8/22/2014 1 KIỂM ĐỊNH NGUỒN GỐC THỰC PHẨM BF5320 KỸ THUẬT DNA – PCR: Kiểm định nguồn gốc TH.S HOÀNG QUỐC TUẤN TS. NGUYỄN THỊ THẢO KỸ THUẬT DNA – PCR: Kiểm định nguồn gốc Nguyên tắc của PCR The components of nucleotides (Picture: Andy Vierstraete, 1999) 8/22/2014 2 Nguyên tắc của PCR Formation of a DNA chain from individual nucleotides (Picture: Andy Vierstraete, 1999 Structure of DNA in a cell (Picture: Andy Vierstraete, 1999) Nucleus: Nhân Chromosomes: Nhiễm sắc thể Nguyên tắc của PCR Nguyên tắc của PCR Bước 1: Biến tính 1 phút, 94 o C Bước 2: Gắn mồi 45 giây, 54 o C Bước 3: Kéo dài phân tử 2 phút, 72 o C http://vi.wikipedia.org/wiki/PCR 8/22/2014 3 Nguyên tắc của PCR Các chu kỳ của kỹ thuật PCR QUI TRÌNH PHÂN TÍCH PCR Giới thiệu môn học 8 Các vi sinh vật, động vật Thu nhận mẫu Kỹ thuật PCR lần đầu tiên được Mullis và cộng sự mô tả vào năm 1986 và cũng do chính phát minh này Mullis đã được trao giải nobel vào năm 1993 Bioinformatics 9 CÁC THÀNH PHẦN CỦA PCR • DNA khuôn • Polymerase • Nucleotide tự do • Dung dịch đệm • Mồi 8/22/2014 4 Bioinformatics 10 DNA khuôn • Là các trình tự DNA dùng để tổng hợp trình tự mục tiêu • DNA khuôn có thể là toàn bộ genome hoặc được giới hạn bởi các enzyme cắt giới hạn • Cả hai mạch đều được sử dụng trong phản ứng PCR Các loại polymerase dùng trong PCR • Tag Polymerase • Pfu Polymerase • Polymerase thế hệ mới Tag polymerase • Thermus aquaticus • Nhiệt độ tối ưu: 75 – 80 o C • Có thể tồn tại 2 giờ ở 92.5 o C, 40’ ở 95 o C, 7’ ở 97.5 o C • Tốc độ: 1,000bp/10s • Sai sót: 1/9,000 8/22/2014 5 Pfu polymerase • Pyrococcus furiosus • Chịu nhiệt tốt hơn Tag polymerase • Có thể tồn tại 6-7h ở 97.5 o C • Tốc độ: 1,000bp/1-2’ • Sai sót: 1/1,300,000 • Có hoạt tính sửa sai Polymerase thế hệ mới • Chịu nhiệt tốt • Tốc độ cao • Sai sót ít • Có thể tái sử dụng nhiều lần Nucleotide tự do • Nucleotide tự do là nguồn nguyên liệu để tổng hợp mạch mới • Trong một số trường hợp, người ta bổ sung một số nucleotide “lạ” 8/22/2014 6 Dung dịch đệm • Ảnh hưởng đến hiệu suất, tính chính xác của phản ứng PCR • Ứng với từng loại polymerase, nhà sản xuất khuyến cáo sử dụng dung dịch đệm tương ứng • Nồng độ Mg 2+ là yếu tố quan trọng: – Thiếu: hoạt động của polymerase kém dẫn đến hiệu suất PCR kém – Thừa: thu nhận một số sản phẩm không đặc hiệu, tính chính xác thấp Mồi-primer • Mồi trong phản ứng sao chép DNA là những trình tự RNA ngắn được tổng hợp bởi enzyme Primase • Mồi trong sinh học phân tử là những đoạn oligonucleotide ngắn được tổng hợp hóa học • Ứng dụng: phản ứng PCR, lai phân tử,… Thiết kế trình tự mồi Bioinformatics Bioinformatics 18 Đặc điểm của mồi • Tính duy nhất: đảm bảo vị trí bắt cặp là DUY NHẤT trên toàn trình tự • Chiều dài mồi: tối thiểu 15 base, thông thường khoảng 17-28 base • Thành phần base: thường là tổng (G+C) khoảng 50-60%, tránh trình tự mồi với (A+T) dài • Kẹp G/C: tính ổn định ở đầu 3’ ảnh hưởng lớn tới hiệu quả phản ứng, thường 3’ của mồi là G hay C 8/22/2014 7 Đặc điểm của mồi (tiếp theo) • Độ ổn định đầu 3’: năng lượng cần để phá hủy sự bắt cặp của 5nu cuối cùng ở đầu 3’, tuy nhiên để tránh bắt cặp nhầm trên các vùng giàu GC, 5nu cuối cùng không nên chứa quá 3G/C • Nhiệt độ nóng chảy (Tm): trong giới hạn 52 o C – 65 o C, không nên cách biệt quá lớn giữa 2 mồi Các tiêu chuẩn thiết kế mồi • Tính duy nhất • Chiều dài: 17-28 base • Thành phần base: G+C (50-60%), tránh A+T dài • Tối ưu hóa sự bắt cặp và kéo dài: đầu 3’ của mồi có độ bền cao và bắt cặp cao • Nhiệt độ nóng chảy trong giới hạn 48-65˚C • Sự khác biệt nhiệt độ nóng chảy mồi xuôi và mồi ngược < 5˚C • Giảm thiểu sự tự tạo thành cấu trúc bậc hai của mồi Ảnh hưởng của cấu trúc bậc 2 • Cấu trúc bậc 2 giữa hai mồi là sự bắt cặp bổ sung toàn bộ hay một phần giữa hai mồi • Cấu trúc bậc 2 làm mồi mất khả năng gắn vào DNA mục tiêu • Giảm số lượng mồi tự do trong môi trường • Giảm hiệu quả của phản ứng PCR 8/22/2014 8 Hairpin Hairpins. Là cấu trúc thứ cấp hình thành trong nội bộ mồi. Giá trị ΔG của các hairpin đầu 3’ không nên <-2 kcal/mol và của các hairpin ở giữa không nên <-3 kcal/mol. Self-Dimer Tự mồi (Self Dimer). Là cấu trúc hình thành giưã các phân tử của cùng loại mồi. Giá trị ΔG của các hairpin đầu 3’ không nên <-5 kcal/mol và của các hairpin ở giữa không nên <-6 kcal/mol. Dimer Là cấu trúc hình thành giữa các phân tử của 2 mồi khác nhau (cặp mồi trong phản ứng PCR). Giá trị ΔG của các hairpin đầu 3’ không nên <-5 kcal/mol và của các hairpin ở giữa không nên <-6 kcal/mol 8/22/2014 9 5’ 3’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ Mồi hợp lệ? Slide 26 Tóm tắt về mồi Tính đc hiu Đặc hiệu cho trình tự đích (tránh các liên kết không đặc hiệu) Tính bn Hình thành thể lai bền với đoạn mẫu trong p/ứ PCR Tính tng thích Các đoạn mồi phải chịu cùng một điều kiện trong p/ứ PCR Tính duy nhất Chiều dài Nhiệt độ hồi tính Sự bắt cặp giữa 2 mồi Cấu trúc mồi Thành phần base Tính bền Đặc tính: Các yếu tố cần quan tâm: Nhiệt độ nóng chảy KỸ THUẬT DNA-PCR KIỂM ĐỊNH NGUỒN GỐC THỰC PHẨM 8/22/2014 10 Ứng dụng PCR trong kiểm định một số loại thực phẩm Cases in Indonesia [...]... thanh, albumin (Lợn) Dịch chiết cơ xương (Lợn, G ) Desmin (G ) Huyết thanh (B ) Protein cơ đã gia nhiệt (Lợn) Huyết thanh albumin (B , Ngựa, Lợn) Albumin (B , Ngựa, Lợn, G ) Dịch chiết Sarcoplasmatic (Lợn) Protein cơ hòa tan (G ) Glycoprotein (Lợn) Protein cơ (Lợn) IgG (Lợn, G , B ) Huyết thanh Protein (Trâu, D , Lừa) S a và s n ph m t Giới hạn phát hiện 1-10% 250 ppm (Thịt lợn) 126 ppm (Gia cầm) 10%... primers 12SM-FW and 12SBT-REV A) Pasteurized samples (6 5°C; 30 min); B) sterilized samples (1 20°C; 20 min) Lines are cow 100% (lane 1 ), cow 10% (lane 2 ), cow 5% (lane 3 ), cow 1% (lane 4 ), cow 0.5% (lane 5 ), cow 0.1% (lane 6 ), and goat 100% (lane 7) NC = negative control; M = molecular weight marker, 1 kb plus DNA ladder (GibcoBRL) 17 8/22/2014 18 8/22/2014 KIỂM ĐỊNH NGUỒN GỐC THỰC PHẨM BF5320 KỸ THUẬT ENZYME... 100% (lane 1 ), cow 10% (lane 2 ), cow 5% (lane 3 ), cow 1% (lane 4 ), cow 0.5% (lane 5 ), cow 0.1% (lane 6 ), and sheep 100% (lane 7) NC = negative control; M = molecular weight marker, 1 kb plus DNA ladder (GibcoBRL) Electrophoretic analysis of the 12S rRNA PCR products obtained from heat-treated milk binary mixtures of cow in sheep using primers 12SM-FW and 12SBT-REV A) Pasteurized samples (6 5°C; 30 min);... primers 12SM-FW and 12SBT-REV A) Pasteurized samples (6 5°C; 30 min); B) sterilized samples (1 20°C; 20 min) Lines are cow 100% (lane 1 ), cow 10% (lane 2 ), cow 5% (lane 3 ), cow 1% (lane 4 ), cow 0.5% (lane 5 ), cow 0.1% (lane 6 ), and sheep 100% (lane 7) NC = negative control; M = molecular weight marker, 1 kb plus DNA ladder (GibcoBRL) Electrophoretic analysis of the 12S rRNA PCR products obtained from... 8/22/2014 KIỂM ĐỊNH NGUỒN GỐC THỰC PHẨM BF5320 KIỂM ĐỊNH NGUỒN GỐC TRONG THỦY SẢN Th.S HOÀNG QUỐC TUẤN TS NGUYỄN THỊ THẢO KIỂM ĐỊNH NGUỒN GỐC TRONG THỦY SẢN? “Quy tắc ứng xử nghề cá có trách nhiệm” (Code of Conduct for Responsible Fisheries - CoC) 1 8/22/2014 2 8/22/2014 Tổ chức Thương mại Thế giới về Vệ sinh An toàn Thực phẩm và Kiểm dịch Động vật (World Trade Organization Sanitary and Phytosanitary-SPS)... 2001/18/EC (A5-0204/2003; 15798/1/2002C5-0131/2003 - 2001/0180(COD )) ; Directive 2000/13/EC of the European Parliament and of the Council of 20 March 2000 Luật liên quan đến vấn đề truy xuất Mỹ Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm (The Food and Drug Administration-FDA) Tổ chức Thủy Hải sản Quốc giá Mỹ (National Marine Fisheries Service-NMFS) KIỂM ĐỊNH NGUỒN GỐC LOÀI Thông tin về loài, Nguồn gốc địa lý... sn- 3) Phân biệt giữa ethyl esters tổng hợp và tự nhiên của docosahexaenoic acid (DHA, C22:6n- 3) và eicosapentaenoic acid (EPA, C20:5n- 3) 13C NMR HPLC GC-MS TLC 6 8/22/2014 ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ TƯƠI CỦA THỊT CÁ Độ tươi (freshness) Cảm nhận cảm quan Thành phần hóa học, mức độ an toàn Quy định nhãn mác: Thông tin là sản phẩm đông lạnh-rã đông ( ối với sản phẩm đông lạnh/rã đông ), Thông tin về ngày giết mỗ (cá... DỊCH ENZYME (ENZYME IMMUNOASSAY) ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) EIA (Enzyme ImmunoAssay) Direct ELISA (ELISA trực tiếp) peptides, protein, antibodies, hormone,… ELISA gián tiếp (Indirect ELISA) Sandwich ELISA ELISA cạnh tranh (competitive ELISA) http://www.vbs.ac.vn/print.php?post=211 • Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là: kháng nguyên, kháng thể và chất tạo màu; thực hiện... horse, 3: 1 ng horse, 4: 0.1 ng horse, 5: 0.01 ng horse, 6: donkey, 7: porcine, 8: beef, 9: lamb, 10: negative control and 11: positive control The result of PCR specificity and sensitivity test for the specific donkey primers M: marker, 1: 100 ng donkey, 2: 10 ng donkey, 3: 1 ng donkey, 4: 0.1 ng donkey, 5: 0.01 ng donkey, 6: horse, 7: porcine, 8: beef, 9: lamb, 10: negative control and 11: positive... của nơi đánh bắt, Giai đoạn phát triền cuối cùng của loài, Sản phẩm biến đổi gen hay không Tự nhiên Nuôi trồng 5 8/22/2014 (b) 2H NMR spectrum ở 76.5 MHz của tune oil c) Phân loại giữa cá hồi vùng Atlantic nuôi thả và tự nhiên bằng phương pháp CA (canonical discriminant) thành phần acid béo (a) Hình trái: RAPD fingerprinting với mồi OPV-20 (5 ′-CAG CAT GGT C-3 ) của cá voi (minke whales) từ phía tây bắc . samples (6 5°C; 30 min); B) sterilized samples (1 20°C; 20 min). Lines are cow 100% (lane 1 ), cow 10% (lane 2 ), cow 5% (lane 3 ), cow 1% (lane 4 ), cow 0.5% (lane 5 ), cow 0.1% (lane 6 ), and sheep. 12SBT-REV. A) Pasteurized samples (6 5°C; 30 min); B) sterilized samples (1 20°C; 20 min). Lines are cow 100% (lane 1 ), cow 10% (lane 2 ), cow 5% (lane 3 ), cow 1% (lane 4 ), cow 0.5% (lane 5 ), cow 0.1% (lane. cow 100% (lane 1 ), cow 10% (lane 2 ), cow 5% (lane 3 ), cow 1% (lane 4 ), cow 0.5% (lane 5 ), cow 0.1% (lane 6 ), and sheep 100% (lane 7). NC = negative control; M = molecular weight marker, 1 kb plus