BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI    NGUYỄN VĂN NGHIỄM NGHIÊN CỨU ðA DẠNG DI TRUYỀN CÂY KHOAI MÔN – SỌ BẰNG CHỈ THỊ ADN LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: C«ng nghÖ sinh häc Mã số: 60.42.80 Người hướng dẫn: TS Nguyễn Văn Giang HÀ NỘI - 2012 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa hề ñược sử dụng ñể bảo vệ một hoạc vị nào Tôi xin cam ñoan rằng mọi sự giúp ñỡ cho việc hoàn thành luận văn này ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả Nguyễn Văn Nghiễm Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… ii LỜI CẢM ƠN ðể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tôi ñã nhận ñược sự quan tâm, giúp ñỡ và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi của Thầy Cô, Gia ñình, bạn bè, ñồng nghiệp trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy giáo TS Nguyễn Văn Giang, người ñã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo ñóng góp những ý kiến quý báu cho tôi trong suốt quá trình thực hiện ñề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới KS. Tống Văn Hải cùng các thầy, cô và cán bộ trong bộ môn Công nghệ sinh học ứng dụng – Khoa Công nghệ sinh học ñã giúp ñỡ và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi nhất giúp em hoàn thành ñề tài thực tập tốt nghiệp của mình. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Gia ñình, bạn bè, ñồng nghiệp ñã giúp ñỡ, ñộng viên tôi trong suốt quá trình học tập, ñóng góp những ý kiến quý báu cho tôi hoàn thành ñược nghiên cứu này. Tác giả Nguyễn Văn Nghiễm Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… iii MỤC LỤC LỜI CAM ðOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii PHẦN I MỞ ðẦU 1 1.1 ðặt vấn ñề 1 1.2 Mục ñích và yêu cầu 2 PHẦN II TỔNG QUAN VỀ VẤN ðỀ NGHIÊN CỨU 3 2.1 Giới thiệu về cây khoai môn sọ 3 2.1.1 Nguồn gốc 3 2.1.2 Phân loại 3 2.1.3 Phân bố 4 2.2 ðặc tính thực vật 6 2.3 Một số yêu cầu sinh thái của cây khoai sọ 8 2.4 Giá trị kinh tế và sử dụng 9 2.4 Tình hình sản xuất cây khoai môn - sọ 11 2.4.1 Tình hình sản xuất cây khoai môn- sọ trên thế giới 11 2.4.2 Tình hình sản xuất khoai môn - sọ ở Việt Nam 12 2.5 Tình hình nghiên cứu bảo tồn và khai thác sử dụng nguồn gen khoai Môn – Sọ (Colocasia esculenta(L.) Schott) 14 2.5.1 Các phương pháp bảo tồn 14 2.5.2 Thu thập và ñánh giá nguồn gen 15 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… iv 2 ða dạng di truyền 18 2.6.1 ða dạng sinh học ( Biology diversity ) 18 2.6.2 ða dạng di truyền ( Genetic diversity ) 18 2.6.3 Hiện tượng ña hình ( Polymophism ) 18 2.6.4. Ý nghĩa việc nghiên cứu ña dạng di truyền sinh vật 18 2.7 Các phương pháp nghiên cứu ña dạng di truyền 19 2.7.1 Chỉ thị phân tử trong nghiên cứu ña dạng di truyền 19 2.7.2 Khái niệm 19 2.7.3 Phân loại bằng chỉ thị phân tử DN 19 2.7.4 Ưu ñiểm của việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu bộ gen thực vật 21 2.7.5 Ứng dụng chỉ thị phân tử 22 2.7.6 Phương pháp sử dụng chỉ thị hình thái( kiểu hình) 23 2.7.7 Phương pháp sử dụng chỉ tiêu hóa sinh 24 2.7.8 Phương pháp nghiên cứu ña dạng di truyền dựa vào chỉ thị RAPD 24 2.9. Tình hình nghiên cứu ña dạng di truyền 25 2.9.1 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài 25 2.9.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 27 PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 3.1 Vật liệu, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 30 3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 30 3.1.2 Thời gian, ñịa ñiểm nghiên cứu 31 3.2 Nội dung và các phương pháp nghiên cứu 31 3.2.1 Nghiên cứu các ñặc ñiểm nông sinh học 31 3.2.2 Áp dụng chỉ thị SSR và RAPD ñể ñánh giá sự ña dạng của các mẫu giống khoai môn – sọ. 32 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… v 4.1 Nghiên cứu sự ña dạng về các ñặc ñiểm nông sinh học 37 4.1.1 Phân loại mẫu giống theo ñiều kiện sinh thái 37 4.1 Phân loại mẫu giống theo ñiều kiện sinh thái ( Số thứ tự cũng là số ký hiệu của mẫu giống) 38 4.1.2 Phân loại nguồn gen môn sọ theo ñặc ñiểm hình thái 39 4.1.3 Phân loại mẫu giống theo hình dạng củ và thời gian sinh trưởng 44 4.1.4 Năng suất của mẫu giống thu thập 48 4.2 Phân tích ña hình bằng chỉ thị RAPD và SSR 49 4.2.1 Chiết tách ADN 49 4.2.2 Kết quả phân tích ña hình DNA bằng kỹ thuật PCR-RAPD 50 4.2.3 Kết quả phân tích ña hình DNA bằng kỹ thuật PCR-SSR 53 4.2.4 Phân tích kết quả phần PCR-RAPD bằng phần mềm Ntsyspc2.1 56 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 5.1 Kết luận 60 5.2 ðề nghị 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… vi DANH MỤC VIẾT TẮT MAS : Marker assisted selection NSCT : Năng suất cá thể NST : Nhiễm sắc thể PCR : Polymerase Chain reaction (phản ứng chuỗi polymeraza) QTLs : Quantitative trait loci RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA RFLP : Restriction Fragment Length polymorphism SSR : Simple sequency repeat TGST : Thời gian sinh trưởng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… vii DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1 Thành phần các chất trong củ khoai môn – sọ 10 2.2 Phân bố khoai môn – sọ trên thế giới 11 2.3 Diện tích và năng suất của các nước 12 3.1 Các mẫu giống khoai môn - sọ nghiên cứu 30 3.2 Thành phần dung dịch ñệm chiết tách DNA 33 3.3 Thành phần dung dich dệm TE 33 3.4 Các chỉ thị sử dụng nghiên cứu ña dạng 34 3.5 Chu trình nhiệt nhân ñoạn DNA 35 4.1 Loại mẫu giống theo ñiều kiện sinh thái 38 4.2 Tỷ lệ phân bố của các giống khoai môn - sọ 39 4.3 ðặc ñiểm nông sinh học chính của các mẫu khoai môn - sọ 40 4.3 ðặc ñiểm nông sinh học chính của các mẫu khoai môn - sọ 41 4.4 Tỷ lệ phân loại nguồn gen môn sọ theo ñặc ñiểm hình thái 42 4.5 Phân loại mẫu giống theo hình dạng củ 45 4.6 Tỷ lệ phân loại mẫu giống theo hình dạng củ và TG sinh trưởng 47 4.7 Năng suất của các mẫu giống thu thập 48 4.8 Số allen nhân lên bằng sử dụng mồi RAPD và SSR 56 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… viii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 4.1 Màu sắc cuống lá 44 4.2 Một số dạng củ của khoai môn - sọ 47 4.4 ðiện di sản phẩm PCR chỉ thị 51 4.5 ðiện di sản phẩm PCR chỉ thị A 52 4.6 ðiện di sản phẩm PCR chỉ thị N07 52 4.7 ðiện di sản phẩm PCR chỉ thị N14 53 4.8 ðiện di sản phẩm PCR chỉ thị Uq 75-100 54 4.9 ðiện di sản phẩm PCR chỉ thị Uq90-102 55 4.10 Sơ ñồ biểu diễn mối quan hệ di truyền của 60 mẫu giống khoai môn-sọ 59 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… 1 PHẦN I. MỞ ðẦU 1.1. ðặt vấn ñề Cây khoai môn - sọ (Colocasia esculenta), thuộc họ Ráy (Araceae), có chất lượng củ ngon, cung cấp nhiều vitamin và dinh dưỡng. Khoai môn - sọ có ưu ñiểm vừa là cây lương thực, cây thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, làm thuốc chữa bệnh, vừa có tiềm năng chế biến cao. Việt Nam có nguồn gen cây họ Ráy rất ña dạng và là quê hương của một số loài cây môn - sọ quan trọng (TANSAO project report, 2002). Trong thời gian vừa qua chúng tôi ñã thu thập ñược 60 mẫu giống khoai môn - sọ ở các ñịa phương khác nhau. Tuy nhiên ở các ñịa phương này, tên gọi của các giống khoai môn - sọ không thống nhất. Việc phân biệt các giống khoai môn - sọ chủ yếu dựa vào hình thái, ñiều này gặp không ít khó khăn trong việc chọn giống cũng như bảo tồn nguồn gen cây khoai môn - sọ. Chính vì vậy, việc mô tả và ñánh giá ña dạng di truyền nguồn gen cây khoai môn - sọ sẽ cung cấp một số thông tin cần thiết về sự biến dị di truyền có ở các vật liệu nghiên cứu. Những thông tin này sẽ ñược sử dụng hữu ích trong công tác chọn tạo giống cũng như bảo tồn cây khoai môn - sọ. ðể ñánh giá mức ñộ ña dạng di truyền của các giống khoai môn - sọ, việc sử dụng chỉ thị phân tử DNA cho ñến nay ñược coi là phương pháp rất hữu hiệu . Bất kỳ ñoạn DNA nào ñược dùng ñể phân biệt giữa hai cá thể, hai dòng hoặc giống khác nhau, ñều có thể ñược xem là chỉ thị phân tử DNA. Hiện nay có rất nhiều chỉ thị DNA ñược sử dụng ñể nghiên của ña dạng di truyền, tuy nhiên hai chỉ thị RAPD và SSR là hai chỉ thị ñược dùng phổ biến nhất. Li Maolin (2000) ñã tiến hành nghiên cứu lựa chọn ñược bộ gồm 32 chỉ thị RAPD phù hợp cho khoai môn - sọ, các chỉ thị này ñã ñược nhiều nhà khoa học sử dụng trong nghiên cứu của mình. Theo Emma S. Mace và Ian D. Godwin,(2002) sử dụng 43 cặp mồi SSR nghiên cứu ña dạng di truyền ở cây khoai môn – sọ và chọn ñược 41 cặp mồi cho cho những vệt băng mong [...]... Nam nh ng nghiên c u v s d ng ch th phân t ñ ñánh giá ña d ng di truy n các gi ng khoai môn - s còn chưa nhi u, m i ch có m t d án h p tác v i CIRAP c a Trung tâm Tài nguyên th c v t ð nghiên c u ña d ng t p ñoàn khoai môn s Vi t Nam, ph c v ñ c l c cho công tác ch n t o gi ng cũng như b o t n ngu n gen cây khoai môn- s , chúng tôi ti n hành ñ tài "Nghiên c u ña d ng di truy n cây khoai môn - s b ng... ðánh giá ñư c s ña d ng di truy n gi a các dòng gi ng khoai môn- s b ng ch th phân t SSR, RAPD k t h p phân tích m t s ñ c ñi m nông sinh h c c a 60 m u gi ng khoai môm- s thu th p Yêu c u - Tr ng các m u gi ng khoai môn- s , nghiên c u các ñ c ñi m nông sinh h c chính - Tách ñư c DNA các m u khoai môn - s thu th p - Ti n hành ph n ng PCR s d ng ch th SSR và RAPD - Phân tích ña d ng di truy n b ng ph n... lo i các gi ng khoai Môn – S Vi t Nam nư c ta, nh ng tài li u nghiên c u v ngu n gen cây khoai Môn - S còn r t ít Ngu n gen khoai Môn – S ñư c thu th p nghiên c u t nh ng năm 60 nhưng ch d ng l i m c ñ mô t sơ b hình thái các nhóm khoai nư c, khoai s ñ a phương (như khoai L i, khoai ð m, khoai M ng hương), chưa quan tâm ñ n nhóm khoai môn Sau ñó d ng l i không th y có tài li u nghiên c u ti p Mãi t... c i c n bón nhi u phân h u cơ Cây khoai môn- s phát tri n tôt nh t trên ñ t có ñ pH kho ng 5,5 6,5 M t ñ c tính quý c a cây khoai môn - s là gi ng có tính ch u m n cao Chính vì v y, Nh t B n và Ai C p cây khoai môn - s ñư c s d ng như cây tr ng ñ u tiên ñ khai hoang ñ t ng p m n 2.4 Giá tr kinh t và s d ng * Thành ph n dinh dư ng Ph n có giá tr kinh t chính c a khoai môn – s là c cái, c con và m t... Theo nhi u tài li u công b cây khoai môn - s có vai trò quan tr ng như ngu n lương th c chính c a các nư c qu n ñ o Thái Bình Dương Cây khoai môn - s còn có giá tr cao v m t văn hóa xã h i các nư c có truy n th ng tr ng lo i cây này Nó ñã d n tr thành 1 hình nh trong văn hóa m th c có m t trong nh ng l h i, ngày l t t, quà t ng … Hơn n a, cây khoai môn - khoai s còn là cây làm tăng ngu n thu nh p... và ðinh Th L c) 2.4 Tình hình s n xu t cây khoai môn - s 2.4.1 Tình hình s n xu t cây khoai môn- s trên th gi i Trong s li u th ng kê c a t ch c lương th c và nông nghi p th gi i ( FAO ) tính ñ n năm 2001, di n tích tr ng cây khoai môn- s trên kh p th gi i ñ t 1,463 tri u ha, năng su t bình quân 6,13 t n/ha và t ng s n lư ng 8,974 tri u t n B ng 2.2 Phân b khoai môn – s trên th gi i Toàn Châu l c Năm... N ð NGHIÊN C U 2.1 Gi i thi u v cây khoai môn s 2.1.1 Ngu n g c Cây khoai môn - s (Colocasia esculenta) là cây m t lá m m thu c chi Colocasia, h Araceae Ngu n g c c a khoai môn s ñang còn là v n ñ c n ñư c ti p t c nghiên c u, chưa có ý ki n th ng nh t c a nhi u nhà khoa h c chuyên nghiên c u v cây này Tuy nhiên, g n ñây nhi u tác gi ñ u th ng nh t r ng r t nhi u d ng hoang d i và d ng tr ng c a khoai. .. ng…( Ngu ên Th ng c Hu 2004) 2.2 ð c tính th c v t Khoai môn - s là cây có kh năng thích nghi cao v i ñi u ki n ngo i c nh và có kh năng ch ng ch u ñư c v i ñi u ki n b t thu n l i như : kh năng ch u bóng râm, ch u m n, ñ t có ñ m cao … vì v y chúng ñư c phân b r t r ng rãi Cây khoai môn - s là cây thân th o, thư ng cao t 0,5m ñ n 2,0m Cây khoai môn -s g m có 1 c cái gi a thư ng n m dư i ñ t t ñó phát... thái mà nh ng cây tr ng khác r t khó tìm ñư c ch ñ ng Trong s n xu t ít nh t khoai môn s có th phát tri n ñư c trên các chân ñ t sau: • ð t ng p và ñ t h u cùng v i cây lúa c a vùng trũng • M t s gi ng môn s có th ch ng ch u t t v i ñ t m n • Khoai môn s là lo i cây có th phát tri n trong ñi u ki n b che bóng, vì th nó là cây tr ng lý tư ng ñ tr ng xen v i các cây tr ng thân g như d a, cây ăn qu … Trư... La, huy n Tràng ð nh t nh L ng Sơn và huy n Th ch An t nh Cao B ng… 2.5.2 Thu th p và ñánh giá ngu n gen m c ñ gi ng cây tr ng, nh ng nghiên c u ñánh giá s ña d ng ngu n gen cây khoai môn - s còn nhi u t n t i chưa có m t s phân lo i hoàn ch nh các gi ng (Ghani, 1984) Cây khoai môn -s là cây nhân gi ng vô tính, tuy nhiên kh năng bi n d c a các dòng vô tính x y ra khá m nh m Thêm vào ñó là s ch n l c . ña dạng di truyền cây khoai môn - sọ bằng chỉ thị phân tử DNA”. 1.2. Mục ñích và yêu cầu Muc ñích ðánh giá ñược sự ña dạng di truyền giữa các dòng giống khoai môn- sọ bằng chỉ thị phân tử. ña dạng di truyền sinh vật 18 2.7 Các phương pháp nghiên cứu ña dạng di truyền 19 2.7.1 Chỉ thị phân tử trong nghiên cứu ña dạng di truyền 19 2.7.2 Khái niệm 19 2.7.3 Phân loại bằng chỉ thị. Một số dạng củ của khoai môn - sọ 47 4.4 ðiện di sản phẩm PCR chỉ thị 51 4.5 ðiện di sản phẩm PCR chỉ thị A 52 4.6 ðiện di sản phẩm PCR chỉ thị N07 52 4.7 ðiện di sản phẩm PCR chỉ thị N14