên cứu bào chế 7 3.1.1. Định lượng diltiazem bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV và HPLC * Phương pháp quang phổ hấp thụ UV: Dung dịch DIL có một cực đại hấp thụ tại 237nm. Kết quả xây dựng đường chuẩn cho thấy: Trong khoảng nồng độ DIL khảo sát từ 4 - 12 µg/ml, đường chuẩn của DIL thu được là một đường thẳng tuyến tính, có phương trình hồi quy y = 0,047x + 0,0417 với hệ số tương quan R 2 = 0,9997. Như vậy, có sự tương quan tuyến tính giữa mật độ quang và nồng độ dung dịch trong khoảng khảo sát. * Phương pháp HPLC: a) Điều kiện sắc ký - Pha tĩnh: Cột Symmetry C18 (4,6 x 150 mm, 5 µm). - Nhiệt độ cột: 25°C. - Pha động: Methanol: đệm phosphat 0,05M; pH 4,5 (60:40). - Tốc độ dòng: 1 ml/phút. - Detector: UV tại bước sóng 236 nm. - Thể tích tiêm: 20 µl b) Khảo sát độ tương thích của hệ thống: Bằng cách tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn có nồng độ 10µg/ml cho các giá trị về thời gian lưu (TR)=3,896 phút, RSD của diện tích pic=0,09%, hệ số bất đối xứng=1,286, số đĩa lý thuyết=2184. 8 c) Khảo sát độ đặc hiệu của phương pháp: Trong mẫu thử, pic của DIL xuất hiện sau 3,896 phút. Tại vị trí pic của DIL, không thấy xuất hiện pic lạ trên sắc ký đồ của mẫu trắng. Điều đó chứng tỏ TD và dung môi pha động không làm ảnh hưởng đến kết quả định lượng DIL bằng phương pháp HPLC. d) Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp: Trong khoảng nồng độ từ 6 - 16 µg/ml, có sự phụ tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ DIL với hệ số tương quan R 2 = 0,9996. Trên cơ sở đó, lựa chọn nồng độ khoảng 10 µg/ml để định lượng DIL trong chế phẩm. e) Khảo sát độ lặp lại của phương pháp: Với chương trình sắc ký đã chọn, phương pháp định lượng DIL có độ chính xác cao, độ lệch chuẩn tương đối là 0,36% (<2%). g) Khảo sát độ đúng của phương pháp: Phương pháp có tỷ lệ tìm lại là 100,45% và độ lệch chuẩn tương đối 0,53% (< 2%). 3.1.2. Nghiên cứu bào chế viên nén diltiazem giải phóng theo nhịp theo phương pháp bao khô 3.1.2.1. Khảo sát công thức viên nhân Khảo sát một số thành phần trong công thức viên nhân như sau: DIL: 60 mg; Tá dược trương nở: 10 - 30 %; Tá dược độn: 20 - 40 %; Talc:magnesi stearat (1:1): 2%; Dung dịch PVP 5% trong EtOH 96% vừa đủ; tổng khối lượng viên: 150 mg. Cố định thành phần của vỏ bao: Tỷ lệ EC:lactose = 2:1; Lực nén: 5000KG/cm 2 ; Thời gian nén: 15 giây; Khối lượng vỏ: 250 mg. 9 + Khảo sát một số tá dược trương nở: Tlag của các viên tăng lên theo thứ tự: L-HPC > SSG > Ac-di- sol. Các CT1 và CT3, DIL đều giải phóng > 80% trong 1 giờ sau pha tiềm tàng. + Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ L-HPC đến thời gian tiềm tàng: Khi tỷ lệ L-HPC tăng lên, Tlag giảm đi đáng kể. Đồng thời, DIL được giải phóng nhanh sau pha tiềm tàng (1 giờ). Khi tỷ lệ L-HPC là 0 %, viên không cho Tlag. + Khảo sát ảnh hưởng của tá dược độn trong công thức viên nhân: Viên nén không có Avicel trong nhân có Tlag rất dài (khoảng 10 giờ) và sau pha tiềm tàng phải mất 2 giờ chưa giải phóng được 80% hàm lượng DIL. 3.1.2.2. Khảo sát công thức vỏ bao Để khảo sát ảnh hưởng của thành phần vỏ bao đến Tlag, cố định thành phần viên nhân như CT1, gồm: DIL:60mg; L-HPC:15 mg; Lactose:40 mg; Avicel PH 101:35 mg; Talc:magnesi stearat (1:1):2%; Dung dịch PVP 5 % vừa đủ; Lực gây vỡ viên:6±0,5 kP. + Khảo sát lựa chọn tá dược kéo dài giải phóng: Khi tỷ lệ EC/HPMC càng lớn Tlag càng kéo dài (từ 2 - 14 giờ) và thời gian DIL giải phóng sau pha tiềm tàng đều khá dài (≥ 2 giờ). + Khảo sát tỷ lệ EC/lactose: Tlag của viên tỷ lệ thuận với tỷ lệ EC/lactose. Ở cả 5 công thức, khả năng giải phóng DIL được kiểm soát tốt trong pha tiềm tàng ( tỷ lệ DIL giải phóng ≤ 10%) và sau pha tiềm tàng, DIL được giải phóng nhanh chóng (≈ 1 giờ). 10 [...]... bình là 5,5 giờ, tương đương với giá trị Tlag do phần mềm dự đoán (5,4 giờ) 3.2 Kết quả nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và đánh giá độ ổn định của viên nén diltiazem giải phóng theo nhịp 3.2.1 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của viên nén diltiazem giải phóng theo nhịp 3.2.1.1 Xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng viên nén diltiazem giải phóng theo nhịp - Tính chất: Viên nén bao phim, bề mặt nhẵn, màu trắng... BÀN LUẬN 4.1 Về nghiên cứu bào chế viên nén Diltiazem giải phóng theo nhịp 4.1.1 Về phương pháp bao khô 23 Khi bào chế viên nén DIL GPTN, sử dụng phương pháp bao khô gồm có hai phần: Viên nhân chứa DIL, TD siêu rã và lớp vỏ bao ngoài là một polyme ít thấm nước Trong đề tài luận án, sử dụng TD siêu rã bên trong viên nhân là L-HPC với tỷ lệ là 15 mg /viên và polyme tạo màng là EC Về kỹ thuật bào chế: Viên. .. Tiến hành bào chế theo công thức tối ưu và đánh giá độ hòa tan Kết quả cho Tlag thực nghiệm trung bình của viên tối ưu là 5,75±0,26 giờ, tương đương với lý thuyết (6 giờ) Viên giải phóng nhanh và hoàn toàn DIL trong 1 giờ sau pha tiềm tàng, đạt yêu cầu của viên GPTN 3.1.3 Nghiên cứu bào chế viên nén diltiazem giải phóng theo nhịp theo phương pháp bao màng mỏng 3.1.3.1 Khảo sát công thức viên nhân +... dịch sinh học 4.3.2 Về nghiên cứu sinh khả dụng của viên nén diltiazem giải phóng theo nhịp trên chó So sánh SKD in vivo của viên nén DIL GPTN và viên nén Tildiem trên chó bước đầu cho thấy: Bằng phương pháp phân tích phương sai, xác định khoảng tin cậy 90%, giá trị C max, AUC0-∞ của DIL khi uống viên nén DIL GPTN và viên nén Tildiem là tương đương nhau, khác nhau không có ý nghĩa thống kê Nhưng các giá. .. xây dựng và thẩm định được tiêu chuẩn cơ sở của viên nén DIL GPTN 60mg theo các tiêu chí về viên nén của DĐVN IV và tính chất của dạng thuốc GPTN 28 - Đã đánh giá được sự thay đổi về hình thức, hàm lượng và độ hoà tan của viên nén DIL GPTN ở điều kiện thường (18 tháng) và điều kiện lão hoá cấp tốc (6 tháng) Dự kiến tuổi thọ của thuốc là 30 tháng 3 Về đánh giá sinh khả dụng - Đã xây dựng và thẩm định... 4.2.1 Về nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn của viên nén diltiazem giải phóng theo nhịp 25 Các tiêu chuẩn của viên nén DIL GPTN 60 mg cơ bản được xây dựng dựa theo DĐVN IV và USP 30 Trong quá trình đo độ hoà tan, nhận thấy: Từ thời điểm ban đầu đến khi xuất hiện vết nứt trên bề mặt viên, DIL gần như không giải phóng ra khỏi viên nén DIL GPTN Khi viên xuất hiện vết nứt, thì hàm lượng DIL giải phóng vào dịch... thời gian trong huyết tương chó sau khi uống viên nén DIL GPTN và viên nén Tildiem 60mg 3.3.2.2 Phân tích dược động học và so sánh sinh khả dụng của viên nén diltiazem giải phóng theo nhịp với viên nén Tildiem đối chiếu a Xác định các thông số dược động học Kết quả được trình bày ở bảng 3.45, 3.46 bảng 3.45: Các thông số DĐH trên chó sau khi uống viên nén DIL GPTN 60 mg (n = 6) STT Cmax Tmax AUC0-∞ λZ... giờ KIẾN NGHỊ Kết quả của luận án mới chỉ ở giai đoạn đầu của quá trình nghiên cứu bào chế một dược phẩm nói chung và của viên nén DIL GPTN nói riêng Để kết quả được áp dụng vào sản xuất, xin được kiến nghị một số vấn đề sau: - Hoàn thiện công thức và quy trình bào chế có quy mô lớn hơn 29 - Tiếp tục đánh giá độ ổn định và đánh giá SKD, TĐSH trên người tình nguyện ... đông và rã đông: Khác nhau không có ý nghĩa thống kê với p đều >0,05 - Độ ổn định trong quá trình xử lý mẫu: Khác nhau không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05) - Độ ổn định dài ngày: Khác nhau không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05) 3.3.2 Kết quả đánh giá sinh khả dụng của viên nén diltiazem giải phóng theo nhịp trên chó 19 3.3.2.1 Xác định nồng độ diltiazem trong huyết tương chó sau khi uống viên nén diltiazem. .. Nghiên cứu độ ổn định viên nén diltiazem giải phóng theo nhịp 3.2.2.1 Về hình thức Các viên bảo quản 18 tháng ở điều kiện thường và 6 tháng ở điều kiện lão hoá cấp tốc không có thay đổi so với thời điểm ban đầu 3.2.2.2 Về độ hoà tan Tlag của viên nén DIL GPTN thay đổi không đáng kể Tỷ lệ DIL giải phóng sau pha tiềm tàng sau 45 phút vẫn lớn hơn 80% Ở điều kiện lão hoá cấp tốc, viên có xu hướng kéo dài . phòng và điều trị của diltiazem đối với bệnh nhân bị cơn đau thắt ngực, luận án tiến hành đề tài: Nghiên cứu bào chế và đánh giá sinh khả dụng của viên nén diltiazem giải phóng theo nhịp . quả đánh giá sinh khả dụng của viên nén diltiazem giải phóng theo nhịp trên chó 18 3.3.2.1. Xác định nồng độ diltiazem trong huyết tương chó sau khi uống viên nén diltiazem giải phóng theo nhịp. nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp nghiên cứu bào chế Bào chế viên nén DIL GPTN gồm 2 giai đoạn chính là: Bào chế viên nhân và bao màng kiểm soát giải phóng DC cho viên nhân, cụ thể: * Bào chế viên